הפרוטוקול החדש שלנו למעשה מאפשר לנו לדמיין מבנים תאיים תלת-מימדיים באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת של קרני רנטגן. ואנחנו עושים את זה על ידי הכתמת רקמה עם אאוסין ובדרך זו להפוך את הציטופלסמה גלוי. מלבד יישומים רפואיים ומחקרים, אנו גם חושבים שניתן ליישם את השיטה שלנו בביולוגיה כמו, למשל, מחקר זואולוגיה או ביולוגיה התפתחותית.
הטכניקה פשוטה יחסית, מהירה מאוד, ומתאימה גם לדגימות רקמה גדולות יותר. אנו חושבים כי הגישה שלנו בשילוב עם טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו רנטגן ניתן לשלב את זרימת העבודה הקלינית ולאחר מכן למעשה לעזור פתולוגים לקבל החלטות טובות יותר. התחל על ידי קיבוע דגימות רקמה רכה.
מלא צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר עם פתרון קיבוע המכיל 9.5 מיליליטר של 4% פורמלדהיד ו 0.5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית. מוסיפים את דגימת הרקמה הרכה לצינור הצנטריפוגה ומקררים אותו למשך 24 עד 72 שעות. לאחר הקירור לשטוף את דגימת הרקמה הרכה עם פתרון DPBS במשך שעה אחת.
ואז להכתים את המדגם על ידי הצבת אותו בשני מיליליטר של פתרון כתמים Eosin Y ולהדגיר אותו על צלחת טלטול אופקי במשך 24 שעות. ביום שלמחר בזהירות לקחת את דגימת רקמה רכה מתוך מיכל מדגם ולהסיר סוכן כתמים עודף עם נייר רקמת תאית. מניחים אותו במיכל חרוט מעל שלב אדי אתנול לאחסון ושימוש נוסף.
הכינו מחזיק דגימה מתאים כדי להרכיב את דגימת הרקמה הרכה בהתאם לכיווני כתב היד ולהבטיח התאמה הדוקה כדי למנוע מהדגימה לנוע במהלך מדידות הרנטגן CT. לאחר דבק התקשה מחזיק המדגם מוכן לשימוש, להעביר את הכליה העכבר לתוך צינור צנטריפוגה שלם אשר מחזיק כמה טיפות של 70% אתנול בתחתית. מקם את הדגימה המותקנת בסורק הרנטגן CT.
לאחר יישור זהיר של הדגימה, בחר פרמטרי רכישה לקבלת איכות התמונה הטובה ביותר. עבור נתוני המיקרו CT המוצגים, רכוש את הסריקה במתח שיא של 50 קילו-וולט וזרם של 3.5 וואט באמצעות 1601 תחזיות המחולקות באופן שווה מעל 360 מעלות. לאחר מכן השתמשו נתוני מיקרו CT מסריקת הסקירה כדי לבחור את אזור העניין עבור סריקת CT ברזולוציה גבוהה.
הכן כמויות של עניין של דגימת הרקמה הרכה על ידי חיתוך אותו לחתיכות קטנות מאוד של אורך קצה כ 0.5 מילימטר באמצעות אזמל מיקרוסקופ סטריאו. אם משתמשים בכליית עכבר, חותכים אותה לשני חצאים לאורך הציר הארוך ביותר. קח חצי אחד והכן אזורים אנטומיים שונים כגון קליפת המוח הכליית ו medulla הכליה.
מעבירים את החתיכות הקטנות לצלחת פטרי חדשה להתייבשות. לייבש את הדגימות באמצעות סדרה של פתרונות אתנול על פי הוראות כתב היד, ביצוע כל צעד התייבשות במשך שעה אחת. מעבירים את הדגימות המיובדות לתוך הקפסולה המיקרופורית וסגרו אותה.
שמור את הדגימות במגע עם 100%אתנול בכל עת. ואז נקודה קריטית לייבש את חתיכות רקמה קטנות. לאחר דגימות הרקמה מוכנים, לשמור אותם בצלחת פטרי חדשה המאוחסנת ב desiccator לפני שימוש נוסף.
הר את חתיכות הרקמה למחזיק מדגם מתאים המבטיח התאמה הדוקה. עבור כליות עכבר superglue את החלקים למחזיק מדגם באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. לאחר יישור זהיר של המדגם, בחר פרמטרי רכישה לקבלת איכות ההדמיה הטובה ביותר.
עבור נתוני הננו-CT המוצגים, רכוש תחזיות במתח שיא של 60 קילו-וולט עם 1599 תחזיות המחולקות באופן שווה מעל 360 מעלות וגודל ווקסל של כ-400 ננומטר. פרוטוקול זה שימש להדמיה תלת מימדית של מבני רקמות מיקרוסקופיים של כליית עכבר. מדידות מיקרו CT ברזולוציה נמוכה אפשרו סקירה כללית של האיבר כולו ועזרו לזהות נפחי עניין למדידות ברזולוציה גבוהה.
אותה כליית עכבר שימשה להשגת נתוני מיקרו CT ברזולוציה גבוהה. תצוגה מפורטת יותר של המבנים האנטומיים כגון קליפת המוח, medulla החיצוני, ו medulla הפנימי בין היתר מושגת. נפח של עיבוד עניין מראה את אזור medulla וקטע וירטואלי דרך כלי השיט.
הננו-CT שימש כדי לקבל תצוגה מפורטת של דגימת הכליה ברמה התאית. פיסת רקמה קטנה המתקבלת מכל כליית העכבר שימשה לדימוי הגפיים העולות העבות של הלולאה של הנלה בגודל ווקסל של כ -400 ננומטר. מחקר השוואתי בוצע כדי להבטיח כי ננו CT תואם באופן מלא עם היסטופתולוגיה.
גישת ההדמיה הרב-מודאלית אישרה את התוצאות שהתקבלו בשתי השיטות. במהלך שלב הדגירה חיוני שהדגימה מוקפת לחלוטין בפתרון הכתמים. כמו כן, בעת ביצוע הדמיית רנטגן CT, העובדה החשובה ביותר היא להבטיח יציבות מדגם במהלך רכישת נתונים.
ניתן לנתח עוד יותר את דגימות הרקמה הרכה שנותחו עם הפרוטוקול שלנו באמצעות טכניקה היסטולוגית סטנדרטית כגון המטוקסילין נגדי. פרוטוקול הכתמים שלנו יתרם באופן משמעותי לקידום היסטולוגיה של צילומי רנטגן תלת מימדי. מחקר רפואי ייהנה במיוחד מטכניקת הדמיה תלת-ממדית לא הרסנית זו.
