Модифицированная мышиная модель внутричерепной аневризмы на основе гемодинамических изменений и артериальной гипертензии

Внутричерепная аневризма (ИА) была построена у мышей с использованием факторов риска гипертензии и гемодинамических изменений. Гемодинамические изменения индуцировались лигированием ветвей сонной артерии, в то время как гипертензия достигалась лигированием задних ветвей почечной артерии. Образование ИА выявляли с помощью магнитно-резонансной ангиографии, стереомикроскопии и патологоанатомического анализа.

Внутричерепная аневризма (ИА) представляет значительный риск для здоровья из-за заболеваемости и смертности, связанных с разрывом аневризмы. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе развития IA, остаются неясными, и требуется подходящая мышиная модель. Мышиная модель ИА была создана путем лигирования крыло-нёбной артерии (ППА) для индуцирования аддитивных гемодинамических изменений в сочетании с индукцией гипертензии. У самцов мышей C57BL/6 сосуды, включая правую PPA, наружную сонную артерию (ECA), затылочную артерию (OcA) и левую контралатеральную общую сонную артерию (CCA), лигировали для индуцирования гемодинамических изменений. Через неделю двусторонние задние ветви почечной артерии (пРА) были перевязаны, и была введена диета с 8% солью, чтобы вызвать гипертензию. Магнитно-резонансная ангиография (МРА), стереомикроскопия и иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание были выполнены для оценки морфологических и патологических изменений ИА через три месяца после индукции. В экспериментальной группе четыре мыши умерли после первоначальной индукции. IA в разных местах была обнаружена у пяти из одиннадцати оставшихся мышей. Как микроскопическое, так и MRA исследование подтвердили образование IA. Патологоанатомический анализ и анализ ИГХ выявили нарушение внутренней эластической пластинки, разъединение коллагеновых волокон и инфильтрацию CD86-положительных макрофагов M1, что согласуется с теми, которые наблюдаются при ИА человека. Эта мышиная модель IA воспроизводит патологические изменения, наблюдаемые в образцах человека, и может служить ценным инструментом для исследования молекулярных механизмов образования и прогрессирования IA.

Распространенность внутричерепной аневризмы (ИА) оценивается в 3,2% от общей популяции¹. ИА представляет значительный риск для здоровья из-за связанной с ним высокой заболеваемости и смертности. ИА является сложным и многомерным патологическим состоянием, на которое влияют гемодинамические изменения, воспаление и ремоделирование сосудов ^2,3. Гемодинамические изменения и гипертензия участвуют в формировании и прогрессировании аневризм ^4,5. IA часто возникает при бифуркациях головного мозга с повышенным гемодинамическим напряжением сдвига⁶, а бифуркации с узкими углами определены как факторы риска развития IA у человека⁷. Несмотря на достижения в области эндоваскулярного лечения и хирургических стратегий, субарахноидальное кровоизлияние, вызванное разрывом IA, остается катастрофическим. Таким образом, изучение фармакологических методов лечения является перспективным подходом к предотвращению разрыва аневризмы⁸. Однако механизмы, лежащие в основе патологического формирования и прогрессирования ИА, остаются неясными. Разработка подходящей мышиной модели формирования и прогрессирования ИА, основанной на факторах риска человека, имеет решающее значение для раскрытия основных механизмов и определения потенциальных терапевтических мишеней. Данное исследование направлено на построение модели формирования IA без разрыва у мышей, имитирующих характеристики IA человека.

Виллизиева круг (CW) соединяет и сообщает правую внутреннюю сонную артерию (ICA), левую ICA, а также двусторонние вертебробазилярные артерии. ХО служит компенсаторным механизмом в случаях окклюзии или стеноза ВСА или позвоночной артерии⁹. Крыловидная артерия (ППА) является ветвью ВСА, которая снабжает кровью внешнюю часть мозга¹⁰. Основываясь на компенсаторной функции CW, окклюзия PPA увеличивает кровоток в ICA. Комбинированное лигирование левой общей сонной артерии (ОСА), правой наружной сонной артерии (ОСА) и затылочной артерии (ОкА) приводит к увеличению кровотока в ХО, особенно при суженных углах, что приводит к гемодинамическим изменениям. В этой модели кровоснабжение мозга поддерживается вертебробазилярной артерией и правой ВСА. Лигирование ППА не способствовало смертности у мышей¹¹.

Для индуцирования модели IA, основанной на инъекции эластазы, артериальную гипертензию индуцировали высвобождением ангиотензина-II (Ang-II) через насос Alzet или соль дезоксикортикостерона ацетата (DOCA)^12,13. Высокую стоимость Alzet и DOCA следует учитывать в экспериментах с участием большого количества животных. Достигнутые уровни артериальной гипертензии достоверно не различались между лигированием задней и нижней ветвей двусторонних почечных артерий или только задних ветвей двусторонних почечных артерий. Однако первый подход приводил к большей почечной дисфункции¹⁴. Таким образом, лигирование двусторонних задних почечных артерий (пРА) считается рациональным методом для большинства исследователей.

Эластаза вводилась в спинномозговую жидкость в правой базальной цистерне путем однократной стереотаксической инъекции¹². Модель IA на основе инъекции эластазы вызвала разрыв IA на 60%-80% через три недели после инъекции^15,16, что слишком мало для изучения формирования и развития IA. Кроме того, нет никаких доказательств того, что у человека возникал повышенный уровень эластазы во время формирования IA. Кроме того, стереотаксическая инъекция в правый резервуар связана с высокой смертностью и инвалидностью у мышей, что создает значительные проблемы для новичков.

В этом исследовании мышиная модель ИА без разрыва в течение трех месяцев была построена на основе факторов риска человека. Эта модель устраняет высокую стоимость, связанную с DOCA и Alzet. Более того, она может быть выполнена с помощью только стереомикроскопа и может быть легко освоена новичками.

Все операционные процедуры на мышах соответствовали критериям Комитета по этической экспертизе и были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Шанхайского университета Цзяотун. Мышей-самцов C57BL/6 (в возрасте 8 недель, 20-25 г) содержали при температуре 22 °C с циклом свет/темнота 12 ч/12 ч. Рабочий процесс показан на рисунке 1А. Короче говоря, у животных, находящихся под наркозом, левая общая сонная артерия (ОСА), правая наружная сонная артерия (ХКА), затылочная артерия (OcA) и крыло-небная артерия (ППА) были перевязаны для индуцирования гемодинамических изменений. Впоследствии гипертензию индуцировали путем перевязки двусторонних почечных артерий (bRA) через неделю после начала гемодинамических изменений, и животных кормили диетой, содержащей 8% соли. Гемодинамические изменения и образование IA изображены на рисунке 1В. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Установление МАУ у мышей на основе гемодинамических изменений и гипертонической болезни

Примечание: Мышей голодали в течение 12 ч перед операцией. Хирургические инструменты стерилизовали путем замачивания их в 70% спирте не менее чем на 30 минут.

1. Введение анестезии (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) с использованием аппарата для анестезии мелких животных с ингаляцией 2% изофлурана в смеси_О2 (1 л/мин) на нагреваемой прокладке при температуре 37 °С.
2. Лигеть левый CCA
   1. Сделайте линейный разрез на 1 см по средней линии шеи. Рассеките подкожную клетчатку и платизму, чтобы обнажить трахею.
   2. Оттяните яремную вену в сторону и расположите влагалище сонной артерии вдоль трахеи (рис. 2A i,ii). Отделите левый ОСА от блуждающего нерва. Перевязать левый CCA шелковым швом 6-0 (Рисунок 2A iii, iv).
3. Легирование правильных ECA и OcA
   1. Обнажите анатомическое строение CCA, ICA, ECA, OcA, блуждающего нерва и подъязычного нерва с правой стороны. Перевязать правую ЭКА шелковым швом 6-0 (Рисунок 2A iii, iv).
   2. Изолируйте OcA и разделите его с помощью 8-0 шелковый шов (Рисунок 2A v - viii). Отсоедините OcA с помощью двух прямых микрощипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: OcA, возникающая проксимально от ECA, находится ниже подъязычного нерва (Рисунок 2A, v - viii). Препарирование OcA помогает эффективно выявить анатомию PPA.
4. Лигировать правильный PPA
   1. Изолируйте подъязычный нерв от ВСА. Поместите хирургическую вату между подъязычным нервом и ВСА, чтобы защитить нерв от травм, связанных с процедурой.
   2. Рассеките периваскулярную ткань вокруг ППА с помощью микрощипцов. Зажмите PPA и временно слегка потяните его вверх. Ставка 8-0 шелковый шов между PPA и ICA для лигатирования PPA (рис. 2A ix,x).
   3. Перевязывайте ППА и поддерживайте достаточное расстояние между местом лигирования и началом ППА для обеспечения кровотока в Виллисовом круге (Рисунок 2А х).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основной проблемой на этом этапе является лигирование ППА в чрезвычайно узком операционном пространстве без повреждения периферических нервов и сосудистых структур. Избегайте сдавливания трахеи во время воздействия ППА.
5. Завершите операцию
   1. Простерилизовать операционное поле повидон-йодом и зашить рану. Наблюдайте за мышами до тех пор, пока они не оправятся от анестезии.
6. Вызвать гипертонию
   1. Сделайте разрез по средней линии длиной 2 см на^12-м уровне позвонков на спине. Разрежьте спинные мышцы, чтобы обнажить почку. Зажмите жировую ткань вокруг почки с помощью щипцов и зафиксируйте почку внутри мышечного разреза (рисунок 2B i,ii).
   2. Изолируйте жировую ткань вокруг ножки почки. Определите рРА в тесном контакте с почечной веной (рис. 2B iii, iv). Зажмите pRA и подтяните его вверх с помощью прямых микрощипцов. Рассеките фасцию между пРА и почечной веной с помощью других микрощипцов (рис. 2B v,vi).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы предотвратить повреждение почечной вены, которое может привести к катастрофическому кровотечению.
   3. Лигать pRA с помощью шелкового шовного материала 6-0 (Рисунок 2B vii, viii). Сразу после лигирования наблюдайте образование ишемических очагов в верхней части почки (рисунок 2В ix,x). Зашивайте разрезы мышц и кожи.

2. Исследование ИА с помощью МРА и стереомикроскопа

1. Проведите времяпролетную магнитно-резонансную ангиографию (МРА) магнитно-резонансной томографии (МРА) 7,0 Тл через три месяца после индукции аневризмы для оценки формирования IA.
   1. Усыпляйте мышей путем обескровливания и вывиха шейки матки после анестезии изофлураном (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Обнаружение IA под стереомикроскопом, как сообщалось ранее¹⁷.
   2. Введите в образцы охлажденный PBS, затем 4% параформальдегид, а затем микрофил для визуализации сосудов и аневризм.
   3. Определите аневризму как выпячивающуюся наружу в 1,5 раза больше, чем исходная артерия, как наблюдают два независимых нейрохирурга ^8,18.

3. Гистологические и иммуногистохимические анализы

1. Изолируйте круги Виллиса под микроскопом. Зафиксируйте образцы с 4% параформальдегидом при температуре 4 °C в течение 24 ч¹⁹.
2. Обрабатывайте образцы в парафиновые и замороженные срезы для гистологического и иммунофлуоресцентного окрашивания. Окрашивание парафиновых срезов пятнами EVG и Masson в соответствии с инструкциями производителя¹⁹.
3. Инкубируйте парафиновые срезы с помощью блокирующего раствора, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание.
4. Инкубируйте секции с первичными антителами к CD86 в течение ночи при 4 °C. После инкубации со вторичным антителом разработайте коричневый цвет, реагируя на участки с DAB²⁰.
5. Выполнить противоокрашивание гематоксилином и смонтировать секции водным монтажным раствором²⁰.

Скорость формирования НМА
В опытной группе (n = 15) 2 мыши умерли в течение первой недели после первоначальной процедуры по неизвестным причинам. Одна мышь умерла от инфекции в ране спины на третий день после второй процедуры, а другая мышь умерла на 38-й день по неизвестным причинам, при этом аневризм не было обнаружено. В контрольной группе (n = 5) все 5 мышей дожили до жертвоприношения. Среди выживших мышей опытной группы (n = 11) систолическое артериальное давление через три месяца после индукции было достоверно выше, чем до индукции (90 ± 1,39 мм рт. ст. против 126,63 ± 1,83 мм рт. ст.; P < 0,0001). В контрольной группе (n = 5) артериальное давление оставалось стабильным до индукции и при жертве (88 ± 2,34 мм рт. ст. против 91,8 ± 1,2 мм рт. ст.; P > 0,05).

Оценка и выводы ИА
В экспериментальной группе аневризмы в разных локализациях были обнаружены у 5 из 11 выживших мышей с помощью МРА и световой микроскопии. Две аневризмы были локализованы в передней мозговой артерии и обонятельной артерии, две — в передней коммуникативной артерии и одна — в задней мозговой артерии (рис. 3). Кроме того, у 2 из 11 мышей наблюдалась извитость передней и средней мозговых артерий. Ни одна из аневризм не разорвалась в течение трех месяцев после индукции. Никаких изменений аневризмы не наблюдалось у 4 из 11 мышей в экспериментальной группе или у любой из 5 мышей в контрольной группе.

Гистологическое и иммунофлюоресцентное исследование
При аневризмах головного мозга человека сосудистая стенка характеризуется нарушением эластической пластинки, децеллюляризацией среды, разъединением коллагеновых волокон и инфильтрацией макрофагов М1²¹. По сравнению с контрольными кровеносными сосудами, окрашивание EVG-Верхуффа выявило значительное нарушение внутреннего эластического слоя в ткани IA (рис. 4A). Окрашивание Массона показало значительное разъединение коллагеновых волокон в стенках IA (рис. 4B). Иммуногистохимический анализ показал значительную инфильтрацию CD86-положительных макрофагов в стенке аневризмы (рис. 4C, D).

Рисунок 1: Диаграмма индукции модели аневризмы мыши. (A) Схематическое изображение перевязки левой общей сонной артерии, правой наружной сонной артерии, крыловидной артерии и двусторонних задних ветвей почечной артерии, наряду с 8% диетой NaCl. (Б) Гемодинамические изменения, приводящие к изменениям кровотока в виллизиловом круге и образованию аневризмы. Сокращения: ACA, передняя мозговая артерия; ACoA, передняя соединительная артерия; CCA — общая сонная артерия; ECA, наружная сонная артерия; IA, внутричерепная аневризма; MCA, средняя мозговая артерия; МРА, магнитно-резонансная ангиография; ОА, обонятельная артерия; OcA, затылочная артерия; ППА, крыловидная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Анатомические и схематические схемы перевязки артерий. (А) Обнажение и перевязка артерий на шее. i-iv, перевязка левой ОЦА; v-vi лигирование правой ЭХА; vii-viii, перевязка правой OcA; ix-x, перевязка правой ППА. (B) Обнажение и перевязка задних ветвей почечной артерии (pRA). i-iv, облучение правой pRA; v-vi, разделение pRA; vii-viii, лигирование pRA; IX-X, возвращение почек в исходное положение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Морфологические изменения внутричерепных аневризм. (А) Нормальная бифуркация обонятельной артерии и передней мозговой артерии в контрольной группе. (Б) Типичные аневризмальные изменения в местах бифуркации обонятельной артерии и передней мозговой артерии, наблюдаемые на МРА и под микроскопом (красная стрелка). Увеличение: 6x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Патологический анализ внутричерепных аневризм. (А) Окрашивание ЭВГ: Эластичный слой в нормальной группе не поврежден и гладкий, в то время как эластичный слой в группе аневризмы нарушен. (Б) Окрашивание по Массону: Коллагеновые волокна остаются неповрежденными в нормальной группе, в то время как большое количество коллагеновых волокон прерывается в группе с аневризмой. (C) Окрашивание ИГХ для CD86: CD86-положительные клетки отсутствуют в нормальной группе, но в значительной степени присутствуют в стенке аневризмы. Масштабные линейки = 200 μм (для изображений без увеличения); 50 μм (для увеличенных изображений), ***P < 0,001. Сокращение: IA, внутричерепная аневризма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В данном исследовании представлен модифицированный подход к построению мышиной модели ИА путем лигирования ППА для индуцирования аддитивных гемодинамических изменений в сочетании с артериальной гипертензией. Визуализация МРТ и микроскопический анализ показали значительные аневризматические изменения в виллизматическом круге. Патологические изменения, наблюдаемые в этой модели, согласуются с теми, которые были обнаружены в образцах человека. Эта мышиная модель может служить ценным инструментом для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования и развития IA.

IA индуцировали у мышей путем лигирования левого CCA, ECA, OcA, PPA и двусторонних задних почечных артерий (pRA), а также диеты с высоким содержанием соли. Cai et al. использовали аналогичную процедуру для создания модели аневризмы крысы с нормальным артериальным давлением и выявления аневризм головного мозга и расширения передних мозговых артерий²². Miyamoto et al. сообщили, что по сравнению с лигированием только левой КЦА, дополнительное лигирование правой ППА и правой ЭХА значительно увеличивало образование ИА у крыс. Лигирование ЭКА и ППА может усиливать гемодинамические изменения за счет увеличения объема^{кровотока 18}. У людей окклюзия сонной артерии связана с образованием внутричерепных аневризм²³. Таким образом, эта модифицированная мышиная модель ИА может оказаться полезной для изучения формирования и развития ИА.

Выбор видов животных в научных исследованиях имеет решающее значение и служит определенным исследовательским целям. Модели крыс, которые использовались в течение десятилетий, демонстрируют специфические патологические особенности, такие как фрагментация внутренней эластической пластинки и истончение клеточного слоя гладкой мускулатуры. Модели на крысах используются в основном для исследования патогенеза аневризм^24,25. Модели кроликов, с другой стороны, особенно подходят для доклинических исследований, связанных с эндоваскулярным лечением 26,27,28. По сравнению с этими моделями, мыши предпочтительнее для генетического анализа из-за их более коротких жизненных циклов и трансгенной манипулируемости. Кроме того, мыши демонстрируют значительное сходство в экспрессии и функции ортологичных генов с таковыми у человека²⁹. Таким образом, мышиные модели представляют собой оптимальный выбор для лабораторных исследований.

В предыдущих исследованиях внутричерепные аневризмы (ИА) индуцировались у мышей с использованием эластазы для разрушения эластической пластинки³⁰. Несмотря на то, что аневризмы на основе эластазы демонстрируют морфологические и гистологические изменения, аналогичные тем, которые наблюдаются у человека 31,32,33, они связаны с высокой частотой разрывов, что делает их полезными для изучения разрыва IA. Тем не менее, слабость сосудов, вызванная эластановой, не точно отражает естественный процесс образования IA. Данная модель, которая воспроизводит патологические характеристики ИА человека, была разработана на основе двух независимых факторов риска формирования ИА и не привела к разрыву в течение трехмесячного периода наблюдения.

У этого исследования есть несколько ограничений. В то время как мышиная модель была индуцирована за счет аддитивных гемодинамических изменений и гипертензии, частота аневризм сосудов головного мозга в небольшой выборке не определялась, а также не сравнивалась с частотой аневризм, вызванных исключительно лигированием общей сонной артерии или двусторонним лигированием задних почечных артерий^. Окно наблюдения было ограничено тремя месяцами, что частично моделирует естественный процесс формирования IA, но не исключает возможности разрыва. Воспроизведение сложной и реалистичной гемодинамики человека остается сложной задачей. Кроме того, гемодинамические изменения, вызванные дополнительным лигированием ППА, не оценивались, а изменения кровотока не были точно измерены. Тем не менее, ИА у мышей были обнаружены с помощью МРА, и наблюдаемые патологические изменения соответствовали тем, которые были обнаружены у человеческих ИА. Эта мышиная модель IA является ценным инструментом для исследования процесса формирования IA.

Рукопись прочитана и одобрена всеми названными авторами, при этом нет других лиц, удовлетворяющих критериям авторства, но не указанных в списке. У авторов нет конфликтов интересов, связанных с рукописью, и не было существенной финансовой поддержки этой работы, которая могла бы повлиять на ее результат. Спонсоры не участвовали в сборе данных, анализе данных или написании статей. Рукопись ранее не публиковалась в Интернете или в печатных изданиях, в том числе в журналах, на веб-сайтах или в блогах.

Это исследование было поддержано Национальным институтом трансляционной медицины (Shanghai TMSK-2021-147), Шанхайским исследовательским проектом больницы Жэньцзи (RJTJ-QT-007) и Китайским фондом постдокторантуры (номер сертификата: 2024M760658).