Un modello murino modificato di aneurisma intracranico basato sul cambiamento emodinamico e sull'ipertensione

L'aneurisma intracranico (IA) è stato costruito nei topi utilizzando i fattori di rischio di ipertensione e cambiamenti emodinamici. I cambiamenti emodinamici sono stati indotti legando i rami dell'arteria carotide, mentre l'ipertensione è stata ottenuta legando i rami posteriori dell'arteria renale. La formazione di IA è stata rilevata attraverso l'angiografia a risonanza magnetica, la stereomicroscopia e l'analisi patologica.

L'aneurisma intracranico (IA) rappresenta un rischio significativo per la salute a causa della morbilità e della mortalità associate alla rottura dell'aneurisma. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo dell'IA rimangono poco chiari ed è necessario un modello murino adatto. Un modello murino di IA è stato stabilito legando l'arteria pterigopalatina (PPA) per indurre cambiamenti emodinamici additivi, combinati con l'induzione dell'ipertensione. Nei topi maschi C57BL/6, i vasi, tra cui la PPA destra, l'arteria carotide esterna (ECA), l'arteria occipitale (OcA) e l'arteria carotide comune controlaterale sinistra (CCA), sono stati legati per indurre cambiamenti emodinamici. Una settimana dopo, i rami posteriori bilaterali dell'arteria renale (pRA) sono stati legati ed è stata introdotta una dieta a base di sale all'8% per indurre l'ipertensione. L'angiografia a risonanza magnetica (MRA), la stereomicroscopia e la colorazione immunoistochimica (IHC) sono state eseguite per valutare i cambiamenti morfologici e patologici nell'IA tre mesi dopo l'induzione. Nel gruppo sperimentale, quattro topi sono morti dopo l'induzione iniziale. L'IA in diverse località è stata rilevata in cinque degli undici topi rimanenti. Sia l'esame microscopico che l'esame MRA hanno confermato la formazione di IA. Le analisi patologiche e IHC hanno rivelato l'interruzione della lamina elastica interna, la disconnessione delle fibre di collagene e l'infiltrazione dei macrofagi M1 CD86-positivi, risultati coerenti con quelli osservati nell'IA umana. Questo modello murino di IA replica i cambiamenti patologici osservati nei campioni umani e può servire come strumento prezioso per studiare i meccanismi molecolari della formazione e della progressione dell'IA.

La prevalenza dell'aneurisma intracranico (IA) è stimata al 3,2% della popolazione generale¹. L'IA rappresenta un rischio significativo per la salute a causa dell'elevata morbilità e mortalità associate. L'IA è una condizione patologica complessa e multidimensionale influenzata da alterazioni emodinamiche, infiammazione e rimodellamento vascolare ^2,3. I cambiamenti emodinamici e l'ipertensione sono implicati nella formazione e nella progressione degli aneurismi ^4,5. L'IA si verifica frequentemente nelle biforcazioni cerebrali con elevato sforzo di taglio emodinamico⁶ e le biforcazioni con angoli stretti sono identificate come fattori di rischio per lo sviluppo dell'IA nell'uomo⁷. Nonostante i progressi nei trattamenti endovascolari e nelle strategie chirurgiche, l'emorragia subaracnoidea causata dalla rottura dell'IA rimane catastrofica. Pertanto, l'esplorazione di trattamenti farmacologici è un approccio promettente per prevenire la rottura dell'aneurisma⁸. Tuttavia, i meccanismi alla base della formazione patologica e della progressione dell'IA rimangono poco chiari. Lo sviluppo di un modello murino adatto per la formazione e la progressione dell'IA, basato sui fattori di rischio nell'uomo, è fondamentale per scoprire i meccanismi sottostanti e identificare potenziali bersagli terapeutici. Questo studio mira a costruire un modello di formazione di IA senza rottura in topi che imitano le caratteristiche dell'IA umana.

Il circolo di Willis (CW) collega e comunica l'arteria carotide interna destra (ICA), l'ICA sinistra e le arterie vertebrobasilari bilaterali. La CW funge da meccanismo di compensazione in caso di occlusione o stenosi dell'ICA o dell'arteria vertebrale⁹. L'arteria pterigopalatina (PPA) è una branca dell'ICA che fornisce sangue alla parte esterna del cervello¹⁰. Sulla base della funzione compensatoria della CW, l'occlusione PPA aumenta il flusso sanguigno nell'ICA. La combinazione della legatura dell'arteria carotide comune sinistra (CCA), dell'arteria carotide esterna destra (ECA) e dell'arteria occipitale (OcA) provoca un aumento del flusso sanguigno nella CW, in particolare ad angoli ristretti, portando a cambiamenti emodinamici. In questo modello, l'afflusso di sangue al cervello è supportato dall'arteria vertebrobasilare e dall'ICA destro. La legatura PPA non ha contribuito alla mortalità nei topi¹¹.

Per indurre un modello di IA basato sull'iniezione di elastasi, l'ipertensione è stata indotta dal rilascio di angiotensina-II (Ang-II) tramite una pompa Alzet o un sale^12,13 di desossicorticosterone acetato (DOCA). L'alto costo di Alzet e DOCA dovrebbe essere considerato negli esperimenti che coinvolgono un gran numero di animali. I livelli di ipertensione raggiunti non erano significativamente diversi tra la legatura dei rami posteriori e inferiori delle arterie renali bilaterali o solo i rami posteriori delle arterie renali bilaterali. Tuttavia, il primo approccio ha portato a una maggiore disfunzione renale¹⁴. Pertanto, la legatura delle arterie renali posteriori bilaterali (pRA) è considerata un metodo razionale per la maggior parte dei ricercatori.

L'elastasi è stata iniettata nel liquido cerebrospinale nella cisterna basale destra tramite una singola iniezione stereotassica¹². Il modello IA basato sull'iniezione di elastasi ha causato una rottura dell'IA del 60%-80% tre settimane dopo l'iniezione^15,16, che è troppo breve per studiare la formazione e lo sviluppo dell'IA. Inoltre, non ci sono prove che suggeriscano livelli elevati di elastasi nell'uomo durante la formazione di IA. Inoltre, l'iniezione stereotassica nella cisterna destra è associata a un'elevata mortalità e disabilità nei topi, ponendo sfide significative per i principianti.

In questo studio, è stato costruito un modello murino di IA senza rottura entro tre mesi sulla base di fattori di rischio nell'uomo. Questo modello elimina l'alto costo associato a DOCA e Alzet. Inoltre, può essere eseguito utilizzando solo uno stereomicroscopio e può essere facilmente padroneggiato dai principianti.

Tutte le procedure operative nei topi hanno aderito ai criteri del Comitato di revisione etica e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Jiaotong di Shanghai. I topi maschi C57BL/6 (8 settimane di età, 20-25 g) sono stati alloggiati a una temperatura di 22 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore. Il processo operativo è illustrato nella Figura 1A. In breve, negli animali anestetizzati, l'arteria carotide comune sinistra (CCA), l'arteria carotide esterna destra (ECA), l'arteria occipitale (OcA) e l'arteria pterigopalatina (PPA) sono state legate per indurre cambiamenti emodinamici. L'ipertensione è stata successivamente indotta legando le arterie renali bilaterali (bRA) una settimana dopo l'inizio dei cambiamenti emodinamici e gli animali sono stati alimentati con una dieta contenente l'8% di sale. I cambiamenti emodinamici e la formazione di IA sono illustrati nella Figura 1B. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Determinazione dell'UIA murino basata sulle alterazioni emodinamiche e sull'ipertensione

NOTA: I topi sono stati digiunati per 12 ore prima dell'operazione. Gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati immergendoli in alcol al 70% per almeno 30 minuti.

1. Somministrare l'anestesia (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) utilizzando una macchina per anestesia per piccoli animali con inalazione di isoflurano al 2% in una miscela di O₂ (1 L/min) su un tampone riscaldato mantenuto a 37 °C.
2. Contenzioso il CCA sinistro
   1. Praticare un'incisione lineare di 1 cm lungo la linea mediana cervicale. Sezionare il tessuto sottocutaneo e il platisma per esporre la trachea.
   2. Estrarre la vena giugulare e individuare la guaina carotidea lungo la trachea (Figura 2A i,ii). Separare il CCA sinistro dal nervo vago. Legare il CCA sinistro con una sutura di seta 6-0 (Figura 2A iii,iv).
3. Contestare l'ECA e l'OcA corretti
   1. Esporre la struttura anatomica del CCA, ICA, ECA, OcA, nervo vago e nervo ipoglosso sul lato destro. Legare l'ECA destro con una sutura di seta 6-0 (Figura 2A iii,iv).
   2. Isolare l'OcA e ligarla con un 8-0 sutura di seta (Figura 2A v - viii). Scollegare l'OcA utilizzando due micro pinze diritte.
      NOTA: L'OcA, che nasce prossimalmente dall'ECA, si trova al di sotto del nervo ipoglosso (Figura 2A v - viii). La dissezione dell'OcA aiuta a esporre efficacemente l'anatomia della PPA.
4. Contesta il PPA giusto
   1. Isolare il nervo ipoglosso dall'ICA. Posizionare del cotone chirurgico tra il nervo ipoglosso e l'ICA per proteggere il nervo da lesioni correlate alla procedura.
   2. Sezionare il tessuto perivascolare attorno alla PPA utilizzando una micropinza. Clamp il PPA e tirarlo temporaneamente verso l'alto leggermente. Piazzare un 8-0 sutura di seta tra il PPA e l'ICA per legare il PPA (Figura 2A ix,x).
   3. Legare la PPA e mantenere una distanza sufficiente tra il sito di legatura e l'origine della PPA per garantire il flusso sanguigno nel cerchio di Willis (Figura 2A x).
      NOTA: La sfida principale in questa fase è legare la PPA all'interno di uno spazio operatorio estremamente ristretto senza compromettere i nervi periferici e le strutture vascolari. Evitare di comprimere la trachea durante l'esposizione alla PPA.
5. Finalizzare l'operazione
   1. Sterilizzare il campo operatorio con iodio povidone e suturare la ferita. Monitora i topi fino a quando non si riprendono dall'anestesia.
6. Indurre l'ipertensione
   1. Praticare un'incisione della linea mediana lunga 2 cm al 12^° livello vertebrale sulla schiena. Taglia i muscoli dorsali per esporre il rene. Bloccare il tessuto adiposo attorno al rene con una pinza e fissare il rene all'interno dell'incisione muscolare (Figura 2B i,ii).
   2. Isolare il tessuto adiposo attorno al peduncolo renale. Identificare il pRA a stretto contatto con la vena renale (Figura 2B iii,iv). Bloccare il pRA e tirarlo verso l'alto utilizzando una micro pinza diritta. Sezionare la fascia tra il pRA e la vena renale utilizzando un'altra micro pinza (Figura 2B v,vi).
      NOTA: Prestare attenzione per prevenire danni alla vena renale, che potrebbero portare a sanguinamento catastrofico.
   3. Legare il pRA con una sutura di seta 6-0 (Figura 2B vii,viii). Subito dopo la legatura, osservare la formazione di focolai ischemici nella parte superiore del rene (Figura 2B ix,x). Sutura il muscolo e le incisioni cutanee.

2. Esame IA tramite MRA e stereomicroscopio

1. Eseguire l'angiografia a risonanza magnetica (MRA) a tempo di volo (TOF) 7.0 T tre mesi dopo l'induzione dell'aneurisma per valutare la formazione di IA.
   1. Eutanasia dei topi tramite dissanguamento e lussazione cervicale dopo anestesia con isoflurano (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Rilevare l'IA con uno stereomicroscopio come precedentemente riportato¹⁷.
   2. Infondere i campioni con PBS raffreddato, seguito da paraformaldeide al 4%, quindi Microfil per visualizzare vasi e aneurismi.
   3. Definisci un aneurisma come un rigonfiamento verso l'esterno 1,5 volte più grande dell'arteria madre, come osservato da due neurochirurghi indipendenti ^8,18.

3. Analisi istologiche e immunoistochimiche

1. Isolare i cerchi di Willis al microscopio. Fissare i campioni con paraformaldeide al 4% a 4 °C per 24 h¹⁹.
2. Processare i campioni in sezioni di paraffina e congelate per la colorazione istologica e in immunofluorescenza. Colorare le sezioni di paraffina con coloranti EVG e Masson secondo le istruzioni del produttore¹⁹.
3. Incubare le sezioni di paraffina con una soluzione bloccante per ridurre al minimo il legame aspecifico.
4. Incubare le sezioni con anticorpi primari contro CD86 per una notte a 4 °C. Dopo l'incubazione con un anticorpo secondario, sviluppare un colore marrone facendo reagire le sezioni con DAB²⁰.
5. Eseguire la controcolorazione con ematossilina e montare le sezioni con una soluzione di montaggio acquosa²⁰.

Tasso di formazione di IA
Nel gruppo sperimentale (n = 15), 2 topi sono morti entro la prima settimana dopo la procedura iniziale per ragioni sconosciute. Un topo è morto per un'infezione nella ferita alla schiena il terzo giorno dopo la seconda procedura e un altro topo è morto il giorno 38 per ragioni sconosciute, senza che siano stati rilevati aneurismi. Nel gruppo di controllo (n = 5), tutti e 5 i topi sono sopravvissuti fino al sacrificio. Tra i topi sopravvissuti nel gruppo sperimentale (n = 11), la pressione arteriosa sistolica a tre mesi dopo l'induzione era significativamente più alta rispetto a prima dell'induzione (90 ± 1,39 mm Hg vs. 126,63 ± 1,83 mm Hg; P < 0,0001). Nel gruppo di controllo (n = 5), la pressione arteriosa è rimasta costante prima dell'induzione e al sacrificio (88 ± 2,34 mm Hg vs. 91,8 ± 1,2 mm Hg; P > 0,05).

Valutazione e risultati della valutazione d'impatto
Nel gruppo sperimentale, aneurismi in diverse posizioni sono stati rilevati in 5 degli 11 topi sopravvissuti utilizzando la risonanza magnetica e la microscopia ottica. Due aneurismi erano localizzati nelle biforcazioni anteriori dell'arteria cerebrale-olfattiva, due nell'arteria comunicante anteriore e uno nell'arteria cerebrale posteriore (Figura 3). Inoltre, 2 degli 11 topi hanno mostrato tortuosità nell'arteria cerebrale anteriore e nell'arteria cerebrale media. Nessuno degli aneurismi si è rotto entro tre mesi dall'induzione. Non sono stati osservati cambiamenti aneurismatici in 4 degli 11 topi del gruppo sperimentale o in uno dei 5 topi del gruppo di controllo.

Esame istologico e in immunofluorescenza
Negli aneurismi cerebrali umani, la parete vascolare è caratterizzata dalla rottura della lamina elastica, dalla decellularizzazione dei media, dalla disconnessione delle fibre di collagene e dall'infiltrazione dei macrofagi M1²¹. Rispetto ai vasi sanguigni di controllo, la colorazione EVG-Verhoeff ha rivelato una significativa rottura dello strato elastico interno nel tessuto IA (Figura 4A). La colorazione di Masson ha mostrato una notevole disconnessione delle fibre di collagene nelle pareti dell'IA (Figura 4B). L'analisi immunoistochimica ha indicato una significativa infiltrazione di macrofagi CD86-positivi nella parete dell'aneurisma (Figura 4C, D).

Figura 1: Diagramma dell'induzione del modello murino di aneurisma. (A) Rappresentazione schematica della legatura dell'arteria carotide comune sinistra, dell'arteria carotide esterna destra, dell'arteria pterigopalatina e dei rami posteriori bilaterali dell'arteria renale, insieme a una dieta con NaCl all'8%. (B) Cambiamenti emodinamici che portano ad alterazioni del flusso nel circolo di Willis e alla formazione di aneurismi. Abbreviazioni: ACA, arteria cerebrale anteriore; ACoA, arteria comunicante anteriore; CCA, arteria carotide comune; ECA, arteria carotide esterna; IA, aneurisma intracranico; MCA, arteria cerebrale media; MRA, angiografia a risonanza magnetica; OA, arteria olfattiva; OcA, arteria occipitale; PPA, arteria pterigopalatina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Diagrammi anatomici e schematici della legatura delle arterie. (A) Esposizione e legatura delle arterie del collo. i-iv, legatura del CCA sinistro; v-vi, legatura dell'ECA destra; vii-viii, legatura dell'OcA destro; ix-x, legatura del PPA destro. (B) Esposizione e legatura dei rami posteriori dell'arteria renale (pRA). i-iv, esposizione del pRA destro; v-vi, separazione del pRA; vii-viii, legatura del pRA; ix-x, ritorno dei reni alla loro posizione originale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Cambiamenti morfologici negli aneurismi intracranici. (A) La normale biforcazione dell'arteria olfattiva e dell'arteria cerebrale anteriore nel gruppo di controllo. (B) Tipiche alterazioni aneurismatiche alla biforcazione dell'arteria olfattiva e dell'arteria cerebrale anteriore osservate alla risonanza magnetica e al microscopio (freccia rossa). Ingrandimento: 6x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi patologica degli aneurismi intracranici. (A) Colorazione EVG: lo strato elastico nel gruppo normale è intatto e liscio, mentre lo strato elastico nel gruppo dell'aneurisma è interrotto. (B) Colorazione di Masson: le fibre di collagene sono intatte nel gruppo normale, mentre un gran numero di fibre di collagene sono interrotte nel gruppo dell'aneurisma. (C) Colorazione IHC per CD86: le cellule CD86-positive sono assenti nel gruppo normale ma sono significativamente presenti nella parete dell'aneurisma. Barre di scala = 200 μm (per immagini non ingrandite); 50 μm (per immagini ingrandite), ***P < 0,001. Abbreviazione: IA, aneurisma intracranico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo studio presenta un approccio modificato alla costruzione di un modello murino di IA attraverso la legatura della PPA per indurre cambiamenti emodinamici additivi in combinazione con l'ipertensione. L'imaging MRA e l'analisi microscopica hanno dimostrato cambiamenti significativi nell'aneurisma nel cerchio di Willis. Le alterazioni patologiche osservate in questo modello sono coerenti con quelle riscontrate nei campioni umani. Questo modello murino può servire come strumento prezioso per studiare i meccanismi molecolari alla base della formazione e dello sviluppo dell'IA.

L'IA è stata indotta nei topi legando il CCA sinistro, l'ECA, l'OcA, la PPA e le arterie renali posteriori bilaterali (pRA), insieme a una dieta ricca di sale. Cai et al. hanno impiegato una procedura simile per stabilire un modello di aneurisma di ratto con pressione sanguigna normale e hanno identificato gli aneurismi cerebrali e l'espansione delle arterie cerebrali anteriori²². Miyamoto et al. hanno riportato che, rispetto alla legatura solo del CCA sinistro, la legatura aggiuntiva del PPA destro e dell'ECA destro ha aumentato significativamente la formazione di IA nei ratti. La legatura dell'ECA e della PPA può amplificare i cambiamenti emodinamici aumentando il volume del flusso sanguigno¹⁸. Nell'uomo, l'occlusione dell'arteria carotide è stata collegata alla formazione di aneurismi intracranici²³. Pertanto, questo modello murino modificato di IA potrebbe rivelarsi utile per esplorare la formazione e lo sviluppo di IA.

La scelta delle specie animali negli studi di ricerca è fondamentale e serve a scopi di ricerca distinti. I modelli di ratto, che sono stati utilizzati per decenni, mostrano caratteristiche patologiche specifiche come la frammentazione della lamina elastica interna e l'assottigliamento dello strato di cellule muscolari lisce. I modelli di ratto sono impiegati principalmente per studiare la patogenesi degli aneurismi^24,25. I modelli di coniglio, invece, sono particolarmente adatti per studi preclinici relativi al trattamento endovascolare 26,27,28. Rispetto a questi modelli, i topi sono preferiti per le analisi genetiche a causa dei loro cicli di vita più brevi e della manipolabilità transgenica. Inoltre, i topi mostrano una somiglianza significativa nell'espressione e nella funzione dei geni ortologhi con quelli degli esseri umani²⁹. Pertanto, i modelli murini rappresentano una scelta ottimale per le indagini di laboratorio.

In studi precedenti, gli aneurismi intracranici (IA) sono stati indotti nei topi utilizzando l'elastasi per degradare la lamina elastica³⁰. Sebbene gli aneurismi a base di elastasi mostrino cambiamenti morfologici e istologici simili a quelli osservati nell'uomo 31,32,33, sono associati a un alto tasso di rottura, il che li rende vantaggiosi per lo studio della rottura dell'IA. Tuttavia, la debolezza dei vasi indotta dall'elastasi non rappresenta accuratamente il processo naturale di formazione dell'IA. L'attuale modello, che replica le caratteristiche patologiche dell'IA umana, è stato sviluppato sulla base di due fattori di rischio indipendenti per la formazione di IA e non ha provocato la rottura durante il periodo di osservazione di tre mesi.

Ci sono diverse limitazioni a questo studio. Mentre il modello murino è stato indotto attraverso cambiamenti emodinamici additivi e ipertensione, l'incidenza di aneurismi cerebrali in un campione di piccole dimensioni non è stata determinata, né è stata confrontata con l'incidenza di aneurismi indotti esclusivamente dalla legatura dell'arteria carotide comune o dalla legatura bilaterale delle arterie renali posteriori³⁴. La finestra di osservazione è stata limitata a tre mesi, il che simula parzialmente il processo naturale di formazione dell'IA ma non elimina la possibilità di rottura. Replicare l'emodinamica complessa e realistica degli esseri umani rimane una sfida. Inoltre, i cambiamenti emodinamici causati dalla legatura aggiuntiva del PPA non sono stati valutati e i cambiamenti del flusso sanguigno non sono stati misurati con precisione. Ciononostante, gli IA nei topi sono stati rilevati utilizzando l'MRA e i cambiamenti patologici osservati erano coerenti con quelli riscontrati negli IA umani. Questo modello murino di IA è uno strumento prezioso per studiare il processo di formazione dell'IA.

Il manoscritto è stato letto e approvato da tutti gli autori citati, e non ci sono altre persone che hanno soddisfatto i criteri per la paternità ma non sono elencate. Gli autori non hanno conflitti di interesse associati al manoscritto e non c'è stato alcun sostegno finanziario significativo per questo lavoro che avrebbe potuto influenzarne l'esito. I finanziatori non sono stati coinvolti nella raccolta dei dati, nell'analisi dei dati o nella stesura di documenti. Il manoscritto non è stato precedentemente pubblicato online o in formato cartaceo, comprese riviste, siti web o blog.

Questo studio è stato supportato dalla National Facility for Translational Medicine (Shanghai TMSK-2021-147), dallo Shanghai Renji Hospital Research Project (RJTJ-QT-007) e dalla China Postdoctoral Science Foundation (numero di certificato: 2024M760658).