基于血流动力学变化和高血压的改良颅内动脉瘤小鼠模型

使用高血压和血流动力学变化的危险因素在小鼠中构建颅内动脉瘤 （IA）。血流动力学变化是通过结扎颈动脉的分支诱导的，而高血压是通过结扎肾动脉的后支来实现的。通过磁共振血管造影、立体显微镜和病理分析检测 IA 的形成。

由于与动脉瘤破裂相关的发病率和死亡率，颅内动脉瘤 （IA） 构成重大健康风险。然而，IA 发展的分子机制仍不清楚，需要合适的小鼠模型。通过结扎翼腭动脉 （PPA） 诱导加性血流动力学变化，结合高血压诱导，建立 IA 小鼠模型。在 C57BL/6 雄性小鼠中，结扎血管，包括右侧 PPA、颈外动脉 （ECA）、枕动脉 （OcA） 和左侧对侧颈总动脉 （CCA），以诱导血流动力学变化。一周后，结扎双侧肾动脉后支 （pRA），并引入 8% 盐饮食以诱导高血压。进行磁共振血管造影 （MRA） 、立体显微镜和免疫组织化学 （IHC） 染色，以评估诱导后 3 个月 IA 的形态和病理变化。在实验组中，4 只小鼠在初始诱导后死亡。在剩余的 11 只小鼠中的 5 只中检测到不同位置的 IA。显微镜检查和 MRA 检查均证实了 IA 的形成。病理学和 IHC 分析显示内部弹性层破裂、胶原纤维断开和 CD86 阳性 M1 巨噬细胞浸润，结果与在人类 IA 中观察到的结果一致。这种 IA 小鼠模型复制了在人类样本中观察到的病理变化，可作为研究 IA 形成和进展的分子机制的宝贵工具。

颅内动脉瘤 （IA） 的患病率估计占总人群的 3.2%¹。IA 由于其高相关的发病率和死亡率，构成重大的健康风险。IA 是一种复杂的多维病理状况，受血流动力学变化、炎症和血管重塑的影响 ^2,3。血流动力学变化和高血压与动脉瘤的形成和进展有关 ^4,5。IA 经常发生在血流动力学剪切应力升高的大脑分叉处⁶，而窄角的分叉被认为是人类 IA 发展的危险因素⁷。尽管血管内治疗和手术策略取得了进步，但 IA 破裂引起的蛛网膜下腔出血仍然是灾难性的。因此，探索药物治疗是预防动脉瘤破裂的一种很有前途的方法⁸。然而，IA 病理形成和进展的潜在机制仍不清楚。根据人类风险因素开发适合 IA 形成和进展的小鼠模型，对于揭示潜在机制和确定潜在治疗靶点至关重要。本研究旨在构建一个模拟人类 IA 特征的小鼠无破裂的 IA 形成模型。

Willis 环 （CW） 连接并连通右颈内动脉 （ICA）、左 ICA 和双侧椎基底动脉。CW 在 ICA 或椎动脉闭塞或狭窄的情况下用作代偿机制⁹。翼腭动脉 （PPA） 是 ICA 的一个分支，为大脑外部供血¹⁰。基于 CW 的代偿功能，PPA 闭塞会增加 ICA 中的血流量。左颈总动脉 （CCA）、右颈外动脉 （ECA） 和枕动脉 （OcA） 的联合结扎导致 CW 中的血流量增加，尤其是在窄角时，导致血流动力学变化。在这个模型中，大脑的血液供应由椎基底动脉和右侧 ICA 支持。PPA 连接不会导致小鼠的死亡率¹¹。

为了诱导基于弹性蛋白酶注射的 IA 模型，通过 Alzet 泵或醋酸脱氧皮质酮 （DOCA） 盐释放血管紧张素 II （Ang-II） 诱导高血压^12,13。在涉及大量动物的实验中，应考虑 Alzet 和 DOCA 的高成本。双侧肾动脉后支和下支结扎或仅双侧肾动脉后支结扎之间达到的高血压水平无显著差异。然而，前一种方法导致更大的肾功能不全¹⁴。因此，对于大多数研究人员来说，双侧后肾动脉 （pRA） 结扎被认为是一种合理的方法。

通过单次立体定向注射将弹性蛋白酶注射到右侧基底池的脑脊液中¹²。基于弹性蛋白酶注射的 IA 模型在注射 3 周后导致 60%-80% 的 IA 破裂^15,16，这对于研究 IA 的形成和发展来说太短了。此外，没有证据表明在 IA 形成过程中人类弹性蛋白酶水平升高。此外，将立体定向注射到右侧水箱与小鼠的高死亡率和残疾有关，对新手构成重大挑战。

在本研究中，基于人类危险因素构建了 3 个月内无破裂的 IA 小鼠模型。这种模式消除了与 DOCA 和 Alzet 相关的高成本。此外，它只能使用立体显微镜进行，并且新手可以轻松掌握。

小鼠的所有作程序均符合伦理审查委员会的标准，并得到了上海交通大学机构动物护理和使用委员会的批准。将 C57BL/6 雄性小鼠 （8 周龄，20-25 g） 饲养在 22 °C 的温度下，光照/黑暗循环 12 h/12 h。作过程如图 1A 所示。简而言之，在麻醉动物中，连接左颈总动脉 （CCA）、右颈外动脉 （ECA）、枕动脉 （OcA） 和翼腭动脉 （PPA） 以诱导血流动力学变化。随后在血流动力学变化开始一周后通过结扎双侧肾动脉 （bRA） 诱发高血压，并给动物喂食含 8% 盐的饮食。血流动力学变化和 IA 形成如图 1B 所示。材料 表中提供了本研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 基于血流动力学变化和高血压的小鼠 UIA 的建立

注意：小鼠在手术前禁食 12 小时。通过将手术器械浸泡在 70% 酒精中至少 30 分钟来消毒手术器械。

1. 使用小型动物麻醉机进行麻醉（遵循机构批准的方案），在保持在 37 °C 的加热垫上吸入 O₂ （1 L/min） 的混合物中 2% 异氟醚。
2. 连扎左侧 CCA
   1. 沿颈椎中线做一个 1 cm 的线性切口。解剖皮下组织和颈阔肌以暴露气管。
   2. 拉开颈静脉并沿气管找到颈动脉鞘（图 2A i，ii）。将左侧 CCA 与迷走神经分开。用 6-0 丝缝合线连接左侧 CCA（图 2A iii，iv）。
3. 连接正确的 ECA 和 OcA
   1. 暴露右侧 CCA、ICA、ECA、OcA、迷走神经和舌下神经的解剖结构。用 6-0 丝缝合线连接右侧 ECA（图 2A iii，iv）。
   2. 分离 OcA 并用 8-0 连接丝缝合线（图 2A v - viii）。使用两个直的微型镊子断开 OcA。
      注意：从 ECA 近端产生的 OcA 位于舌下神经下方（图 2A v - viii）。剖析 OcA 有助于有效地暴露 PPA 解剖结构。
4. 连接正确的 PPA
   1. 将舌下神经与 ICA 隔离。在舌下神经和 ICA 之间放置手术棉，以保护神经免受与手术相关的损伤。
   2. 使用显微镊子解剖 PPA 周围的血管周围组织。夹住 PPA 并暂时轻轻将其向上拉。放置 8-0PPA 和 ICA 之间的丝缝合线以连接 PPA（图 2A ix，x）。
   3. 连接 PPA 并在连接部位和 PPA 起点之间保持足够的距离，以确保血液在 Willis 圈内流动（图 2A x）。
      注意：此步骤的主要挑战是在极其狭窄的作空间内连接 PPA，而不会损害周围神经和血管结构。避免在 PPA 暴露期间压迫气管。
5. 完成作
   1. 用聚维酮碘对手术区域进行消毒并缝合伤口。监测小鼠，直到它们从麻醉中恢复。
6. 诱发高血压
   1. 在背部^{第 2 椎} 体水平做一个 12 厘米长的中线切口。切开背肌，露出肾脏。使用镊子夹住肾脏周围的脂肪组织，并将肾脏固定在肌肉切口内（图 2B i，ii）。
   2. 隔离肾蒂周围的脂肪组织。识别与肾静脉密切接触的 pRA（图 2B iii，iv）。夹住 pRA 并使用直的微型镊子将其拉起。使用另一个微型镊子解剖 pRA 和肾静脉之间的筋膜（图 2B v，vi）。
      注意： 小心作，以防止肾静脉损伤，这可能导致灾难性出血。
   3. 用 6-0 丝缝合线连接 pRA（图 2B vii、viii）。结扎后，立即观察肾脏上部形成的缺血病灶（图 2B ix，x）。缝合肌肉和皮肤切口。

2. 通过 MRA 和体视显微镜 进行 IA 检查

1. 在动脉瘤诱导后 3 个月进行飞行时间 （TOF） 7.0 T 磁共振血管造影 （MRA），以评估 IA 的形成。
   1. 异氟醚麻醉后 通过 放血和宫颈脱位对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案）。如前所述，在立体显微镜下检测 IA¹⁷.
   2. 用冷却的 PBS 注入样品，然后注入 4% 多聚甲醛，然后用 Microfil 进行成像，以观察血管和动脉瘤。
   3. 将动脉瘤定义为比载瘤动脉大 1.5 倍的向外凸出，正如两位独立的神经外科医生所观察到的那样 ^8,18。

3. 组织学和免疫组化分析

1. 在显微镜下分离 Willis 的圆圈。用 4% 多聚甲醛在 4 °C 下固定标本 24 小时¹⁹。
2. 将标本加工成石蜡和冰冻切片，用于组织学和免疫荧光染色。根据制造商的说明用 EVG 和 Masson 染色剂对石蜡切片进行染色¹⁹.
3. 用封闭溶液孵育石蜡切片，以尽量减少非特异性结合。
4. 将切片与抗 CD86 的一抗在 4 °C 下孵育过夜。 与二抗孵育后，通过将切片与 DAB²⁰ 反应而形成棕色。
5. 用苏木精进行复染，并用水封片剂²⁰.

IA 形成率
在实验组 （n = 15） 中，2 只小鼠在初始手术后第一周内因未知原因死亡。一只小鼠在第二次手术后的第 3 天死于背部伤口感染，另一只小鼠在第 38 天因未知原因死亡，未检测到动脉瘤。在对照组 （n = 5） 中，所有 5 只小鼠都存活到处死。在实验组存活的小鼠 （n = 11） 中，诱导后 3 个月的收缩压显著高于诱导前（90 ± 1.39 毫米汞柱 vs. 126.63 ± 1.83 毫米汞柱; P < 0.0001）。在对照组 （n = 5） 中，诱导前和牺牲时的血压保持一致 （88 ± 2.34 mm Hg vs. 91.8 ± 1.2 mm Hg; P > 0.05）。

IA 评估和结果
在实验组中，使用 MRA 和光学显微镜在 11 只存活小鼠中的 5 只中检测到不同位置的动脉瘤。两个动脉瘤位于大脑前动脉-嗅动脉分叉处，两个位于前交通动脉，一个位于大脑后动脉（图3）。此外，11 只小鼠中有 2 只表现出大脑前动脉和大脑中动脉的迂曲。在诱导后 3 个月内没有动脉瘤破裂。实验组 11 只小鼠中有 4 只或对照组 5 只小鼠中的任何一只均未观察到动脉瘤变化。

组织学和免疫荧光检查
在人脑动脉瘤中，血管壁的特征是弹性层破裂、中层脱细胞、胶原纤维断开和 M1 巨噬细胞浸润²¹。与对照血管相比，EVG-Verhoeff 染色显示 IA 组织中内部弹性层的显着破坏（图 4A）。Masson 染色显示 IA 壁中的胶原纤维明显断开（图 4B）。免疫组织化学分析表明 CD86 阳性巨噬细胞在动脉瘤壁中显着浸润（图 4C、D）。

图 1：小鼠动脉瘤模型的诱导图。 （A） 左颈总动脉、右颈外动脉、翼腭动脉和肾动脉双侧后支结扎的示意图，以及 8% NaCl 饮食。（B） 导致 Willis 环血流改变和动脉瘤形成的血流动力学变化。缩写：ACA，大脑前动脉;ACoA，前交通动脉;CCA，颈总动脉;ECA，颈外动脉;IA，颅内动脉瘤;MCA，大脑中动脉;MRA，磁共振血管造影;OA，嗅动脉;OcA，枕动脉;PPA，翼腭动脉。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：动脉结扎的解剖图和示意图。 （A） 颈部动脉的暴露和结扎。i-iv，左侧 CCA 结扎;v-vi，右 ECA 的结扎;vii-viii，右 OcA 的结扎; ix-x，右侧 PPA 的连接。（B） 肾动脉后支 （pRA） 的暴露和结扎。i-iv，右侧 pRA 暴露;v-vi，pRA 的分离; vii-viii，pRA 的连接;ix-x，肾脏恢复到原来的位置。请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：颅内动脉瘤的形态学变化。 （A） 对照组嗅动脉和大脑前动脉的正常分叉。（B） 在 MRA 和显微镜下观察到的嗅动脉和大脑前动脉分叉处的典型动脉瘤变化（红色箭头）。放大倍率：6 倍。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 4：颅内动脉瘤的病理分析。 （A） EVG 染色：正常组的弹性层完整光滑，而动脉瘤组的弹性层被破坏。（B） 马森染色：正常组胶原纤维完整，而动脉瘤组大量胶原纤维中断。（C） CD86 的 IHC 染色：正常组不存在 CD86 阳性细胞，但明显存在于动脉瘤壁中。比例尺 = 200 μm（用于未放大的图像）;50 μm（用于放大图像），***P < 0.001。简称：IA，颅内动脉瘤。 请单击此处查看此图的较大版本。

本研究提出了一种改进的方法，通过连接 PPA 来构建 IA 小鼠模型，以诱导与高血压结合的附加血流动力学变化。MRA 成像和显微镜分析显示 Willis 环内有明显的动脉瘤变化。在该模型中观察到的病理改变与在人类样本中发现的一致。这种小鼠模型可以作为研究 IA 形成和发展的分子机制的宝贵工具。

通过连接左侧 CCA、ECA、OcA、PPA 和双侧肾后动脉 （pRA） 以及高盐饮食，在小鼠中诱导 IA。Cai 等人采用类似的程序建立了血压正常的大鼠动脉瘤模型，并确定了脑动脉瘤和大脑前动脉的扩张²²。Miyamoto 等人报道，与仅连接左侧 CCA 相比，右侧 PPA 和右侧 ECA 的额外连接显着增加了大鼠 IA 的形成。ECA 和 PPA 的连接可能通过增加血流量来放大血流动力学变化¹⁸。在人类中，颈动脉闭塞与颅内动脉瘤的形成有关²³。因此，这种修饰的 IA 小鼠模型可能有助于探索 IA 的形成和发展。

在研究中选择动物物种至关重要，并服务于不同的研究目的。已经使用了几十年的大鼠模型表现出特定的病理特征，例如内部弹性层碎裂和平滑肌细胞层变薄。大鼠模型主要用于研究动脉瘤的发病机制^24,25。另一方面，兔模型特别适用于与血管内治疗相关的临床前研究 26,27,28。与这些模型相比，小鼠因其生命周期较短且可转基因可作性而成为遗传分析的首选。此外，小鼠在直系同源基因的表达和功能方面表现出与人类的显著相似^{性 29}。因此，小鼠模型是实验室研究的最佳选择。

在以前的研究中，使用弹性蛋白酶降解弹性层³⁰ 在小鼠中诱导颅内动脉瘤 （IAs）。尽管基于弹性蛋白酶的动脉瘤表现出与在人类中观察到的相似的形态和组织学变化 31,32,33，但它们与高破裂率相关，使其有利于研究 IA 破裂。然而，弹性蛋白酶诱导的血管薄弱并不能准确代表 IA 形成的自然过程。目前的模型复制了人类 IA 的病理特征，是基于 IA 形成的两个独立危险因素开发的，并且在三个月的观察期内没有导致破裂。

这项研究有几个局限性。虽然小鼠模型是通过加性血流动力学变化和高血压诱导的，但未确定小样本量中脑动脉瘤的发生率，也未与仅由颈总动脉结扎或双侧肾后动脉结扎诱导的动脉瘤发生率进行比较³⁴。观察窗口限制为三个月，部分模拟了 IA 形成的自然过程，但并不能消除破裂的可能性。复制人类复杂而真实的血流动力学仍然是一项挑战。此外，未评估 PPA 额外结扎引起的血流动力学变化，并且未准确测量血流变化。尽管如此，使用 MRA 检测小鼠中的 IAs，观察到的病理变化与在人类 IAs 中发现的一致。这种 IA 小鼠模型是研究 IA 形成过程的宝贵工具。

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本研究得到了国家转化医学机构 （Shanghai TMSK-2021-147）、上海仁济医院研究项目 （RJTJ-QT-007） 和中国博士后科学基金 （证书编号：2024M760658） 的支持。