Анализы переноса ядер в пермеабилизированных корковых нейронах мыши

Нами разработан надежный метод селективной плазматической мембранной первичных нейронов коры головного мозга мыши для автоматизированного анализа нейронального нуклеоцитоплазматического транспорта с высоким содержанием.

Нарушение нуклеоцитоплазматического транспорта все чаще включается в патогенез нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, растет признание специфических для клеток различий в структуре комплекса ядерных пор, что вызывает необходимость адаптации методов ядерного транспорта для использования в нейронах. Пермеабилизированные клеточные анализы, в которых плазматическая мембрана селективно перфорируется дигитонином, широко используются для изучения пассивного и активного переноса ядра в иммортализованных клеточных линиях, но не применялись к культурам нейронов. В наших первоначальных попытках мы наблюдали быструю потерю целостности ядерной мембраны в первичных нейронах коры головного мозга мышей, подвергшихся воздействию даже низких концентраций дигитонина. Мы предположили, что нейронные ядерные мембраны могут быть уникально уязвимы к потере цитоплазматической поддержки. После тестирования нескольких подходов к повышению ядерной стабильности мы наблюдали оптимальную ядерную целостность после гипотонического лизиса в присутствии концентрированной подушки из бычьего сывороточного альбумина. Нейронные ядра, полученные с помощью этого подхода, надежно импортируют рекомбинантный флуоресцентный груз энергозависимым образом, облегчая анализ ядерного импорта с помощью микроскопии с высоким содержанием и автоматизированным анализом. Мы ожидаем, что этот метод будет широко применим к исследованиям пассивного и активного переноса ядра в первичных нейронах.

Нарушение нуклеоцитоплазматического транспорта, регулируемого транспорта белков и РНК между ядром и цитоплазмой, все чаще включается в патогенез нейродегенеративных заболеваний (недавно рассмотрено¹). Мы и другие сообщили о структурном и функциональном нарушении нуклеоцитоплазматического транспортного аппарата в посмертных тканях и животных моделях бокового амиотрофического склероза (БАС) и лобно-височной деменции (ЛВД), болезни Альцгеймера и болезни Хантингтона 2,3,4,5 . Механизмы и функциональные последствия нарушения нуклеоцитоплазматического транспорта при нейродегенерации, а также подходы к терапевтическому спасению являются областями продолжающихся исследований.

Ядерные поры представляют собой большие трансмембранные комплексы из ~30 нуклеопориновых белков, которые обеспечивают диффузию малых молекул через ядерную мембрану, но все больше ограничивают прохождение грузов >40 кД через барьер проницаемости богатых фенилаланином глицином (FG) нуклеопоринов в центральном канале⁶. Более крупные грузы, содержащие последовательности сигналов ядерной локализации (NLS) или сигнала ядерного экспорта (NES), подвергаются активному, опосредованному рецепторами транспорту через пору через рецепторы ядерного транспорта (импортины и экспорты) и крутому градиенту небольшой ГТФазы через ядерную мембрану (недавно рассмотренный⁷). Был разработан широкий спектр методов для анализа динамики ядерного транспорта в культивируемых клетках, включая транспортировку эндогенных грузов и меченых репортерных конструкций, которые служат субстратами для основных подклассов транспортных рецепторов. Такие подходы были легко адаптированы к нейронам ^2,5,8 и обеспечивают считывание возмущений ядерного транспорта в контексте интактной, живой клетки. Однако в анализах живых клеток возможность напрямую манипулировать реакциями переноса ядер или исследовать их в изоляции от других клеточных процессов ограничена.

При анализе проникнутых клеток плазматическая мембрана селективно перфорируется, а цитоплазма высвобождается, оставляя ядерную оболочку и комплексы ядерных пор нетронутыми и способными осуществлять либо пассивный, либо энергозависимый двунаправленный транспорт ^9,10. Такие транспортные реакции могут быть легко восстановлены путем добавления цельноклеточных лизатов, цитоплазматических фракций или очищенных рекомбинантных ядерных транспортных белков и их грузов. Таким образом, анализы проникающих клеток позволяют проводить широкий спектр биохимических или биофизических исследований, включая доставку рекомбинантных или синтетических белков и РНК, имеющих отношение к изучению нейродегенеративных заболеваний.

Учитывая сообщения о специфических для клеток различиях в структуре ядерного порового комплекса и динамике транспорта^11,12, мы стремились адаптировать анализ проникнутых клеток для использования в первичных культурах нейронов. Несмотря на широкое использование для анализа переноса ядра в иммортализированных клеточных линиях, несмотря на исчерпывающий поиск литературы, мы не нашли опубликованных сообщений о проникновении плазматических мембран нейронов, подтверждающих сохранение целостности ядерной мембраны. Большинство протоколов полагаются на дигитонин, детергент, который нацелен на уникальный холестериновый состав плазматической мембраны, чтобы перфорировать ядерную мембрану, оставляя ядерную мембрану нетронутой^. Наши первоначальные попытки использования дигитонина в первичных нейронах коры головного мозга мыши показали немедленную потерю целостности ядерной мембраны, о чем свидетельствует диффузия флуоресцентного декстрана с концентрацией 70 кДа в ядро. Мы предположили, что разрыв ядерной оболочки может быть вызван механическим возмущением из-за потери цитоплазматической поддержки, и протестировали несколько методов оптимизации, включая молекулярное скучение, стабилизацию цитоскелета и альтернативные методы лизиса клеток. В данной статье мы подробно описываем метод быстрой гипотонической пермеабилизации с использованием концентрированной подушки из бычьего сывороточного альбумина (БСА) для защиты ядер нейронов и облегчения последующего анализа импорта нейронных ядер. Недавно мы использовали этот метод для оценки механизма разрушения белка дипептидных повторов в C9orf72-ALS/FTD¹⁴ и ожидаем, что он будет широко применим к будущим исследованиям пассивного и активного ядерного транспорта в первичных нейронах.

Сначала в протоколе описывается генерация первичных культур нейронов (этап 1) и подготовка материалов для транспортного анализа (этап 2), за которым следует сам транспортный анализ (этапы 3-4) и получение и анализ изображений (этап 5). Все описанные здесь методы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (ACUC) Университета Джона Хопкинса.

1. Первичные культуры корковых нейронов мыши

1. Приготовьте исходные растворы.
   1. Буфер для вскрытия: Смешайте 50 мл 10x HBSS, 15 мл 1 М глюкозы (в dH₂O), 5 мл 1 М HEPES, 5 мл 100 мМ пирувата натрия и 5 мл 100x пенициллин-стрептомицина. Доведите объем до 500 мл с помощью dH₂O. Стерильный фильтр и храните при температуре 4 °C.
   2. Папаин: разбавьте папаин до 30 мг/мл с помощью диссекционного буфера. Хранить при температуре 4 °C.
   3. ДНКаза: Разбавить ДНКазу I до 10 мг/мл с помощью буфера для расслоения. Аликвот и хранить при температуре -20 °C.
   4. Гальваническая среда: Добавьте 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2% B-27, 1% Глутамакс и 1% пенициллин-стрептомицин в нейробазальную среду. Стерильно отфильтровать и хранить при температуре 4 °C.
   5. Питательная среда: Добавьте 2% B-27, 1% Глутамакс и 1% пенициллин-стрептомицин в нейробазальную среду. Хранить при температуре 4 °C.
2. Обмазываем пластины.
   1. Покройте 96-луночные планшеты со стеклянным дном поли-D-лизином (20 мкг/мл) и ламинином (1:100) стерильным dH₂O. Поместите планшет в инкубатор на ночь.
   2. В день вскрытия трижды промыть лунки стерильным dH₂O и заменить на Нейробазальную среду. Уравновесить в инкубаторе не менее 30 минут.
3. Препарируйте и переварите кору головного мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите вскрытие на чистом столе с использованием автоклавных инструментов для предотвращения загрязнения культуры.
   1. Усыпить беременную самку E15-16 C57BL/6J при вывихе шейки матки. Опрыскайте брюшную полость 70% этанолом. Работайте быстро. С помощью ножниц и зубчатых щипцов сделайте разрез живота по средней линии, иссеките матку, а затем перенесите эмбрионы из амниотического мешка в чашку Петри. Обезглавьте эмбрионы ножницами и соберите головы в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую буфер для вскрытия.
   2. Под препарирующим микроскопом с помощью тонких щипцов удалите череп и отшелушите мозговые оболочки. Переложите целые мозги в свежую чашку Петри диаметром 10 см с буфером для вскрытия. Отделите полусферы и удалите подкорковые структуры.
   3. Измельчите кору стерильным лезвием бритвы и переложите ее в коническую пробирку, содержащую 5 мл буфера для вскрытия. Добавьте 100 мкл папаина (запас 30 мг/мл, конечная концентрация 0,6 мг/мл) и 50 μл ДНКазы (запас 10 мг/мл, конечная концентрация 0,1 мг/мл). Варить на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пищеварение дольше 10 минут вредно для выживания клеток.
   4. Удалите надосадочную жидкость и дважды промойте 10 мл плоской среды, чтобы остановить пищеварение. Дайте салфетке осесть под действием силы тяжести между каждым мытьем.
   5. Аккуратно растирайте в фильтрующем материале объемом 2 мл с помощью пипетки P1000 до исчезновения крупных кусочков ткани (примерно в 20 раз). Добавьте еще 8 мл фильтрующего материала, чтобы довести объем примерно до 10 мл, и пропустите клеточную суспензию через клеточный фильтр размером 40 мкм.
4. Пластинчатые и поддерживающие нейроны.
   1. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин. Ресуспендируйте элементы в предварительно подогретой гальванической среде. Подсчитайте ячейки и разбавьте до 500 000 клеток/мл в гальванической среде. Аккуратно переверните для перемешивания и переложите в стерильный многоканальный резервуар.
   2. Отсадите нейробазальную среду из лунок и немедленно добавьте 100 мкл клеток в лунку с помощью многоканальной пипетки (50 000 клеток/лунку). Не допускайте пересыхания лунок с покрытием.
   3. Через 24 часа после вскрытия замените 50% среды на питательную среду. Продолжайте 50% изменение среды через день до 5-7 дня для проведения анализов in vitro .

2. Приготовление компонентов ядерного транспортного анализа

1. Транспортный буфер (TRB, адаптировано из¹⁵)
   1. Для приготовления 5x TRB растворите 100 мМ HEPES, 550 мМ KOAc, 10 мМ Mg(OAc)₂, 25 мМ NaOAc, 2,5 мМ EGTA и 1,25 М сахарозу в dH₂O. Отрегулируйте pH до 7,3 и храните буфер при 4 °C. Отрегулируйте pH до 7,3 и храните буфер при 4 °C.
   2. В день эксперимента по транспортировке подготовьте 1x TRB-BSA. Разбавьте 5x TRB в dH₂O, добавьте коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА, 2 мМ DTT и 50 мг/мл BSA.
2. Система рекуперации энергии (ERM, адаптировано из ^9,16)
   1. Чтобы приготовить 20x ERM, растворите 2 мМ литиевой соли АТФ, 2 мМ литиевой соли GTP, 80 мМ креатинфосфата и 400 Ед/мл креатинкиназы в 1x TRB.
   2. Заморозьте одноразовые аликвоты при температуре -20 °C.
3. Приготовление экстракта цельных клеток (WCE, источник транспортных рецепторов и белки цикла Ran).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целей эксперимента можно использовать цитоплазматический или экстракт цельных клеток (WCE). В данной работе препарат WCE описан как используемый в исходных анализах транспорта нейронов¹⁰.
   1. Вырастите HEK293T клеток до слияния в пятнадцати 150 мм чашках для культуры. Отделите трипсином-ЭДТА, ресуспендируйте в средах, содержащих 10% фетальной бычьей сыворотки для ингибирования трипсина, и гранулируйте клетки при дозе 200 x g в течение 5 минут. Ресуспендируйте клетки в 10 мл ледяного 1x TRB со свежедобавленным коктейлем ингибиторов протеазы.
   2. Ультразвуковая обработка на льду, 3 x 10 импульсов, с помощью ручного зонда-ультразвуковика. Осветлить центрифугированием при 14 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
   3. Измерьте концентрацию белка (цель 8-10 мг/мл) и заморозьте одноразовые аликвоты в жидком азоте перед хранением при температуре -80 °C.
4. Рекомбинантные ядерные импортные грузы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол перевозки на этапах 3-5 может быть адаптирован для любого флуоресцентного ядерного транспортного груза для изучения активного или пассивного пути транспортировки ядерного топлива, представляющего интерес. Здесь протокол описывает экспрессию и ядерный импорт Rango (Ran-регулируемый импортин β cargo), который состоит из импортина β-связывающего домена импортина α1, окруженного флуоресцентными белками CyPet и YPet^14,17. Rango — это универсальный датчик, который может использоваться как для FRET, так и для ядерных импортных анализов, где он функционирует как прямой импорт β груза.
   1. Трансформируйте клетки E. coli BL21(DE3) с плазмидой Rango (содержащей N-концевую 6-His метку) с помощью теплового шока следующим образом. Разморозьте 50 мкл аликвоты клеток BL21(DE3) на льду. Соедините с плазмидой 100-200 нг. Перемешайте, постукивая по трубке 4-5 раз, а затем выдерживайте на льду в течение 30 минут, прежде чем поместить на тарелку с температурой 42 °C на 40 секунд. Немедленно переложите обратно на лед еще на 2-5 минут.
   2. Добавьте 900 мкл среды SOC при комнатной температуре и инкубируйте в шейкере при 37 °C в течение 1 ч перед распределением клеток на предварительно подогретую агаровую пластину (1,5% агар, среда LB, 100 мкг/мл ампициллина). Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 °C. Храните тарелку при температуре 4 °C до 1 недели или используйте ее сразу для производства белка.
   3. Начните производство белка путем инокуляции трех 25 мл заквасок в пробирки объемом 50 мл с увеличивающимся числом колоний (~3-10) из планшета BL21(DE3). После инкубации в течение ночи при 37 °C в шейкере выберите культуры с наружным диаметром_{600 нм} < 1,0 для инокуляции культуры объемом 1 л в среду LB с помощью колбы Fernbach объемом 2,8 л без перегородок. Выращивают при 37 °C до достижения наружного диаметра_{600 нм} = 0,1-0,3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование старых агаровых пластин BL21(DE3) LB или высокой плотности заквасок (наружный диаметр_{600 нм} >1,0) может снизить выход и чистоту белкового препарата.
   4. Остудите до комнатной температуры (22-25 °C), положив на лед. Индуцировать экспрессию белка с помощью 0,3 мМ IPTG (конечная концентрация) и инкубировать в шейкере (80-120 об/мин) при комнатной температуре в течение 12-14 ч.
   5. Соберите клетки центрифугированием (6 000 x g, 15 мин, 4 °C) и ресуспендируйте в 30 мл ледяного 10 мМ имидазола в PBS (pH 7,4) с добавлением коктейля ингибиторов протеазы, не содержащего ЭДТА. Лизиз двумя проходами проходит через ледяную французскую ячейку давления и осветляет лизат центрифугированием (16 000 x g, 40 мин, 4 °C).
   6. Инкубируйте лизат с высокотекучей аффинной никелевой смолой (30-60 мин, 4 °C), используя 1 мл смолы на 1 л культуры E. coli . Поместите смолу в хроматографические колонки, промойте 10-20 объемами ледяного 10 мМ имидазола/PBS (pH 7,4). Elute Rango с шагом 25 мМ имидазола/PBS (25-200 мМ, pH 7,4), используя 5-кратный объем слоя на каждой стадии.
   7. Используйте SDS-PAGE для выбора и объединения партий с высочайшей чистотой.
   8. Приготовьте буфер XB, растворив 10 мМ HEPES, 100 мМ KCl, 10 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂ и 50 мМ сахарозу в dH₂O. Отрегулируйте pH до 7,7.
   9. Диализовать белок в буфере XB и концентрате методом центрифугирования (7500 x g, 4 °C) на ультрафильтрационном устройстве с отсечкой молекулярной массы 30 кДа.
   10. Измерьте концентрацию белка методом Брэдфорда или другим предпочтительным методом и заморозьте одноразовые аликвоты в жидком азоте перед хранением при температуре -80 °C.

3. Определение оптимальных условий пермеабилизации плазматической мембраны

ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за различий между каждой партией нейронов оптимизируйте условия пермеабилизации для каждой партии нейронов. Выполните это в тот же день перед проведением анализов при транспортировке ядерного топлива.

1. В пластиковой 96-луночной промежуточной пластине приготовьте последовательное разведение Tris-HCl pH 7,5 (чтобы вызвать осмотическое набухание) при 0 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ и 40 мкМ в каждой из трех концентраций БСА: 50 мг/мл, 100 мг/мл и 150 мг/мл (для молекулярной скученности/механической поддержки). Разогрейте растворы до 37 °C.
2. Промойте нейроны один раз в предварительно подогретом PBS. Снимите PBS и перенесите Tris/BSA с промежуточной пластины. Вернитесь в инкубатор на 4 минуты.
3. Выньте из инкубатора и поставьте тарелку с культурой на лед. Промойте 2 x 5 мин в 1x TRB-BSA (как приготовлено на шаге 2.1.2).
4. После окончательного полоскания добавьте 70 кД декстрана Texas Red-labeled (0,6 мг/мл) и Hoechst (1:10 000) в 1x TRB-BSA. Оставьте тарелку на скамейке при комнатной температуре на 15 минут, в защищенном от света месте.
5. Изображение с помощью конфокального микроскопа для определения буфера и концентрации БСА, в которых процент проникновения плазматической мембраны является самым высоким, но ядерная мембрана все еще ограничивает поступление декстрана 70 кДа (цель ≥ 80%). Используйте эти условия для последующих экспериментов.

4. Ядерный импортный анализ

1. Подготовка реакций переноса
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы все реакции в планшете могли начаться одновременно, приготовьте реакционную смесь в пластиковой 96-луночной промежуточной пластине на льду перед проникновением нейронов. Проведите как минимум два технических повтора для каждого условия. Включите элементы управления на каждой пластине.
   1. Приготовьте основную реакционную смесь, состоящую из 2,5 мг/мл WCE, 1x ERM, флуоресцентного груза (200 нМ Ранго) и Hoechst 33342 (10 мг/мл, 1:10 000) в 1x TRB-BSA, что достаточно для 50 μл на лунку. ОПЦИЯ: Включить 70 кД техасского декстрана с красной меткой, чтобы обеспечить мониторинг целостности ядерных пор на протяжении всей реакции переноса, помня о том, что для визуализации исключения ядерного декстрана необходима конфокальная микроскопия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленная концентрация WCE является разумной отправной точкой для оптимизации анализа. Проведение эмпирических испытаний каждой партии WCE для определения оптимальной концентрации, необходимой для эффективного ядерного импорта желаемого груза. Избегайте объединения данных из реплик, подготовленных с разными партиями WCE, так как эффективность импорта может отличаться.
   2. Подготовьте меры контроля, включающие (1) только груз: Ранго, но без WCE или ERM и (2) Ингибитор: флуоресцентный груз, ERM, WCE и 100 μМ импортазол (IPZ, низкомолекулярный ингибитор импортина β¹⁸). В качестве альтернативного ингибитора используйте 0,8 мг/мл агглютинина зародышей пшеницы (WGA)¹⁹.
      Примечание: Уравновесьте ингибиторы в смеси для анализа, содержащей ВКЭ, не менее чем за 30 минут до начала переноса. Для максимального ингибирования этапы промывки после пермеабилизации в соответствующих лунках также должны включать ингибитор.
2. Пермеабилизация и промывание нейронов
   1. Пермеабилизируйте нейроны в соответствии с оптимальным, специфичным для партии протоколом, определенным на шаге 3.
   2. Достаньте тарелку с культурой из инкубатора и сразу же поставьте ее на лед. Промыть 2x в течение 5 минут в 1x TRB-BSA. Включите ингибитор в полоскатели для специально отведенных лунок.
3. Запустите реакцию переноса.
   1. После окончательного ополаскивания удалите 1x TRB-BSA. Работая быстро, используйте многоканальную пипетку (50 мкл/лунка) для переноса предварительно смешанных транспортных реакций на проникнутые клетки.
   2. Немедленно загрузите планшет в микроскоп с высоким содержанием микроскопа при комнатной температуре, чтобы начать покадровую съемку (см. шаг 4.4) или поместите планшет на стол, защищенный от света, и дайте реакции протекать в течение желаемого периода времени (например, 30-120 минут) до фиксации и визуализации.
   3. При желании зафиксируйте в 4% параформальдегиде/PBS на 15 минут, промойте 2 раза в течение 5 минут в PBS и переведите на 50% глицерин/PBS для последующей визуализации. Храните неподвижные пластины в защищенном от света месте при температуре 4 °C (стабильно до 1 недели и более).
4. Визуализация в реальном времени
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе примените любой предпочтительный метод получения и анализа изображений.
   1. Загрузите пластину в микроскоп с большим содержанием содержимого. Запустите первичную тестовую пластину для оптимизации и сохранения параметров изображения, включая увеличение, фокусировку, время экспозиции (Hoechst и FITC) и интервалы перед запуском экспериментальных образцов. Сохраняйте параметры для перезагрузки с каждой последующей пластиной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественного анализа установите время экспозиции для флуоресцентного импортного груза (FITC) значительно ниже насыщения в установившемся состоянии или самую позднюю временную точку для использования. Установите это с помощью тестовой пластины, нацеливаясь на половину максимального насыщения, чтобы допустить изменения интенсивности в разных экспериментальных условиях. Соберите изображения Хёхста для каждого кадра и временной точки, чтобы обеспечить идентификацию ядерного оружия во время последующего автоматизированного анализа.
   2. При необходимости отрегулируйте смещение фокуса, используя Хёхста в качестве длины волны фокусировки, и запустите протокол визуализации. Собирайте изображения каждые 5 минут в течение 30 минут. При необходимости отрегулируйте интервал и время реакции в зависимости от скорости визуализации и кинетики интересующей импортной реакции.

5. Анализ изображений

1. В диалоговом окне «Обзорная пластина » микроскопа откройте изображения Hoechst и FITC с репрезентативной рамки. На вкладке Run Analysis выберите модуль Translocation-Enhanced и настройте параметры. Установите Hoechst в качестве изображения отсека и FITC в качестве изображения транслокационного зонда.
2. В разделе «Отсеки» отрегулируйте приблизительную ядерную ширину, интенсивность над локальным фоном и минимальную/максимальную площадь. Активируйте функцию автоматического разделения соприкасающихся отсеков , так как нейроны имеют тенденцию к кластеризации. Просмотрите результаты, выбрав Тестовый запуск. Отрегулируйте настройки, чтобы максимально повысить точность идентификации нейронных ядер при ограничении ошибочного включения ненейрональных ядер или мусора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глиальное загрязнение, если оно присутствует, обычно может быть исключено на этом этапе в зависимости от размера ядра. Определение оптимальных настроек идентификации компартмента представляет собой компромисс между точностью и номером клеток и должно устанавливаться эмпирически в зависимости от анализа, типа клеток и плотности культуры. Строгие параметры будут пропускать множество ячеек, но содержать меньше ошибок, в то время как либеральные параметры будут более инклюзивными, но содержать больше ошибок. Если в эксперимент включены различные популяции клеток (например, мутанты болезней) или методы лечения, которые могут влиять на размер ядра, мы рекомендуем установить достаточно широкие параметры размера/интенсивности, чтобы учесть все условия, чтобы избежать необходимости в нескольких наборах параметров в эксперименте.
3. Чтобы избежать артефактов от края ядра, определите области измерения на несколько пикселей внутри и за пределами края отсека, определенного окрашиванием Хёхста. В зависимости от увеличения и биннинга, установите 2-4 пикселя для расстояния внутри области и 1-2 пикселя для расстояния до внешней области. Отрегулируйте ширину внешней области (1-2 пикселя).
4. Выберите желаемый метод оценки фона (рекомендуется по умолчанию Auto Constant ). В поле Настройка журнала данных выберите нужные выходные параметры, включая среднюю внутреннюю интенсивность, среднюю внешнюю интенсивность и внутреннюю/внешнюю среднюю интенсивность (отношение ядер к цитоплазматическим (N/C)) значениям). Сохраните параметры анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется включать в каждый эксперимент внутренний положительный и отрицательный контроль, чтобы гарантировать, что параметры максимизируют чувствительность для обнаружения интересующего биологического события.
5. Используйте диалоговое окно Plate Utilities для выполнения анализа требуемой пластины (пластин) с использованием сохраненных параметров и экспорта измерений.
6. Просмотрите и обобщите данные по состоянию лечения. ОПЦИЯ: Применение фильтров для удаления нефизиологических данных, таких как интенсивность зонда = 0 и экстремальные значения отношения N/C (т.е. <0,1 и >100). Одинаково применяйте любые фильтры во всех условиях и экспериментах.
7. В качестве дополнительной поправки на исходную флуоресценцию нормализуйте данные до контрольных лунок, в которых отсутствовали лизат и ЭР. Чтобы облегчить сравнение биологических репликатов (т.е. независимых препаратов культуры нейронов), выразите окончательные данные об импорте ядер в процентах от времени 0.

Селективная пермеабилизация плазматической мембраны (рис. 1A) является наиболее важным этапом протокола и должна быть проверена до того, как мы приступим к анализу ядерного импорта. Из-за различий между каждым культуральным препаратом обычно проводится планшет для начального титрования для определения оптимальных, специфичных для партии концентраций гипотонического буфера Tris-HCl и подушки BSA, как описано на шаге 3. Недостаточно и сверхпеабилизированные клетки легко идентифицируются с помощью конфокальной микроскопии (рис. 1B) из-за отсутствия проникновения 70 кД декстрана в цитоплазматический компартмент или присутствия декстрана как в цитоплазматическом, так и в ядерном компартментах соответственно. В оптимальных условиях у большинства клеток (≥80%) декстрана 70 кДа окружает, но не пересекает ядерную мембрану.

После оптимизации пермеабилизации следующим критическим этапом, описанным на шаге 4, является установление того, что ядерный импорт флуоресцентных грузов зависит от рецепторов энергии и транспорта (рисунок 2A). Контрольные группы, в которых отсутствуют ERM и WCE (источник импорта и белки цикла Ran), должны показать следы, если таковые имеются, ядерного накопления флуоресцентного груза (рисунок 2B, C). Импорт должен быть заблокирован соответствующими ингибиторами ядерного импорта. Эти меры контроля должны быть валидированы для каждого груза, чтобы убедиться в том, что ожидаемый механизм способствует импорту ядерных материалов. После того, как анализ ядерного переноса будет валидирован, в зависимости от интересующего вопроса могут быть применены экспериментальные возмущения.

Рисунок 1: Селективная пермеабилизация плазматической мембраны в первичных корковых нейронах мыши. (A) Схема пермеабилизации нейронов с использованием гипотонического Tris-HCl с подушкой BSA с последующей валидацией с помощью техасского красного декстрана 70 кДа. (B) Конфокальные изображения недостаточно проникающих нейронов, в которых плазматическая мембрана остается неповрежденной, ограничивая поступление флуоресцентного декстрана (стрелки); сверхпроникающие нейроны, в которых декстран свободно входит в ядро (звездочки); и оптимально проникающие нейроны, в которых декстран окружает, но не входит в ядро. Масштабные линейки = 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Валидация энергетического и импортинового β-зависимого ядерного импорта Rango в первичных корковых нейронах первичных коров мыши. (A) Схема реакции импорта ядра в пермеабилизированных нейронах. (B) Автоматизированный анализ ядерно-цитоплазматического соотношения (N/C) Rango. Среднее значение ± SEM показано для n = 3 биологических репликатов (независимых нейронных культур), каждая из которых содержит по две технические репликации (лунки) на состояние или примерно 400 нейронов. (C) Конфокальные изображения импорта ядра Ранго, показывающие потребность в экстракте цельных клеток (WCE) и смеси для регенерации энергии (ERM), а также блокаду импорта с помощью импортазола (IPZ, 100 μM). Параметры конфокальной регистрации поддерживались постоянными во всех условиях. Масштабная линейка = 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Описанный выше протокол представляет собой надежный и воспроизводимый метод селективной проницаемости плазматической мембраны первичных корковых нейронов мыши для анализа ядерного импорта. В данной работе показано применение метода анализа ядерного импорта прямого импорта β груза (Ранго), но этот же подход может быть использован для анализа пассивного и активного импорта широкого спектра флуоресцентных грузов. Пермеабилизация позволяет с высокой точностью манипулировать транспортной реакцией способами, которые невозможны в интактных клетках, как мы недавно описали для мутантных белков дипептидных повторов C9orf72 (DPR), участвующих в БАС и FTD¹⁴. Синтетические белки DPR предварительно инкубировали с транспортными лизатами до начала реакции импорта ядер, что облегчало анализ зависимости концентрации и длины блокады ядерного импорта аргининсодержащими DPR. В исследованиях фракционирования индуцированные DPR агрегаты включались или исключались из лизата транспорта для анализа функциональных последствий для импорта ядер. DPR также предварительно инкубировали с ядрами для определения влияния на проницаемость ядерных пор. Вот несколько примеров вариаций анализа, которые могут быть применены к изучению неупорядоченных и склонных к агрегации белков, обычно участвующих в нейродегенерации. Поскольку это искусственная система in vitro , результаты должны быть тщательно интерпретированы в пределах ограничений анализа.

Успех протокола в решающей степени зависит от селективной пермеабилизации плазматической мембраны до такой степени, что рекомендуется тщательная оптимизация условий для каждой партии первичных нейронов. Важно отметить, что этот протокол специфичен для первичных нейронов коры головного мозга мыши. Мы также провели предварительное успешное тестирование с первичными спинномозговыми моторными нейронами мышей, но предупреждаем, что метод гипотонической пермеабилизации не является надежным в индуцированных человеком культурах спинномозговых нейронов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток (не показано). Если активный импорт ядерных материалов не наблюдается, несмотря на оптимальную проницаемость, усилия по устранению неполадок должны быть сосредоточены на обеспечении высококачественных, концентрированных ВКЭ и флуоресцентных грузовых препаратов. Из-за возможности вариаций от партии к партии лучше всего готовить и замораживать большие запасы одноразовых аликвот и избегать сравнения результатов разных партий. Использование автоматизированной визуализации и анализа с высоким содержанием позволяет быстро визуализировать кинетику импорта ядер по сотням нейронов на скважину с минимальным вмешательством исследователя. Если высокопроизводительная визуализация недоступна, реакции импорта ядерных материалов, содержащие Rango и связанные с ним грузы, могут быть^{исправлены14} для альтернативных методов визуализации и анализа. Если проводится ручная визуализация и анализ, исследователи должны быть слепы к условиям лечения, чтобы избежать систематической ошибки.

Мы ожидаем, что этот метод будет широко применим к исследованиям пассивного и активного переноса ядра в первичных нейронах. Как описано выше, пермеабилизированные клетки являются полезной моделью для изучения влияния неупорядоченных и склонных к агрегации белков, обычно участвующих в нейродегенерации и все чаще подозреваемых в нарушении нуклеоцитоплазматического транспорта 20,21,22. Сравнение между различными типами клеток может также улучшить понимание потенциальных различий в динамике переноса, связанных со специфичными для каждой клетки различиями в составе ядерного порового комплекса^11,12. До сих пор не требовалось изменения концентраций компонентов в реакционной смеси транспорта для пермеабилизированных нейронов по сравнению с клетками HeLa¹⁴. Тем не менее, не проводилось никаких формальных сравнений минимальных транспортных требований и эффективности проникающего HeLa по сравнению с нейронами или глией. В дополнение к изменению типа проникающих клеток, использование нейронов или даже ткани ЦНС в качестве источника цитоплазматического или цельноклеточного экстракта, таким образом, варьируя источник растворимых транспортных факторов, может обеспечить дополнительный подход к тестированию вопросов, связанных с заболеванием.

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана NINDS K08NS104273 (в L.R.H.).