Ensaios de transporte nuclear em neurônios corticais de camundongos permeabilizados

Desenvolvemos um método confiável de permeabilização seletiva da membrana plasmática de neurônios corticais primários de camundongos para análise automatizada de alto conteúdo do transporte nucleocitoplasmático neuronal.

A interrupção do transporte nucleocitoplasmático está cada vez mais implicada na patogênese de doenças neurodegenerativas. Além disso, há um reconhecimento crescente de diferenças específicas da célula na estrutura do complexo de poros nucleares, levando à necessidade de adaptar os métodos de transporte nuclear para uso em neurônios. Ensaios de células permeabilizadas, nos quais a membrana plasmática é perfurada seletivamente pela digitonina, são amplamente utilizados para estudar o transporte nuclear passivo e ativo em linhagens celulares imortalizadas, mas não foram aplicados a culturas neuronais. Em nossas tentativas iniciais, observamos a rápida perda da integridade da membrana nuclear em neurônios corticais primários de camundongos expostos a baixas concentrações de digitonina. Nossa hipótese é que as membranas nucleares neuronais podem ser exclusivamente vulneráveis à perda de suporte citoplasmático. Depois de testar várias abordagens para melhorar a estabilidade nuclear, observamos integridade nuclear ideal após lise hipotônica na presença de uma almofada concentrada de albumina de soro bovino. Os núcleos neuronais preparados por essa abordagem importam de forma confiável carga fluorescente recombinante de maneira dependente de energia, facilitando a análise da importação nuclear por microscopia de alto conteúdo com análise automatizada. Prevemos que este método será amplamente aplicável a estudos de transporte nuclear passivo e ativo em neurônios primários.

A interrupção do transporte nucleocitoplasmático, o tráfego regulado de proteínas e RNA entre o núcleo e o citoplasma, está cada vez mais implicada na patogênese de doenças neurodegenerativas (revisado recentemente¹). Nós e outros relatamos ruptura estrutural e funcional do aparelho de transporte nucleocitoplasmático em tecido post-mortem e modelos animais de esclerose lateral amiotrófica (ELA) C9orf72 e demência frontotemporal (FTD), doença de Alzheimer e doença de Huntington 2,3,4,5 . Os mecanismos e consequências funcionais da interrupção do transporte nucleocitoplasmático para neurodegeneração e abordagens para resgate terapêutico são áreas de investigação em andamento.

Os poros nucleares são grandes complexos transmembranares de ~ 30 proteínas de nucleoporina que permitem a difusão de pequenas moléculas através da membrana nuclear, mas restringem cada vez mais a passagem de cargas >40 kD através de uma barreira de permeabilidade de nucleoporinas ricas em fenilalanina-glicina (FG) no canal central⁶. Cargas maiores contendo sequências de sinal de localização nuclear (NLS) ou sinal de exportação nuclear (NES) sofrem transporte ativo mediado por receptor através do poro através de receptores de transporte nuclear (importinas e exportinas) e um gradiente acentuado da pequena GTPase Ran através da membrana nuclear (revisado recentemente⁷). Uma ampla gama de métodos foi desenvolvida para analisar a dinâmica do transporte nuclear em células cultivadas, incluindo o tráfego de cargas endógenas e construções repórter marcadas que servem como substratos para as principais subclasses de receptores de transporte. Tais abordagens foram prontamente adaptadas aos neurônios ^2,5,8 e fornecem uma leitura das perturbações do transporte nuclear no contexto de uma célula viva intacta. No entanto, em ensaios de células vivas, a capacidade de manipular diretamente as reações de transporte nuclear ou investigá-las isoladamente de outros processos celulares é limitada.

Nos ensaios de células permeabilizadas, a membrana plasmática é perfurada seletivamente e o citoplasma é liberado, deixando o envelope nuclear e os complexos de poros nucleares intactos e capazes de realizar transporte bidirecional passivo ou dependente de energia ^9,10. Tais reações de transporte podem ser prontamente reconstituídas pela adição de lisados de células inteiras, frações citoplasmáticas ou proteínas de transporte nuclear recombinantes purificadas e suas cargas. Assim, os ensaios de células permeabilizadas permitem uma ampla gama de investigações bioquímicas ou biofísicas, incluindo a entrega de proteínas e RNAs recombinantes ou sintéticos relevantes para o estudo de doenças neurodegenerativas.

Dados os relatos de diferenças específicas da célula na estrutura do complexo de poros nucleares e na dinâmica de transporte^11,12, nosso objetivo foi adaptar o ensaio de células permeabilizadas para uso em culturas neuronais primárias. Embora amplamente utilizado para analisar o transporte nuclear em linhagens celulares imortalizadas, apesar da exaustiva pesquisa bibliográfica, não encontramos relatos publicados de permeabilização da membrana plasmática neuronal que verificassem a preservação da integridade da membrana nuclear. A maioria dos protocolos depende da digitonina, um detergente que tem como alvo a composição única do colesterol da membrana plasmática, para perfurar a membrana nuclear, deixando a membrana nuclear intacta¹³. Nossas tentativas iniciais de uso de digitonina em neurônios corticais primários de camundongos mostraram perda imediata da integridade da membrana nuclear, evidenciada pela difusão de um dextrano fluorescente de 70 kD no núcleo. Nossa hipótese é que a ruptura do envelope nuclear pode ser causada por perturbação mecânica por perda de suporte citoplasmático e testamos vários métodos de otimização, incluindo aglomeração molecular, estabilização do citoesqueleto e métodos alternativos de lise celular. Aqui, detalhamos um método de permeabilização hipotônica rápida usando uma almofada concentrada de albumina de soro bovino (BSA) para proteger os núcleos neuronais e facilitar a análise a jusante da importação nuclear neuronal. Recentemente, usamos esse método para avaliar o mecanismo de interrupção da proteína de repetição de dipeptídeo em C9orf72-ALS / FTD¹⁴ e antecipamos que será amplamente aplicável a estudos futuros de transporte nuclear passivo e ativo em neurônios primários.

Primeiro, o protocolo descreve a geração de culturas neuronais primárias (etapa 1) e preparação de materiais para o ensaio de transporte (etapa 2), seguido pelo próprio ensaio de transporte (etapas 3-4) e aquisição e análise de imagens (etapa 5). Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) da Universidade Johns Hopkins.

1. Culturas primárias de neurônios corticais de camundongos

1. Prepare as soluções de estoque.
   1. Tampão de dissecção: Combine 50 mL de 10x HBSS, 15 mL de glicose 1 M (em dH₂O), 5 mL de HEPES 1 M, 5 mL de piruvato de sódio 100 mM e 5 mL de penicilina-estreptomicina 100x. Aumente o volume para 500 ml com dH₂O. Filtro estéril e conservar a 4 °C.
   2. Papaína: Dilua a papaína a 30 mg / mL com tampão de dissecção. Conservar a 4 °C.
   3. DNase: Dilua a DNase I a 10 mg / mL com tampão de dissecção. Alíquota e conservar a -20 °C.
   4. Meio de plaqueamento: Adicione 5% de soro fetal bovino (FBS), 2% de B-27, 1% de Glutamax e 1% de penicilina-estreptomicina ao meio neurobasal. Filtrar estéril e conservar a 4 °C.
   5. Meio de alimentação: Adicione 2% de B-27, 1% de Glutamax e 1% de penicilina-estreptomicina ao meio neurobasal. Conservar a 4 °C.
2. Cubra os pratos.
   1. Cubra as placas de 96 poços com fundo de vidro óptico com poli-D-lisina (20 μg/mL) e laminina (1:100) em dH_{estéril 2}O. Coloque a placa em uma incubadora durante a noite.
   2. No dia da dissecação, enxágue os poços três vezes com dH₂O estéril e substitua por meio neurobasal. Equilibre-se em uma incubadora por pelo menos 30 min.
3. Dissecar e digerir os córtices.
   NOTA: Realize a dissecção em uma bancada limpa usando ferramentas autoclavadas para evitar a contaminação da cultura.
   1. Eutanasiar a fêmea grávida E15-16 C57BL/6J por luxação cervical. Pulverize o abdômen com etanol 70%. Trabalhe rapidamente. Use uma tesoura e uma pinça dentada para fazer uma incisão abdominal na linha média, excise o útero e, em seguida, transfira os embriões do saco amniótico para uma placa de Petri. Decapitar os embriões com tesoura e coletar cabeças em uma placa de Petri de 10 cm contendo tampão de dissecação.
   2. Sob um microscópio de dissecação, use uma pinça fina para remover o crânio e retirar as meninges. Transferir os cérebros inteiros para uma nova placa de Petri de 10 cm contendo tampão de dissecação. Separe os hemisférios e remova as estruturas subcorticais.
   3. Pique os córtices com uma lâmina de barbear estéril e transfira-os para um tubo cônico contendo 5 mL de tampão de dissecação. Adicione 100 μL de papaína (estoque 30 mg / mL, concentração final 0,6 mg / mL) e 50 μL de DNase (estoque 10 mg / mL, concentração final 0,1 mg / mL). Digerir em banho-maria a 37 °C durante 10 min.
      NOTA: A digestão além de 10 minutos é prejudicial à sobrevivência celular.
   4. Remova o sobrenadante e lave duas vezes com 10 mL de meio de revestimento para interromper a digestão. Deixe o tecido assentar por gravidade entre cada lavagem.
   5. Triturar suavemente em meio de plaqueamento de 2 mL com pipeta P1000 até que grandes pedaços de tecido desapareçam (aproximadamente 20 vezes). Adicione mais 8 mL de meio de plaqueamento para trazer o volume para aproximadamente 10 mL e passe a suspensão celular por um filtro de células de 40 μm.
4. Placa e manutenção de neurônios.
   1. Centrifugue a 200 x g por 5 min. Ressuspenda as células em meio de revestimento pré-aquecido. Conte as células e dilua para 500.000 células/mL no meio de plaqueamento. Inverta suavemente para misturar e transfira para um reservatório multicanal estéril.
   2. Aspire o meio neurobasal dos poços e adicione imediatamente 100 μL de células por poço com uma pipeta multicanal (50.000 células/poço). Não deixe os poços revestidos secarem.
   3. Após 24 h de dissecção, troque 50% do meio pelo meio de alimentação. Continue 50% de mudança média em dias alternados até o dia 5-7 para realizar os ensaios in vitro .

2. Preparação dos componentes do ensaio de transporte nuclear

1. Amortecedor de transporte (TRB, adaptado de¹⁵)
   1. Para preparar 5x TRB, dissolva 100 mM HEPES, 550 mM KOAc, 10 mM Mg(OAc)₂, 25 mM NaOAc, 2.5 mM EGTA e 1.25 M de sacarose em dH₂O. Ajuste o pH para 7.3 e armazene o tampão a 4 °C.
   2. No dia do experimento de transporte, prepare 1x TRB-BSA. Diluir 5x TRB em dH₂O, adicionar coquetel inibidor de protease livre de EDTA, 2 mM de DTT e 50 mg/mL de BSA.
2. Cabaz de regeneração energética (MTC, adaptado do^{ponto 9,16})
   1. Para preparar 20x ERM, dissolva 2mM de sal de lítio ATP, 2 mM de sal de lítio GTP, 80 mM de fosfato de creatina e 400 U/mL de creatina quinase em 1x TRB.
   2. Congelar alíquotas descartáveis a -20 °C.
3. Preparação de extrato de células inteiras (WCE, fonte de receptores de transporte e proteínas do ciclo de Ran).
   NOTA: Extrato citoplasmático ou de células inteiras (WCE) pode ser usado, dependendo dos objetivos experimentais. Aqui, a preparação do WCE é descrita como usada nos ensaios iniciais de transporte de neurônios¹⁰.
   1. Cultivar células HEK293T até à confluência em quinze placas de cultura de 150 mm. Separar com tripsina-EDTA, ressuspender em meio contendo 10% de soro bovino fetal para inibir a tripsina e pellet de células a 200 x g por 5 min. Ressuspenda as células em 10 mL de 1x TRB gelado com coquetel inibidor de protease recém-adicionado.
   2. Sonicar no gelo, 3 x 10 pulsos, usando um sonicador de sonda portátil. Clarificar por centrifugação a 14.000 x g durante 15 min a 4 °C.
   3. Meça a concentração de proteína (meta de 8-10 mg / mL) e congele alíquotas de uso único em nitrogênio líquido antes do armazenamento a -80 ° C.
4. Carga de importação nuclear recombinante
   NOTA: O protocolo de transporte nas etapas 3-5 pode ser adaptado para qualquer carga de transporte nuclear fluorescente, para interrogar a via de transporte nuclear ativa ou passiva de interesse. Aqui, o protocolo descreve a expressão e importação nuclear de Rango (importação regulamentada por Ran β carga), que consiste no domínio de ligação à importina β da importina α1 flanqueado pelas proteínas fluorescentes CyPet e YPet^14,17. O Rango é um sensor versátil que pode ser usado para FRET e ensaios de importação nuclear, onde funciona como uma importação direta β carga.
   1. Transformar as células BL21(DE3) de E. coli com o plasmídeo Rango (contendo uma etiqueta N-terminal 6-His) por choque térmico do seguinte modo. Descongele uma alíquota de 50 μL de células BL21 (DE3) no gelo. Combine com 100-200 ng de plasmídeo. Misture batendo no tubo 4-5 vezes e depois incube no gelo por 30 min antes de colocar em uma placa a 42 ° C por 40 s. Transfira imediatamente de volta para o gelo por mais 2-5 min.
   2. Adicione 900 μL de meio SOC à temperatura ambiente e incube em um agitador a 37 ° C por 1 h antes de espalhar as células em uma placa de ágar pré-aquecida (ágar 1,5%, meio LB, 100 μg / mL de ampicilina). Incubar a placa durante a noite a 37 °C. Conservar a placa a 4 °C até 1 semana ou utilizá-la imediatamente para a produção de proteínas.
   3. Inicie a produção de proteínas inoculando três 25 mL de culturas iniciais em tubos de 50 mL com número crescente de colônias (~ 3-10) da placa BL21 (DE3). Após incubação durante a noite a 37 °C num agitador, seleccionar as culturas com OD_{600 nm} < 1,0 para inocular uma cultura de 1 L em meio LB utilizando um balão de Fernbach de 2,8 L sem defletor. Crescer a 37 °C até atingir OD_{600 nm} = 0,1-0,3.
      NOTA: O uso de placas de ágar LB BL21 (DE3) mais antigas ou alta densidade de culturas iniciais (OD_{600 nm} >1,0) pode reduzir o rendimento e a pureza da preparação proteica.
   4. Resfrie à temperatura ambiente (22-25 °C) colocando sobre gelo. Induza a expressão de proteínas com 0,3 mM IPTG (concentração final) e incube em um agitador (80-120 rpm) em temperatura ambiente por 12-14 h.
   5. Colete as células por centrifugação (6.000 x g, 15 min, 4 ° C) e ressuspenda em 30 mL de imidazol 10 mM gelado em PBS (pH 7,4), suplementado com coquetel inibidor de protease livre de EDTA. Lise por duas passagens através de uma célula de pressão francesa gelada e clareie o lisado por centrifugação (16.000 x g, 40 min, 4 ° C).
   6. Incubar o lisado com resina de agarose de afinidade de níquel de alto fluxo (30-60 min, 4 °C), usando 1 mL de resina por 1 L de cultura de E. coli . Colocar a resina nas colunas de cromatografia, lavar com 10-20 volumes de imidazol/PBS a 10 mM gelados (pH 7,4). Eluir Rango com incrementos de 25 mM de imidazol/PBS (25-200 mM, pH 7,4), utilizando um volume de leito de 5 vezes em cada etapa.
   7. Use SDS-PAGE para selecionar e agrupar os lotes com a pureza mais alta.
   8. Prepare o tampão XB dissolvendo 10 mM HEPES, 100 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ e 50 mM de sacarose em dH₂O. Ajuste o pH para 7.7.
   9. Dialisar a proteína em tampão XB e concentrar-se por centrifugação (7500 x g, 4 °C) num dispositivo de ultrafiltração com um limite de peso molecular de 30 kD.
   10. Medir a concentração de proteínas pelo método de Bradford ou por outro método preferido e congelar alíquotas de uso único em azoto líquido antes de o armazenar a -80 °C.

3. Determinação das condições ideais de permeabilização da membrana plasmática

NOTA: Devido às variações entre cada lote de neurônios, otimize as condições de permeabilização para cada lote de neurônios. Efectuar esta operação no mesmo dia antes de efectuar ensaios de transporte nuclear.

1. Em uma placa de preparo de plástico de 96 poços, prepare uma diluição seriada de Tris-HCl pH 7,5 (para causar inchaço osmótico), a 0 μM, 10 μM, 20 μM e 40 μM em cada uma das três concentrações de BSA: 50 mg / mL, 100 mg / mL e 150 mg / mL (para aglomeração molecular / suporte mecânico). Pré-aqueça as soluções a 37 °C.
2. Enxágue os neurônios uma vez em PBS pré-aquecido. Remova o PBS e transfira Tris/BSA da placa de preparação. Retorne à incubadora por 4 min.
3. Retire da incubadora e coloque a placa de cultura no gelo. Enxágue 2 x 5 min em 1x TRB-BSA (conforme preparado na etapa 2.1.2).
4. Após o enxágue final, adicione 70 kD de dextrano marcado com Texas Red (0,6 mg / mL) e Hoechst (1: 10.000) em 1x TRB-BSA. Deixe o prato na bancada em temperatura ambiente por 15 min, protegido da luz.
5. Imagem usando um microscópio confocal para identificar o tampão e a concentração de BSA em que a porcentagem de permeabilização da membrana plasmática é a mais alta, mas a membrana nuclear ainda restringe a entrada do dextrano de 70 kD (meta ≥ 80%). Use essas condições para experimentos subsequentes.

4. Ensaio de importação nuclear

1. Prepare as reações de transporte
   NOTA: Para permitir que todas as reações na placa sejam iniciadas simultaneamente, prepare a mistura de reação em uma placa de plástico de 96 poços no gelo, antes da permeabilização dos neurônios. Efectuar um mínimo de dois replicates técnicos por condição. Inclua controles em cada placa.
   1. Prepare a mistura de reação de base consistindo de 2,5 mg / mL de WCE, 1x ERM, carga fluorescente (200 nM Rango) e Hoechst 33342 (10 mg / mL, 1: 10.000) em 1x TRB-BSA, suficiente para 50 μL por poço. OPÇÃO: Incluir 70 kD de dextrano marcado com vermelho Texas para permitir o monitoramento da integridade dos poros nucleares durante toda a reação de transporte, tendo em mente que a microscopia confocal é necessária para obter imagens da exclusão do dextrano nuclear.
      NOTA: A concentração de WCE fornecida é um ponto de partida razoável para a otimização do ensaio. Realize testes empíricos de cada lote de WCE para determinar a concentração ideal necessária para a importação nuclear eficiente da carga desejada. Evite combinar dados de réplicas preparadas com diferentes lotes de WCE, pois a eficiência da importação pode variar.
   2. Prepare os controles, incluindo (1) Carga sozinha: Rango, mas sem WCE ou ERM e (2) Inibidor: carga fluorescente, ERM, WCE e 100 μM de importazol (IPZ, uma pequena molécula inibidora da importina β¹⁸). Como inibidor alternativo, use 0,8 mg/mL de aglutinina de gérmen de trigo (WGA)¹⁹.
      NOTA: Equilibre os inibidores na mistura de ensaio contendo WCE por pelo menos 30 minutos antes do início do transporte. Para inibição máxima, as etapas de enxágue pós-permeabilização nos poços correspondentes também devem incluir o inibidor.
2. Permeabilize e enxágue os neurônios
   1. Permeabilize os neurônios de acordo com o protocolo ideal e específico do lote identificado na etapa 3.
   2. Remova a placa de cultura da incubadora e coloque-a imediatamente no gelo. Enxágue 2x por 5 min em 1x TRB-BSA. Inclua um inibidor nos enxágues dos poços designados.
3. Execute a reação de transporte.
   1. Após o enxágue final, remova 1x TRB-BSA. Trabalhando rapidamente, use uma pipeta multicanal (50 μL/poço) para transferir as reações de transporte pré-misturadas para as células permeabilizadas.
   2. Carregue imediatamente a placa em um microscópio de alto conteúdo à temperatura ambiente para iniciar a imagem de lapso de tempo (consulte a etapa 4.4) ou coloque a placa na bancada, protegida da luz, e permita que a reação prossiga pelo período de tempo desejado (por exemplo, 30-120 min) antes da fixação e imagem.
   3. Se desejar, fixe em paraformaldeído / PBS a 4% por 15 min, enxágue 2x por 5 min em PBS e transfira para glicerol / PBS a 50% para imagens posteriores. Mantenha as placas fixas protegidas da luz a 4 °C (estáveis por até 1 semana ou mais).
4. Imagens ao vivo
   NOTA: Aplique qualquer método preferido de aquisição e análise de imagens neste estágio.
   1. Carregue a placa em um microscópio de alto conteúdo. Execute uma placa de teste inicial para otimizar e salvar os parâmetros de imagem, incluindo ampliação, foco, tempos de exposição (Hoechst e FITC) e intervalos antes da execução de amostras experimentais. Salve os parâmetros para recarregar com cada placa subsequente.
      NOTA: Para análise quantitativa, defina o tempo de exposição para a carga de importação fluorescente (FITC) bem abaixo da saturação no estado estacionário ou no último ponto de tempo a ser usado. Estabeleça isso usando a placa de teste, visando a saturação semimáxima para permitir variações de intensidade em condições experimentais. Colete as imagens Hoechst para cada quadro e ponto de tempo para permitir a identificação nuclear durante a análise automatizada subsequente.
   2. Ajuste o deslocamento de foco, se necessário, usando Hoechst como comprimento de onda de foco e execute o protocolo de imagem. Colete as imagens a cada 5 min por 30 min. Ajuste o intervalo e o tempo de reação conforme necessário com base na velocidade de imagem e na cinética da reação de importação de interesse.

5. Análise de imagem

1. Na caixa de diálogo Placa de revisão do microscópio, abra as imagens Hoechst e FITC a partir de um quadro representativo. Na guia Executar análise , selecione o módulo Translocation-Enhanced e defina as configurações. Defina Hoechst como a imagem do compartimento e FITC como a imagem da sonda de translocação.
2. Sob os compartimentos, ajuste a largura nuclear aproximada, a intensidade acima do fundo local e a área mínima/máxima. Ative os compartimentos de toque separados automaticamente , pois os neurônios tendem a se agrupar. Exiba os resultados selecionando Execução de teste. Ajuste as configurações para maximizar a precisão da identificação de núcleos neuronais e, ao mesmo tempo, limitar a inclusão errônea de núcleos não neuronais ou detritos.
   NOTA: A contaminação glial, se presente, normalmente pode ser excluída nesta etapa com base no tamanho do núcleo. A determinação das configurações ideais de identificação do compartimento é uma compensação entre a precisão e o número de células e deve ser definida empiricamente, dependendo do ensaio, do tipo de célula e da densidade da cultura. Parâmetros rigorosos omitem várias células, mas incluem menos erros, enquanto parâmetros liberais serão mais inclusivos, mas contêm mais erros. Se forem incluídas diferentes populações de células (ou seja, mutantes de doenças) ou tratamentos que possam afetar o tamanho nuclear, recomendamos definir parâmetros de tamanho/intensidade que sejam amplos o suficiente para acomodar todas as condições para evitar a necessidade de vários conjuntos de parâmetros em um experimento.
3. Para evitar artefatos da borda nuclear, defina regiões de medição vários pixels dentro e fora da borda do compartimento definida pela coloração de Hoechst. Dependendo da ampliação e do compartimentalização, defina de 2 a 4 pixels para a distância da região interna e de 1 a 2 pixels para a distância da região externa. Ajuste a largura da região externa (1-2 pixels).
4. Selecione o método de estimativa de fundo desejado (recomenda-se o padrão de Constante Automática ). Em Configurar registro de dados, selecione os parâmetros de saída desejados, incluindo intensidade interna média, intensidade externa média e intensidade média interna/externa (a relação nuclear para citoplasmática (N/C)). Salve os parâmetros de análise.
   NOTA: A inclusão de controles internos positivos e negativos em cada experimento é fortemente encorajada para garantir que os parâmetros maximizem a sensibilidade para detectar o evento biológico de interesse.
5. Use a caixa de diálogo Utilitários de placa para executar a análise na(s) placa(s) desejada(s) usando os parâmetros salvos e exportar as medições.
6. Revise e resuma os dados pela condição de tratamento. OPÇÃO: Aplique filtros para remover dados não fisiológicos, como intensidade da sonda = 0 e extremos da relação N/C (ou seja, <0,1 e >100). Aplique igualmente quaisquer filtros em todas as condições e experimentos.
7. Como uma correção adicional para a fluorescência da linha de base, normalize os dados para os poços de controle nos quais o lisado e o ER foram omitidos. Para facilitar as comparações entre réplicas biológicas (ou seja, preparações de cultura neuronal independentes), expresse os dados finais de importação nuclear como uma porcentagem do tempo 0.

A permeabilização seletiva da membrana plasmática (Figura 1A) é a etapa mais crítica do protocolo e deve ser verificada antes de prosseguir com a análise da importação nuclear. Devido às variações entre cada preparação de cultura, uma placa de titulação inicial é rotineiramente executada para identificar as concentrações ideais específicas do lote de tampão Tris-HCl hipotônico e almofada BSA, conforme descrito na etapa 3. As células sub e superpermeabilizadas são prontamente identificadas por microscopia confocal (Figura 1B) devido à falta de penetração de dextrana 70 kD no compartimento citoplasmático ou presença de dextrana nos compartimentos citoplasmático e nuclear, respectivamente. Em condições ideais, a maioria das células (≥80%) mostra 70 kD de dextrano ao redor, mas não atravessando a membrana nuclear.

Após a otimização da permeabilização, a próxima fase crítica, descrita na etapa 4, é estabelecer que a importação nuclear de carga fluorescente depende da energia e do receptor de transporte (Figura 2A). Os controles sem ERM e WCE (fonte de importinas e proteínas do ciclo de Ran) devem mostrar vestígios, se houver, acúmulo nuclear de carga fluorescente (Figura 2B, C). A importação deve ser bloqueada pelos inibidores de importação nuclear relevantes. Esses controles devem ser validados para cada carga para verificar se a importação nuclear facilitada está ocorrendo pelo mecanismo esperado. Uma vez validado o ensaio de transporte nuclear, podem ser aplicadas perturbações experimentais dependendo da questão de interesse.

Figura 1: Permeabilização seletiva da membrana plasmática em neurônios corticais primários de camundongos. (A) Esquema de permeabilização neuronal usando o Tris-HCl hipotônico com almofada BSA, seguido de validação com dextrana de 70 kD marcada com vermelho Texas. (B) Imagens confocais de neurônios subpermeabilizados em que a membrana plasmática permanece intacta, restringindo a entrada de dextrano fluorescente (setas); neurônios superpermeabilizados nos quais o dextrano entra livremente no núcleo (asteriscos); e neurônios permeabilizados de maneira ideal nos quais o dextrano envolve, mas não entra no núcleo. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Validação da importação nuclear dependente de energia e importina β de Rango em neurônios corticais primários de camundongos permeabilizados. (A) Esquema da reação de importação nuclear em neurônios permeabilizados. (B) Análise automatizada da razão nuclear para citoplasmática (N / C) de Rango. A média ± SEM é mostrada para n = 3 réplicas biológicas (culturas neuronais independentes), cada uma contendo duas réplicas técnicas (poços) por condição ou aproximadamente 400 neurônios. (C) Imagens confocais da importação nuclear de Rango mostrando a necessidade de extrato de células inteiras (WCE) e mistura de regeneração de energia (ERM) e bloqueio de importação por importazol (IPZ, 100 μM). Os parâmetros de aquisição confocal foram mantidos constantes em todas as condições. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O protocolo detalhado acima fornece um método confiável e reprodutível para permeabilizar seletivamente a membrana plasmática de neurônios corticais primários de camundongos para análise de importação nuclear. Aqui, é mostrada uma aplicação do método para análise de importação nuclear de uma carga β de importação direta (Rango), mas essa mesma abordagem pode ser usada para analisar a importação passiva e ativa de uma ampla gama de cargas fluorescentes. A permeabilização permite a manipulação precisa da reação de transporte de maneiras que não são viáveis em células intactas, como descrevemos recentemente para proteínas de repetição de dipeptídeos C9orf72 mutantes (DPRs) implicadas em ALS e FTD¹⁴. As proteínas DPR sintéticas foram pré-incubadas com lisados de transporte antes do início da reação de importação nuclear, facilitando a análise da dependência da concentração e do comprimento do bloqueio de importação nuclear por DPRs contendo arginina. Nos estudos de fracionamento, agregados induzidos por DPR foram incluídos ou excluídos do lisado de transporte para analisar as consequências funcionais para a importação nuclear. Os DPRs também foram pré-incubados com núcleos para verificar os efeitos na permeabilidade dos poros nucleares. Estes são alguns exemplos de variações do ensaio que podem ser aplicadas ao estudo de proteínas desordenadas e propensas à agregação, comumente implicadas na neurodegeneração. Por se tratar de um sistema artificial in vitro , os achados devem ser cuidadosamente interpretados dentro das limitações do ensaio.

O sucesso do protocolo depende criticamente da permeabilização seletiva da membrana plasmática, na medida em que é recomendada a otimização cuidadosa das condições para cada lote de neurônios primários. É importante ressaltar que este protocolo é específico para neurônios corticais primários de camundongos. Também realizamos testes preliminares bem-sucedidos com neurônios motores espinhais primários de camundongos, mas alertamos que o método de permeabilização hipotônica não é confiável em culturas de neurônios espinhais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (não mostrado). Se a importação nuclear ativa não for observada, apesar da permeabilização ideal, os esforços de solução de problemas devem se concentrar em garantir preparações de carga fluorescente e WCE concentradas e de alta qualidade. Devido ao potencial de variação de lote para lote, é melhor preparar e congelar grandes estoques de alíquotas de uso único e evitar comparar os resultados em diferentes lotes. O uso de imagens e análises automatizadas de alto conteúdo permite imagens rápidas da cinética de importação nuclear em centenas de neurônios por poço, com o mínimo de entrada do investigador. Se a imagem de alto rendimento não estiver disponível, as reações de importação nuclear contendo Rango e cargas relacionadas podem ser corrigidas¹⁴ para métodos alternativos de imagem e análise. Se a imagem e a análise manuais forem realizadas, os investigadores devem ser cegos para a condição do tratamento para evitar viés.

Prevemos que este método será amplamente aplicável a estudos de transporte nuclear passivo e ativo em neurônios primários. Como descrito acima, as células permeabilizadas são um modelo útil para o estudo do efeito de proteínas desordenadas e propensas à agregação, comumente implicadas na neurodegeneração e cada vez mais suspeitas de interromper o transporte nucleocitoplasmático 20,21,22. A comparação entre diferentes tipos de células também pode melhorar a compreensão das diferenças potenciais na dinâmica de transporte relacionadas a diferenças específicas da célula na composição do complexo de poros nucleares^11,12. Até o momento, nenhuma alteração nas concentrações de componentes foi necessária na mistura de reação de transporte para neurônios permeabilizados versus células HeLa¹⁴. No entanto, nenhuma comparação formal foi feita dos requisitos mínimos de transporte e eficiência em HeLa permeabilizada versus neurônios ou glia. Além de variar o tipo de célula permeabilizada, a utilização de neurônios ou mesmo tecido do SNC como fonte de extrato citoplasmático ou de células inteiras, variando assim a fonte de fatores de transporte solúveis, pode fornecer uma abordagem adicional para testar questões relevantes para a doença.

Os autores não têm nada a divulgar.

Este trabalho foi apoiado pelo NINDS K08NS104273 (para LRH).