Ensayos de transporte nuclear en neuronas corticales de ratón permeabilizadas

Hemos desarrollado un método fiable de permeabilización selectiva de la membrana plasmática de neuronas corticales primarias de ratón para el análisis automatizado de alto contenido del transporte nucleocitoplasmático neuronal.

La interrupción del transporte nucleocitoplasmático está cada vez más implicada en la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas. Además, existe un creciente reconocimiento de las diferencias específicas de las células en la estructura del complejo de poros nucleares, lo que provoca la necesidad de adaptar los métodos de transporte nuclear para su uso en las neuronas. Los ensayos de células permeabilizadas, en los que la membrana plasmática es perforada selectivamente por la digitonina, se utilizan ampliamente para estudiar el transporte nuclear pasivo y activo en líneas celulares inmortalizadas, pero no se han aplicado a los cultivos neuronales. En nuestros primeros intentos, observamos la rápida pérdida de la integridad de la membrana nuclear en las neuronas corticales primarias de ratón expuestas incluso a bajas concentraciones de digitonina. Planteamos la hipótesis de que las membranas nucleares neuronales pueden ser excepcionalmente vulnerables a la pérdida de soporte citoplasmático. Después de probar múltiples enfoques para mejorar la estabilidad nuclear, observamos una integridad nuclear óptima después de la lisis hipotónica en presencia de un cojín concentrado de albúmina sérica bovina. Los núcleos neuronales preparados por este enfoque importan de manera confiable carga fluorescente recombinante de una manera dependiente de la energía, lo que facilita el análisis de la importación nuclear mediante microscopía de alto contenido con análisis automatizado. Anticipamos que este método será ampliamente aplicable a los estudios de transporte nuclear pasivo y activo en neuronas primarias.

La interrupción del transporte nucleocitoplasmático, el tráfico regulado de proteínas y ARN entre el núcleo y el citoplasma, está cada vez más implicada en la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas (recientemente revisado¹). Nosotros y otros hemos reportado interrupción estructural y funcional del aparato de transporte nucleocitoplasmático en tejido postmortem y modelos animales de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y demencia frontotemporal (DFT) C9orf72, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Huntington 2,3,4,5 . Los mecanismos y las consecuencias funcionales de la interrupción del transporte nucleocitoplasmático para la neurodegeneración, y los enfoques para el rescate terapéutico, son áreas de investigación en curso.

Los poros nucleares son grandes complejos transmembrana de ~30 proteínas nucleoporinas que permiten la difusión de moléculas pequeñas a través de la membrana nuclear, pero restringen cada vez más el paso de cargas >40 kD a través de una barrera de permeabilidad de nucleoporinas ricas en fenilalanina-glicina (FG) en el canal central⁶. Los cargamentos más grandes que contienen secuencias de señales de localización nuclear (NLS) o señales de exportación nuclear (NES) experimentan un transporte activo, mediado por receptores, a través del poro a través de receptores de transporte nuclear (importinas y exportinas) y un gradiente pronunciado de la pequeña GTPasa Ran a través de la membrana nuclear (revisado recientemente⁷). Se ha desarrollado una amplia gama de métodos para analizar la dinámica del transporte nuclear en células cultivadas, incluido el tráfico de cargas endógenas y construcciones de reporteros marcados que sirven como sustratos para las principales subclases de receptores de transporte. Tales enfoques se han adaptado fácilmente a las neuronas ^2,5,8 y proporcionan una lectura de las perturbaciones del transporte nuclear en el contexto de una célula viva e intacta. Sin embargo, en los ensayos con células vivas, la capacidad de manipular directamente las reacciones de transporte nuclear o investigarlas de forma aislada de otros procesos celulares es limitada.

En los ensayos de células permeabilizadas, la membrana plasmática se perfora selectivamente y el citoplasma se libera, dejando la envoltura nuclear y los complejos de poros nucleares intactos y capaces de realizar un transporte bidireccional pasivo o dependiente de la energía ^9,10. Tales reacciones de transporte pueden reconstituirse fácilmente mediante la adición de lisados de células completas, fracciones citoplasmáticas o proteínas de transporte nuclear recombinantes purificadas y sus cargas. Por lo tanto, los ensayos de células permeabilizadas permiten una amplia gama de investigaciones bioquímicas o biofísicas, incluida la administración de proteínas recombinantes o sintéticas y ARN relevantes para el estudio de enfermedades neurodegenerativas.

Dados los informes de diferencias específicas de la célula en la estructura del complejo de poros nucleares y la dinámica de transporte^11,12, nos propusimos adaptar el ensayo de células permeabilizadas para su uso en cultivos neuronales primarios. Aunque se utiliza ampliamente para analizar el transporte nuclear en líneas celulares inmortalizadas, a pesar de la búsqueda exhaustiva de la literatura, no encontramos informes publicados de permeabilización de la membrana plasmática neuronal que verificara la preservación de la integridad de la membrana nuclear. La mayoría de los protocolos se basan en la digitonina, un detergente que se dirige a la composición única de colesterol de la membrana plasmática, para perforar la membrana nuclear y dejar la membrana nuclear intacta^. Nuestros intentos iniciales utilizando digitonina en neuronas corticales primarias de ratón mostraron una pérdida inmediata de la integridad de la membrana nuclear, evidenciada por la difusión de un dextrano fluorescente de 70 kD en el núcleo. Planteamos la hipótesis de que la ruptura de la envoltura nuclear podría ser causada por una perturbación mecánica por la pérdida del soporte citoplasmático, y probamos múltiples métodos de optimización, incluido el aglomeramiento molecular, la estabilización del citoesqueleto y métodos alternativos de lisis celular. Aquí, detallamos un método de permeabilización hipotónica rápida utilizando un cojín concentrado de albúmina sérica bovina (BSA) para proteger los núcleos neuronales y facilitar el análisis posterior de la importación nuclear neuronal. Recientemente utilizamos este método para evaluar el mecanismo de disrupción de la proteína de repetición de dipéptidos en C9orf72-ALS/FTD¹⁴ y anticipamos que será ampliamente aplicable a futuros estudios de transporte nuclear pasivo y activo en neuronas primarias.

En primer lugar, el protocolo describe la generación de cultivos neuronales primarios (paso 1) y la preparación de materiales para el ensayo de transporte (paso 2), seguido del ensayo de transporte en sí (pasos 3-4) y la adquisición y análisis de imágenes (paso 5). Todos los métodos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) de la Universidad Johns Hopkins.

1. Cultivos primarios de neuronas corticales de ratón

1. Prepare las soluciones de stock.
   1. Tampón de disección: Combine 50 mL de HBSS 10x, 15 mL de glucosa 1 M (en dH₂O), 5 mL de HEPES 1 M, 5 mL de piruvato de sodio 100 mM y 5 mL de penicilina-estreptomicina 100x. Lleve el volumen a 500 mL con dH₂O. Filtro estéril y almacene a 4 °C.
   2. Papaína: Diluir la papaína a 30 mg/mL con tampón de disección. Conservar a 4 °C.
   3. DNasa: Diluir la DNasa I a 10 mg/mL con tampón de disección. Alícuota y almacenar a -20 °C.
   4. Medio de siembra: Agregue 5% de suero fetal bovino (FBS), 2% B-27, 1% de Glutamax y 1% de penicilina-estreptomicina al medio neurobasal. Filtrar estérilmente y almacenar a 4 °C.
   5. Medio de alimentación: Agregue 2% de B-27, 1% de Glutamax y 1% de penicilina-estreptomicina al medio neurobasal. Conservar a 4 °C.
2. Cubre los platos.
   1. Cubra las placas de 96 pocillos con fondo de vidrio óptico con poli-D-lisina (20 μg/mL) y laminina (1:100) en dH₂O. Coloque la placa en una incubadora durante la noche.
   2. El día de la disección, enjuague los pocillos tres veces con dH₂O estéril y reemplácelos con medio Neurobasal. Equilibre en una incubadora durante al menos 30 minutos.
3. Disecciona y digiere las cortezas.
   NOTA: Lleve a cabo la disección en un banco limpio utilizando herramientas esterilizadas en autoclave para evitar la contaminación del cultivo.
   1. Eutanasia de la hembra embarazada E15-16 C57BL/6J por luxación cervical. Rocíe el abdomen con etanol al 70%. Trabaja rápidamente. Use tijeras y pinzas dentadas para hacer una incisión abdominal en la línea media, extirpar el útero y luego transferir los embriones del saco amniótico a una placa de Petri. Decapitar los embriones con unas tijeras y recoger las cabezas en una placa de Petri de 10 cm que contenga tampón de disección.
   2. Bajo un microscopio de disección, use pinzas finas para extraer el cráneo y despegar las meninges. Transfiera cerebros enteros a una placa de Petri fresca de 10 cm que contenga tampón de disección. Separa los hemisferios y retira las estructuras subcorticales.
   3. Picar las cortezas con una cuchilla de afeitar estéril y transferirlas a un tubo cónico que contenga 5 ml de tampón de disección. Añadir 100 μL de papaína (caldo 30 mg/mL, concentración final 0,6 mg/mL) y 50 μL de DNasa (caldo 10 mg/mL, concentración final 0,1 mg/mL). Digirir en un baño de agua a 37 °C durante 10 min.
      NOTA: La digestión más allá de los 10 minutos es perjudicial para la supervivencia celular.
   4. Retire el sobrenadante y lave dos veces con 10 mL de medio de recubrimiento para detener la digestión. Deje que el tejido se asiente por gravedad entre cada lavado.
   5. Triturar suavemente en un medio de recubrimiento de 2 ml con pipeta P1000 hasta que desaparezcan trozos grandes de tejido (aproximadamente 20 veces). Agregue otros 8 mL de medio de recubrimiento para llevar el volumen a aproximadamente 10 mL y pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 μm.
4. Placa y mantenimiento de las neuronas.
   1. Centrifugar a 200 x g durante 5 min. Vuelva a suspender las células en un medio de recubrimiento precalentado. Cuente las células y diluya hasta 500.000 células/mL en el medio de siembra. Invierta suavemente para mezclar y transferir a un depósito multicanal estéril.
   2. Aspirar el medio neurobasal de los pocillos y añadir inmediatamente 100 μL de células por pocillo con una pipeta multicanal (50.000 células/pocillo). No permita que los pozos recubiertos se sequen.
   3. Después de 24 h de disección, cambie el 50% del medio con el medio de alimentación. Continúe con un cambio medio del 50% cada dos días hasta el día 5-7 para realizar los ensayos in vitro .

2. Preparación de los componentes del ensayo de transporte nuclear

1. Búfer de transporte (TRB, adaptado de¹⁵)
   1. Para preparar 5x TRB, disuelva 100 mM de HEPES, 550 mM de KOAc, 10 mM de Mg(OAc)₂, 25 mM de NaOAc, 2,5 mM de EGTA y 1,25 M de sacarosa en dH₂O. Ajuste el pH a 7,3 y almacene el tampón a 4 °C.
   2. El día del experimento de transporte, prepare 1x TRB-BSA. Diluir 5x TRB en dH₂O, añadir cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA, 2 mM de DTT y 50 mg/mL de BSA.
2. Mix de regeneración energética (ERM, adaptado de ^9,16)
   1. Para preparar 20x ERM, disuelva 2mM de sal de litio ATP, 2 mM de sal de litio GTP, 80 mM de fosfato de creatina y 400 U/mL de creatina quinasa en 1x TRB.
   2. Congele las alícuotas de un solo uso a -20 °C.
3. Preparación de extracto de células enteras (WCE, fuente de receptores de transporte y proteínas del ciclo de Ran).
   NOTA: Se puede utilizar un extracto citoplasmático o de células enteras (WCE), dependiendo de los objetivos experimentales. Aquí, se describe la preparación de WCE utilizada en los ensayos iniciales de transporte de neuronas¹⁰.
   1. Cultive HEK293T células hasta la confluencia en quince placas de cultivo de 150 mm. Separar con tripsina-EDTA, resuspender en medios que contengan un 10% de suero fetal bovino para inhibir la tripsina y pellets a 200 x g durante 5 min. Vuelva a suspender las células en 10 ml de TRB 1x helado con un cóctel de inhibidores de proteasa recién añadido.
   2. Sonicado en hielo, 3 x 10 pulsos, utilizando un sonicador de sonda de mano. Clarificar por centrifugación a 14.000 x g durante 15 min a 4 °C.
   3. Mida la concentración de proteínas (objetivo 8-10 mg/mL) y congele rápidamente las alícuotas de un solo uso en nitrógeno líquido antes del almacenamiento a -80 °C.
4. Carga nuclear recombinante de importación
   NOTA: El protocolo de transporte de los pasos 3 a 5 puede adaptarse a cualquier carga de transporte nuclear fluorescente, a fin de interrogar la vía de transporte nuclear activa o pasiva de interés. Aquí, el protocolo describe la expresión e importación nuclear de Rango (importación regulada por Ran β carga), que consiste en el dominio de unión a la importina β de la importina α1 flanqueado por las proteínas fluorescentes CyPet e YPet ^14,17. Rango es un sensor versátil que se puede utilizar para FRET, así como para ensayos de importación nuclear, donde funciona como importación directa β carga.
   1. Transforme las células de E. coli BL21 (DE3) con el plásmido Rango (que contiene una etiqueta N-terminal 6-His) por choque térmico de la siguiente manera. Descongele una alícuota de 50 μL de células BL21(DE3) en hielo. Combinar con 100-200 ng de plásmido. Mezclar golpeando el tubo 4-5 veces y luego incubar en hielo durante 30 minutos antes de colocarlo en una placa a 42 °C durante 40 s. Transfiera inmediatamente a hielo durante otros 2-5 minutos.
   2. Añadir 900 μL de medio SOC a temperatura ambiente e incubar en un agitador a 37 °C durante 1 h antes de esparcir las células en una placa de agar precalentada (agar al 1,5%, medio LB, 100 μg/mL de ampicilina). Incubar la placa durante la noche a 37 °C. Guarde la placa a 4 °C durante un máximo de 1 semana o utilícela inmediatamente para la producción de proteínas.
   3. Inicie la producción de proteínas inoculando tres cultivos iniciadores de 25 mL en tubos de 50 mL con un número creciente de colonias (~3-10) de la placa BL21(DE3). Después de la incubación durante la noche a 37 °C en un agitador, seleccione los cultivos con DE_{600 nm} < 1,0 para inocular un cultivo de 1 L en medio LB utilizando un matraz Fernbach de 2,8 L sin deflectores. Crecer a 37 °C hasta alcanzar un diámetro exterior de_{600 nm} = 0,1-0,3.
      NOTA: El uso de placas de agar BL21(DE3) LB más antiguas o la alta densidad de cultivos iniciadores (OD_{600 nm} >1.0) podría reducir el rendimiento y la pureza de la preparación de proteínas.
   4. Enfriar a temperatura ambiente (22-25 °C) colocando sobre hielo. Inducir la expresión de proteínas con 0,3 mM de IPTG (concentración final) e incubar en un agitador (80-120 rpm) a temperatura ambiente durante 12-14 h.
   5. Recoja las células por centrifugación (6.000 x g, 15 min, 4 °C) y vuelva a suspender en 30 mL de imidazol 10 mM helado en PBS (pH 7,4), suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA. Lisar en dos pasadas a través de una celda de presión francesa helada y clarificar el lisado por centrifugación (16.000 x g, 40 min, 4 °C).
   6. Incubar el lisado con resina de agarosa de afinidad de níquel de alto flujo (30-60 min, 4 °C), utilizando 1 mL de resina por 1 L de cultivo de E. coli . Coloque la resina en las columnas de cromatografía, lave con 10-20 volúmenes de imidazol/PBS 10 mM helado (pH 7,4). Elute Rango con incrementos de 25 mM de imidazol/PBS (25-200 mM, pH 7,4), utilizando un volumen de lecho de 5 veces en cada paso.
   7. Utilice SDS-PAGE para seleccionar y agrupar los lotes con la mayor pureza.
   8. Prepare el tampón XB disolviendo 10 mM de HEPES, 100 mM de KCl, 10 mM de CaCl₂, 1 mM de MgCl₂ y 50 mM de sacarosa en dH₂O. Ajuste el pH a 7,7.
   9. Diálisis de la proteína en tampón XB y concentración por centrifugación (7500 x g, 4 °C) en un dispositivo de ultrafiltración con un corte de peso molecular de 30 kD.
   10. Mida la concentración de proteínas mediante el método Bradford u otro método preferido, y congele las alícuotas de un solo uso en nitrógeno líquido antes de almacenarlas a -80 °C.

3. Determinación de las condiciones óptimas de permeabilización de la membrana plasmática

NOTA: Debido a las variaciones entre cada lote de neuronas, optimice las condiciones de permeabilización para cada lote de neuronas. Realice esto el mismo día antes de realizar los ensayos de transporte nuclear.

1. En una placa de estadificación de plástico de 96 pocillos, prepare una dilución seriada de Tris-HCl pH 7.5 (para causar hinchazón osmótica), a 0 μM, 10 μM, 20 μM y 40 μM en cada una de las tres concentraciones de BSA: 50 mg/mL, 100 mg/mL y 150 mg/mL (para apiñamiento molecular/soporte mecánico). Precalentar las soluciones a 37 °C.
2. Enjuague las neuronas una vez en PBS precalentado. Retire el PBS y transfiera Tris/BSA de la placa de preparación. Regrese a la incubadora durante 4 minutos.
3. Retirar de la incubadora y colocar la placa de cultivo sobre hielo. Enjuague 2 x 5 min en 1x TRB-BSA (como se preparó en el paso 2.1.2).
4. Después del enjuague final, agregue 70 kD de dextrano marcado con Texas Red (0,6 mg/mL) y Hoechst (1:10,000) en 1x TRB-BSA. Deje el plato en el banco a temperatura ambiente durante 15 min, protegido de la luz.
5. Imagen utilizando un microscopio confocal para identificar el tampón y la concentración de BSA en la que el porcentaje de permeabilización de la membrana plasmática es el más alto, pero la membrana nuclear aún restringe la entrada del dextrano de 70 kD (objetivo ≥ 80%). Utilice estas condiciones para experimentos posteriores.

4. Ensayo de importación nuclear

1. Preparar las reacciones de transporte
   NOTA: Para permitir que todas las reacciones en la placa se inicien simultáneamente, prepare la mezcla de reacción en una placa de almacenamiento de plástico de 96 pocillos sobre hielo, antes de la permeabilización de las neuronas. Realizar un mínimo de dos réplicas técnicas por condición. Incluya controles en cada placa.
   1. Prepare la mezcla de reacción base que consiste en 2,5 mg/mL de WCE, 1x ERM, carga fluorescente (200 nM Rango) y Hoechst 33342 (10 mg/mL, 1:10.000) en 1x TRB-BSA, suficiente para 50 μL por pocillo. OPCIÓN: Incluya 70 kD de dextrano marcado en rojo Texas para permitir el monitoreo de la integridad de los poros nucleares durante toda la reacción de transporte, teniendo en cuenta que se necesita microscopía confocal para obtener imágenes de la exclusión del dextrano nuclear.
      NOTA: La concentración de WCE proporcionada es un punto de partida razonable para la optimización del ensayo. Realizar pruebas empíricas de cada lote de WCE para determinar la concentración óptima requerida para la importación nuclear eficiente de la carga deseada. Evite combinar datos de réplicas preparadas con diferentes lotes de WCE, ya que la eficiencia de la importación puede variar.
   2. Prepare los controles que incluyan (1) Carga sola: Rango, pero sin WCE o ERM y (2) Inhibidor: carga fluorescente, ERM, WCE y 100 μM de importazol (IPZ, un inhibidor de molécula pequeña de la importina^{β 18}). Como inhibidor alternativo, utilizar 0,8 mg/mL de aglutinina de germen de trigo (WGA)¹⁹.
      NOTA: Equilibre los inhibidores en la mezcla de ensayo que contiene WCE durante al menos 30 minutos antes de iniciar el transporte. Para una inhibición máxima, los pasos de enjuague posteriores a la permeabilización en los pocillos correspondientes también deben incluir el inhibidor.
2. Permeabilizar y enjuagar las neuronas
   1. Permeabilice las neuronas de acuerdo con el protocolo óptimo y específico del lote identificado en el paso 3.
   2. Retire la placa de cultivo de la incubadora y colóquela inmediatamente sobre hielo. Enjuague 2 veces durante 5 minutos en 1x TRB-BSA. Incluya un inhibidor en los enjuagues de los pozos designados.
3. Ejecute la reacción de transporte.
   1. Después del enjuague final, retire 1x TRB-BSA. Trabajando rápidamente, utilice una pipeta multicanal (50 μL/pocillo) para transferir las reacciones de transporte premezcladas a las células permeabilizadas.
   2. Cargue inmediatamente la placa en un microscopio de alto contenido a temperatura ambiente para iniciar la obtención de imágenes de lapso de tiempo (consulte el paso 4.4) o coloque la placa en el banco, protegida de la luz, y permita que la reacción continúe durante el período de tiempo deseado (por ejemplo, 30-120 min) antes de la fijación y la obtención de imágenes.
   3. Si lo desea, fije en paraformaldehído/PBS al 4% durante 15 minutos, enjuague 2 veces durante 5 minutos en PBS y transfiera a glicerol/PBS al 50% para obtener imágenes posteriores. Mantenga las placas fijas protegidas de la luz a 4 °C (estables hasta 1 semana o más).
4. Imágenes en vivo
   NOTA: Aplique cualquier método de adquisición y análisis de imágenes preferido en esta etapa.
   1. Cargue la placa en un microscopio de alto contenido. Ejecute una placa de prueba inicial para optimizar y guardar los parámetros de imagen, incluidos el aumento, el enfoque, los tiempos de exposición (Hoechst y FITC) y los intervalos antes de ejecutar muestras experimentales. Guarde los parámetros para volver a cargar con cada placa subsiguiente.
      NOTA: Para el análisis cuantitativo, establezca el tiempo de exposición para la carga de importación fluorescente (FITC) muy por debajo de la saturación en estado estacionario o el último punto de tiempo que se utilizará. Establezca esto utilizando la placa de prueba, apuntando a la saturación media máxima para permitir variaciones en la intensidad en las condiciones experimentales. Recopile las imágenes de Hoechst para cada fotograma y punto de tiempo para permitir la identificación nuclear durante el análisis automatizado posterior.
   2. Ajuste el desplazamiento del enfoque, si es necesario, utilizando Hoechst como longitud de onda de enfoque y ejecute el protocolo de imágenes. Recoge las imágenes cada 5 minutos durante 30 minutos. Ajuste el intervalo y el tiempo de reacción según sea necesario en función de la velocidad de imagen y la cinética de la reacción de importación de interés.

5. Análisis de imágenes

1. En el cuadro de diálogo Placa de revisión del microscopio, abra las imágenes de Hoechst y FITC de un marco representativo. En la pestaña Ejecutar análisis , seleccione Módulo mejorado con transubicación y configure los ajustes. Establezca Hoechst como la imagen del compartimento y FITC como la imagen de la sonda de translocación.
2. En los compartimentos, ajuste el ancho nuclear aproximado, la intensidad sobre el fondo local y el área mínima/máxima. Active los compartimentos táctiles separados automáticamente a medida que las neuronas tienden a agruparse. Para ver los resultados, seleccione Ejecutar prueba. Ajuste la configuración para maximizar la precisión de la identificación de los núcleos neuronales y, al mismo tiempo, limitar la inclusión errónea de núcleos no neuronales o desechos.
   NOTA: La contaminación glial, si está presente, generalmente se puede excluir en este paso según el tamaño nuclear. La determinación de la configuración óptima de identificación de compartimentos es un compromiso entre la precisión y el número de células, y debe establecerse empíricamente en función del ensayo, el tipo de célula y la densidad de cultivo. Los parámetros estrictos omitirán numerosas celdas, pero incluirán menos errores, mientras que los parámetros liberales serán más inclusivos pero contendrán más errores. Si se incluyen diferentes poblaciones celulares (es decir, mutantes de enfermedades) o tratamientos que pueden afectar el tamaño nuclear, recomendamos establecer parámetros de tamaño/intensidad que sean lo suficientemente amplios como para adaptarse a todas las condiciones y evitar la necesidad de múltiples conjuntos de parámetros dentro de un experimento.
3. Para evitar artefactos desde el borde nuclear, defina regiones de medición de varios píxeles dentro y fuera del borde del compartimento definido por la tinción de Hoechst. En función de la ampliación y la agrupación, establezca de 2 a 4 píxeles para la distancia de la región interior y de 1 a 2 píxeles para la distancia de la región exterior. Ajuste el ancho de la región exterior (1-2 píxeles).
4. Seleccione el método de estimación de fondo deseado (se recomienda el valor predeterminado de Constante automática ). En Configurar registro de datos, seleccione los parámetros de salida deseados, incluida la intensidad interna media, la intensidad externa media y la intensidad media interna/externa (la relación nuclear a citoplasmática (N/C)). Guarde los parámetros de análisis.
   NOTA: Se recomienda encarecidamente la inclusión de controles internos positivos y negativos dentro de cada experimento para garantizar que los parámetros maximicen la sensibilidad para detectar el evento biológico de interés.
5. Utilice el cuadro de diálogo Utilidades de placas para ejecutar análisis en la(s) placa(s) deseada(s) utilizando los parámetros guardados y exportar las mediciones.
6. Revise y resuma los datos según la condición de tratamiento. OPCIÓN: Aplique filtros para eliminar datos no fisiológicos, como la intensidad de la sonda = 0 y los extremos de la relación N/C (es decir, <0,1 y >100). Aplique los filtros de manera equitativa en todas las condiciones y experimentos.
7. Como corrección adicional para la fluorescencia basal, normalice los datos a los pocillos de control en los que se omitieron el lisado y el RE. Para facilitar las comparaciones entre réplicas biológicas (es decir, preparaciones de cultivos neuronales independientes), exprese los datos finales de importación nuclear como un porcentaje de tiempo 0.

La permeabilización selectiva de la membrana plasmática (Figura 1A) es el paso más crítico del protocolo y debe verificarse antes de proceder con el análisis de la importación nuclear. Debido a las variaciones entre cada preparación de cultivo, se ejecuta rutinariamente una placa de valoración inicial para identificar las concentraciones óptimas y específicas del lote de tampón hipotónico de Tris-HCl y el cojín BSA, como se describe en el paso 3. Las células subpermeabilizadas y sobrepermeabilizadas se identifican fácilmente mediante microscopía confocal (Figura 1B) debido a la falta de penetración de dextrano de 70 kD en el compartimento citoplasmático o a la presencia de dextrano dentro de los compartimentos citoplasmático y nuclear, respectivamente. En condiciones óptimas, la mayoría de las células (≥80%) muestran 70 kD de dextrano rodeando pero no atraviesan la membrana nuclear.

Tras la optimización de la permeabilización, la siguiente fase crítica, descrita en el paso 4, consiste en establecer que la importación nuclear de carga fluorescente depende de la energía y del receptor de transporte (Figura 2A). Los controles que carecen de ERM y WCE (fuente de importinas y proteínas del ciclo de Ran) deben mostrar trazas, si las hay, de acumulación nuclear de carga fluorescente (Figura 2B, C). La importación debe ser bloqueada por los inhibidores de importación nuclear pertinentes. Estos controles deben validarse para cada cargamento a fin de verificar que se está facilitando la importación nuclear mediante el mecanismo previsto. Una vez validado el ensayo de transporte nuclear, se pueden aplicar perturbaciones experimentales en función de la cuestión de interés.

Figura 1: Permeabilización selectiva de la membrana plasmática en neuronas corticales primarias de ratón. (A) Esquema de permeabilización neuronal utilizando el Tris-HCl hipotónico con cojín BSA, seguido de validación con dextrano de 70 kD marcado en rojo de Texas. (B) Imágenes confocales de neuronas subpermeabilizadas en las que la membrana plasmática permanece intacta, restringiendo la entrada de dextrano fluorescente (flechas); neuronas sobrepermeabilizadas en las que el dextrano entra libremente en el núcleo (asteriscos); y neuronas óptimamente permeabilizadas en las que el dextrano rodea pero no entra en el núcleo. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Validación de la importación nuclear de Rango dependiente de la energía y la importina β en neuronas corticales primarias de ratón permeabilizadas. (A) Esquema de la reacción de importación nuclear en neuronas permeabilizadas. (B) Análisis automatizado de la relación nuclear a citoplasmática (N/C) de Rango. La media ± SEM se muestra para n = 3 réplicas biológicas (cultivos neuronales independientes), cada una de las cuales contiene dos réplicas técnicas (pozos) por condición o aproximadamente 400 neuronas. (C) Imágenes confocales de la importación nuclear de Rango que muestran la necesidad de extracto de célula completa (WCE) y mezcla de regeneración de energía (ERM), y bloqueo de importación por importazol (IPZ, 100 μM). Los parámetros de adquisición confocal se mantuvieron constantes en todas las condiciones. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El protocolo detallado anteriormente proporciona un método fiable y reproducible para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática de las neuronas corticales primarias de ratón para el análisis de importación nuclear. Aquí se muestra una aplicación del método para el análisis de importaciones nucleares de una importación directa β carga (Rango), pero este mismo enfoque se puede utilizar para analizar la importación pasiva y activa de una amplia gama de cargas fluorescentes. La permeabilización permite una manipulación precisa de la reacción de transporte de formas que no son factibles en células intactas, como describimos recientemente para las proteínas de repetición de dipéptido C9orf72 mutantes (DPR) implicadas en ALS y FTD¹⁴. Las proteínas DPR sintéticas se preincubaron con lisados de transporte antes del inicio de la reacción de importación nuclear, lo que facilitó el análisis de la dependencia de la concentración y la longitud del bloqueo de importación nuclear por DPR que contienen arginina. En los estudios de fraccionamiento, se incluyeron o excluyeron agregados inducidos por DPR del lisado de transporte para analizar las consecuencias funcionales para la importación nuclear. Los DPRs también se preincubaron con núcleos para determinar los efectos sobre la permeabilidad de los poros nucleares. Estos son algunos ejemplos de variaciones del ensayo que se pueden aplicar al estudio de proteínas desordenadas y propensas a la agregación, comúnmente implicadas en la neurodegeneración. Dado que se trata de un sistema artificial in vitro , los hallazgos deben interpretarse cuidadosamente dentro de las limitaciones del ensayo.

El éxito del protocolo depende críticamente de la permeabilización selectiva de la membrana plasmática, hasta el punto de que se recomienda una optimización cuidadosa de las condiciones para cada lote de neuronas primarias. Es importante destacar que este protocolo es específico de las neuronas corticales primarias de ratón. También hemos llevado a cabo pruebas preliminares exitosas con neuronas motoras espinales primarias de ratón, pero advertimos que el método de permeabilización hipotónica no es confiable en cultivos de neuronas espinales derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (no mostrado). Si no se observa una importación nuclear activa, a pesar de una permeabilización óptima, los esfuerzos de solución de problemas deben centrarse en garantizar preparaciones de carga fluorescente y WCE concentradas y de alta calidad. Debido a la posibilidad de variación de un lote a otro, es mejor preparar y congelar grandes existencias de alícuotas de un solo uso y evitar comparar los resultados entre diferentes lotes. El uso de imágenes y análisis automatizados de alto contenido permite obtener imágenes rápidas de la cinética de importación nuclear a través de cientos de neuronas por pocillo, con una intervención mínima del investigador. Si no se dispone de imágenes de alto rendimiento, las reacciones de importación nuclear que contienen Rango y cargas relacionadas son reparables¹⁴ para métodos alternativos de obtención de imágenes y análisis. Si se utilizan imágenes y análisis manuales, los investigadores deben cegar las condiciones del tratamiento para evitar sesgos.

Anticipamos que este método será ampliamente aplicable a los estudios de transporte nuclear pasivo y activo en neuronas primarias. Como se ha descrito anteriormente, las células permeabilizadas son un modelo útil para el estudio del efecto de las proteínas desordenadas y propensas a la agregación, comúnmente implicadas en la neurodegeneración y cada vez más sospechosas de interrumpir el transporte nucleocitoplasmático 20,21,22. La comparación entre diferentes tipos de células también puede mejorar la comprensión de las posibles diferencias en la dinámica de transporte relacionadas con las diferencias específicas de las células en la composición del complejo de poros nucleares^11,12. Hasta el momento, no se ha necesitado ninguna alteración en las concentraciones de componentes en la mezcla de reacción de transporte para las neuronas permeabilizadas frente a las células HeLa¹⁴. Sin embargo, no se realizaron comparaciones formales de los requisitos mínimos de transporte y la eficiencia en HeLa permeabilizado frente a las neuronas o la glía. Además de variar el tipo de célula permeabilizada, la utilización de neuronas o incluso de tejido del SNC como fuente de extracto citoplasmático o de células completas, variando así la fuente de factores de transporte solubles, puede proporcionar un enfoque adicional para evaluar cuestiones relevantes para la enfermedad.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado por NINDS K08NS104273 (a L.R.H.).