Подготовка децеллюляризованных каркасов почек у крыс

Этот протокол вводит метод разработки каркаса с использованием децеллюляризированных почек крыс. Протокол включает процессы децеллюляризации и рецеллюляризации для подтверждения биодоступности. Децеллюляризацию проводят с использованием Тритона Х-100 и додецилсульфата натрия.

Тканевая инженерия является передовой дисциплиной в биомедицине. Методы культивирования клеток могут применяться для регенерации функциональных тканей и органов для замены больных или поврежденных органов. Каркасы необходимы для облегчения генерации трехмерных органов или тканей с использованием дифференцированных стволовых клеток in vivo. В этом отчете мы описываем новый метод разработки васкуляризированных каркасов с использованием децеллюляризованных почек крыс. В этом исследовании использовались восьминедельные крысы Sprague-Dawley, и гепарин вводили в сердце, чтобы облегчить поступление в почечные сосуды, позволяя гепарину перфузировать в почечные сосуды. Брюшную полость открыли, а левую почку собрали. Собранные почки перфузили в течение 9 ч с использованием моющих средств, таких как Triton X-100 и додецилсульфат натрия, для децеллюляризации ткани. Затем децеллюляризованные каркасы почек осторожно промывали 1% пенициллином /стрептомицином и гепарином для удаления клеточного мусора и химических остатков. Ожидается, что трансплантация стволовых клеток с децеллюляризованными сосудистыми каркасами облегчит генерацию новых органов. Таким образом, васкуляризированные каркасы могут обеспечить основу для тканевой инженерии трансплантатов органов в будущем.

Методы культивирования клеток применяются для регенерации функциональных тканей и органов для замены больных или поврежденных органов. Аллогенная трансплантация органов в настоящее время является наиболее распространенным методом лечения необратимых повреждений органов; однако такой подход требует использования иммуносупрессии для предотвращения отторжения трансплантированного органа. Более того, несмотря на достижения в иммунологии трансплантата, 20% реципиентов трансплантата могут испытывать острое отторжение в течение 5 лет, а в течение 10 лет после трансплантации 40% реципиентов могут потерять свой пересаженный трансплантат или умереть^1.

Достижения в технологиях тканевой инженерии привели к новой парадигме трансплантации новых органов без иммунного отторжения с использованием дифференцированных стволовых клеток. После дифференцировки стволовых клеток каркас, называемый синтетическим внеклеточным матриксом, необходим для облегчения генерации трехмерных органов и обеспечения процветания новой ткани в реципиенте. Каркасы из децеллюляризованных нативных органов имеют преимущества, в том числе более эффективную среду для созданияклеток и усиления пролиферации стволовых клеток, хотя эти механизмы не были полностью выяснены2. В частности, почка является подходящим органом для генерации каркасов, поскольку она имеет обильную циркуляцию и нишу для создания стволовых клеток. Кроме того, из-за сложной структуры почки трудно искусственно регенерировать почки для трансплантации органов.

В этом отчете мы представляем метод разработки васкуляризированных каркасов с использованием децеллюляризованных органов в модели крысы для облегчения будущих исследований на животных в целях тканевой инженерии.

Данное исследование было одобрено администрацией Пусанского национального медицинского университета и проводилось в соответствии с этическими рекомендациями по использованию и уходу за животными. (свидетельство No 2017-119). Перед любыми исследованиями на животных должно быть получено институциональное одобрение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические и анестезирующие инструменты/оборудование и реагенты, рекомендуемые для успешного хирургического представления и визуализации органов брюшной полости, подробно описаны в таблице 1.

1. Процедуры подготовки к заготовлку почек крыс

1. При подготовке к операции поместите 8-недельных крыс Sprague-Dawley (весом 200–250 г) на согревающую прокладку. Поместите ректальный термометр в прямую кишку, чтобы контролировать температуру ядра.
2. Обезболить крысу 5% смесью газообразного изофлурана (индукция: 5%, поддержание: 3%).
3. Чтобы начать операцию, поместите крысу в лежачем положении после введения анестезии. Установите четыре конечности крысы на операционный стол с помощью ленты.
4. Побрейте и очистите брюшную полость крысы-донора бактерицидным мылом. Применяют 2% бетадин в течение не менее 1–2 мин и протирают 70% раствором этанола. Повторите эту последовательность три раза.
5. Накройте операционное поле стерильной фенестрированной драпировкой.
6. Сделайте вертикальный разрез брюшной полости и обнажите левую почку, мочеточник, брюшную аорту и нижнюю полую вену.
7. Визуализируйте и рассекните левую почку, мочеточник, брюшную аорту и нижнюю полую вену непосредственно перед разрезанием лицикулы.

2. Транскардиальная перфузия

1. Перед операцией приготовьте перфузионный раствор.
   1. Сделайте 50 мл перфузионного раствора на крысу.
   2. Смешайте 1x PBS с примерно 10 ЕД/мл гепарина (1 флакон 25 кЕД составит 2,5 л PBS+Hep).
   3. Смешайте равные объемы 8% параформальдегида с 1x PBS, чтобы получить 4% раствор PFA/1xPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 8% PFA, изготовленные в воде, могут храниться при 4 °C до 2 месяцев. Тем не менее, 4% PFA, разбавленный в PBS, стабилен только в течение 1 недели при 4 °C. Сделайте разбавление свежим.
2. Вытяните вертикальный разрез брюшной полости кранизно. Обязательно оттяните ножницы подальше от органов при разрезании, чтобы не повредить внутренние органы.
3. Продолжайте разрез через грудную клетку, а затем разрезайте диафрагму, подняв грудину.
4. Вытащивайте рыхлый лоскут кожи с дороги и освобождайте сердце, разрывая любую соединительную ткань щипцами.
   ВНИМАНИЕ: Не используйте ножницы, чтобы освободить сердце, и это может привести к нежелательной кровоточивости.
5. Откройте линию фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и убедитесь, что линия течет, прежде чем помещать иглу в левый желудочек. Осторожно держите сердце тупыми щипцами и используйте гемостат для управления иглой. Игла должна быть вставлена не более чем на 1/4 дюйма.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Введение более 1/4 дюйма может привести к перфорации на другой стороне ткани.
6. Поддерживая сердце иглой и гемостатом, найдите правое предсердие и прорежйте его ножницами иридэктомии. Положите гемостат на тело крысы и убедитесь, что игла все еще расположена внутри сердца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если порез достаточен, в полости тела должна быть кровь, так как давление от PBS, поступающего в крысу, снимается.
7. Осторожно отстежь передние лапы и кожный лоскут.
8. Продолжайте перфузию PBS в течение 4 мин или дольше, если в почках и печени все еще видна кровь.

3. Сбор и децеллюляризация почек

1. Собирают левую почку с брюшной аортой и нижней полой веной.
2. Лигата мочеточника, грудной аорты, верхней полой вены и ветвей брюшной аорты.
3. Держите орган гидратированным в PBS (DPBS) Дульбекко в чашке Петри 10 см.
4. Канюлюляция брюшной аорты и нижней полой вены с помощью катетера 23 калибра. Для удаления остаточной крови соедините канюлю с перистальтическим насосом и промывайте DPBS (500 мл) и 16 Ед/мл гепарина в течение 90 мин со скоростью 5 об/мин при 37 °C.
5. Для децеллюляризации почки перфузируют почку 1% тритоном Х-100 (1 л) в течение 3 ч, а затем 0,75% раствором додецилсульфата натрия (СДС) (2 л) в течение 6 ч при постоянном давлении 40 мм рт.ст.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Почка станет прозрачной через 8 ч.
6. Чтобы удалить остаточный SDS, перфьмин 1% пенициллина в дистиллированной воде (6 л) в течение 18 ч (на ночь), а затем стерильным DPBS (500 мл) и 16 ЕД/мл гепарина в течение 90 мин.

Грубая морфология почек крыс была темно-красной(рисунок 1А). После децеллюляризации почка стала бледной и полупрозрачной(рисунок 1D). Остаточную геномную ДНК оценивали с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкциями производителя, в децеллюляризованных каркасах почек и сравнивали с таковой в нативных почках (контроль). Количественный анализ подтвердил, что тканевая геномная ДНК была практически устранена после децеллюляризации. Из 14 случаев среднее содержание ДНК составляло 115,05 нг/мкл для контроля и 1,96 нг/мкл для децеллюляризованного каркаса. В общей сложности было удалено 98,3% ДНК(рисунок 2),хотя трехмерная структура была сохранена, а в кортикальной паренхиме сохранились бесклеточные ромерулы(рисунок 3).

Рисунок 1: Почки крыс подвергаются перфузионной децеллюляризации почечных артерий. (A) Сразу после начала децеллюляризации. (B) После лечения Тритоном Х-100. (C)После буферной обработки SDS. (D) После ночной мойки строительных лесов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Концентрации ДНК в контрольных и децеллюляризованных почках крыс, показывающие снижение содержания ДНК после децеллюляризации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Окрашивание гематоксилина и эозина контрольных и децеллюляризованных образцов почек. (A) управляя кора (A ') децеллюляризированная кора (B) контрольная продолговатая мозговая ( B') децеллюляризованный продолговатый мозг (C) контрольная вена (C ') децеллюляризированная вена. Шкала, 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для децеллюляризации органов и других тканей использовались различные протоколы. Оптимальный протокол децеллюляризации должен сохранять трехмерную архитектуру внеклеточного матрикса (ECM). В общем, такие протоколы состоят из лизирования клеточной мембраны путем физической обработки или ионных растворов, диссоциации цитоплазмы и ядра от ECM путем ферментативной обработки или моющих средств, а затем удаления клеточного мусора из^{ткани 3.} Физические процессы включают соскоб, перемешивание раствора, градиенты давления, замораживание, нетермическую постоянную электропорацию и сверхкритические жидкости^2. Клетки на внешней поверхности ткани или органа, такие как кожа или тощая кишка, могут быть эффективно удалены механическими процессами в сочетании с ферментами^4. Ионные или неионные детергенты растворяют взаимодействия ДНК/белок, липиды и липопротеины, но могут повредить структуру ECM^5. Ферменты удаляют диссоциированную цитоплазму и ядерный материал, но оставляют эти материалы в ECM, что может вызвать иммунный ответ^6. Оптимальные средства для децеллюляризации определяются толщиной и плотностью ткани или клиническим применением децеллюляризированной ткани.

Для децеллюляризации мы использовали комбинацию неионных и ионных моющих средств: Triton X-100 и SDS. Triton X-100, как неионный моющий средство, эффективно нарушает липидно-липидные и липидно-белковые взаимодействия. Однако Тритон X-100 может также разрушать ультраструктуру ECM из-за потери содержания гликозаминогликана (GAG), ламинина и фибронектина. SDS, как ионное моющее средство, эффективно удаляет ядерные остатки и цитоплазматические белки, но также нарушает ультраструктуру ECM путем потери GAG и коллагена^3. Хотя эти агенты разрушают микроструктуру ECM, SDS и Triton X-100 успешно удаляют все содержимое ДНК^7,8. Это важно, потому что оставшееся содержание ДНК в каркасе может вызвать иммунное отторжение. В ткани, которая была должным образом децеллюляризирована, содержание ДНК должно быть менее 50 нг/мг^9,10.

В методе давление децеллюляризационной перфузии составляло 40 мм рт.ст. Контроль давления необходим для децеллюляризационной перфузии. Оптимальное перфузионное давление варьируется от органа к органу, а 60 мм рт.ст. является оптимальным давлением для децеллюляризации почек или сердца человека и^{свиней 11.} У крыс 40 мм рт.ст. считается достаточным для децеллюляризации перфузии^12.

Одним из перспективных методов лечения для замены трансплантации аллотрансплантата является трансплантация стволовых клеток с использованием васкуляризированного каркаса. Мы надеемся, что этот протокол для децеллюляризации органов может обеспечить основу для будущих исследований тканевой инженерии.

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Это исследование было поддержано грантом Института биомедицинских исследований от больницы Пусанского национального университета.