Preparación De Andamios Renales Descelularizados En Ratas

Este protocolo introduce un método para desarrollar un andamio usando riñones de rata descelularizados. El protocolo incluye procesos de descelularización y recelularización para confirmar la biodisponibilidad. La descelularización se realiza utilizando Tritón X-100 y dodecil sulfato de sodio.

La ingeniería de tejidos es una disciplina de vanguardia en biomedicina. Las técnicas de cultivo celular se pueden aplicar para la regeneración de tejidos y órganos funcionales para reemplazar órganos enfermos o dañados. Se necesitan andamios para facilitar la generación de órganos o tejidos tridimensionales utilizando células madre diferenciadas in vivo. En este informe, describimos un método nuevo para desarrollar andamios vascularizados usando los riñones descelularizados de la rata. Las ratas ocho-semana-viejas de Sprague-Dawley fueron utilizadas en este estudio, y la heparina fue inyectada en el corazón para facilitar el flujo en los recipientes renales, permitiendo que la heparina perfunda en los recipientes renales. La cavidad abdominal fue abierta, y el riñón izquierdo fue recogido. Los riñones recogidos fueron perfundidos por 9 h usando los detergentes, tales como Triton X-100 y sulfato del dodecil del sodio, para descelularizar el tejido. Los andamios descelularizados del riñón entonces fueron lavados suavemente con la penicilina/la estreptomicina y la heparina del 1% para quitar la ruina celular y los residuos químicos. Se espera que el trasplante de células madre con los andamios vasculares descelularizados facilite la generación de nuevos órganos. Así, los andamios vascularizados pueden proporcionar una base para la ingeniería del tejido de los injertos del órgano en el futuro.

Las técnicas de cultivo celular se aplican para la regeneración de tejidos y órganos funcionales para reemplazar órganos enfermos o dañados. El trasplante alogénico del órgano es actualmente el tratamiento más común para el daño irreversible del órgano; sin embargo, este acercamiento requiere el uso de la immunosupresión para prevenir el rechazamiento del órgano trasplantado. Por otra parte, a pesar de los avances en inmunología del trasplante, el 20% de los receptores de trasplantes pueden experimentar un rechazo agudo dentro de los 5 años, y dentro de los 10 años posteriores al trasplante, el 40% de los receptores pueden perder su injerto trasplantado o morir^1.

Los avances en las tecnologías de ingeniería de tejidos han dado lugar a un nuevo paradigma para el trasplante de nuevos órganos sin rechazo inmunológico utilizando células madre diferenciadas. Después de la diferenciación de células madre, se necesita un andamio, llamado matriz extracelular sintética, para facilitar la generación de órganos tridimensionales y permitir que el nuevo tejido prospere dentro del receptor. Los andamios de órganos nativos descelularizados tienen ventajas, incluyendo un ambiente más efectivo para el establecimiento de células y la mejora de la proliferación de células madre, aunque estos mecanismos no han sido completamente dilucidados². En particular, el riñón es un órgano adecuado para la generación de andamios porque tiene abundante circulación y un nicho para el establecimiento de células madre. Además, debido a la compleja estructura del riñón, es difícil regenerar artificialmente los riñones para el trasplante de órganos.

En este informe, introducimos un método de desarrollar andamios vascularizados usando órganos decellularized en un modelo de la rata para facilitar estudios animales futuros para los propósitos de la ingeniería de tejidos.

Este estudio fue aprobado por la administración de la Universidad Nacional de Medicina de Pusan y se llevó a cabo de acuerdo con las directrices éticas para el uso y cuidado de los animales. (certificado nº 2017-119). Antes de cualquier estudio en animales, se debe obtener la aprobación institucional.
NOTA: Todos los instrumentos/equipos quirúrgicos y anestésicos y reactivos recomendados para la presentación quirúrgica exitosa y la obtención de imágenes de órganos abdominales se detallan en la Tabla 1.

1. Procedimientos de preparación para la cosecha de riñones de rata

1. En preparación para la cirugía, coloque ratas Sprague-Dawley de 8 semanas de edad (con un peso de 200 a 250 g) en una almohadilla de calentamiento. Coloque una sonda de termómetro rectal en el recto para controlar la temperatura del núcleo.
2. Anestesiar la rata con una mezcla al 5% de gas isoflurano (inducción: 5%, mantenimiento: 3%).
3. Para comenzar la operación, coloque la rata en una posición supina después de la administración de anestesia. Monte las cuatro extremidades de la rata en la mesa de operaciones con cinta adhesiva.
4. Afeitarse y limpiar el abdomen de la rata donante con jabón germicida. Aplique betadina al 2% durante al menos 1-2 min y limpie con una solución de etanol al 70%. Repita esta secuencia tres veces.
5. Cubra el campo operativo con una cortina fenestrada estéril.
6. Haga una incisión abdominal vertical y exponga el riñón izquierdo, el uréter, la aorta abdominal y la vena cava inferior.
7. Visualice y diseccione el riñón izquierdo, el uréter, la aorta abdominal y la vena cava inferior justo antes de cortar el pedículo.

2. Perfusión transcardial

1. Antes de la cirugía, prepare la solución de perfusión.
   1. Hacer 50 mL de solución de perfusión por rata.
   2. Mezcle 1x PBS con aproximadamente 10 U/mL de heparina (1 vial de 25 kU hará 2,5 L de PBS+Hep).
   3. Mezcle volúmenes iguales de paraformadehído al 8% con 1x PBS para hacer la solución de PFA/1xPBS al 4%.
      NOTA: El 8% de PFA hecho en agua se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 meses. Sin embargo, el 4% de PFA diluido en PBS solo es estable durante 1 semana a 4 °C. Hacer que la dilución sea fresca.
2. Extienda la incisión abdominal vertical cranealmente. Asegúrese de extraer las tijeras de los órganos al cortar para evitar dañar los órganos internos.
3. Continúe la incisión a través de la caja torácica y luego corte el diafragma levantando el esternón.
4. Fije el colgajo suelto de piel fuera del camino y libere el corazón rasgando cualquier tejido conectivo con las pinzas.
   PRECAUCIÓN: No use las tijeras para liberar el corazón y esto podría resultar en sangrado no deseado.
5. Abra la línea salina tamponada con fosfato (PBS) y asegúrese de que la línea fluya antes de colocar la aguja en el ventrículo izquierdo. Sostenga el corazón suavemente con las medidas de control contundentes y use un hemóstato para controlar la aguja. La aguja debe insertarse no más de 1/4 de pulgada.
   NOTA: La inserción mayor que 1/4 de pulgada puede resultar en perforación al otro lado del tejido.
6. Mientras apoya el corazón con la aguja y el hemóstato, localice la aurícula derecha y snip a través de ella con tijeras de iridectomía. Descanse el hemóstato en el cuerpo de la rata y asegúrese de que la aguja todavía esté colocada dentro del corazón.
   NOTA: Si el corte es suficiente, debe haber sangre en la cavidad corporal a medida que se alivia la presión del PBS que fluye hacia la rata.
7. Desanclar cuidadosamente los pies delanteros y el colgajo de la piel.
8. Continúe perfundiendo PBS durante 4 minutos o más si todavía hay sangre visible en el riñón y el hígado.

3. Cosecha y descelularización de los riñones

1. Cosechar el riñón izquierdo con la aorta abdominal y la vena cava inferior.
2. Ligate el uréter, la aorta torácica, la vena cava superior, y las ramas de la aorta abdominal.
3. Mantenga el órgano hidratado en pbs de Dulbecco (DPBS) en una placa de Petri de 10 cm.
4. Cannulate la aorta abdominal y la vena cava inferior con un catéter de la galga 23. Para eliminar la sangre residual, conecte la cánula con una bomba peristáltica y lávese con DPBS (500 mL) y 16 U/mL de heparina durante 90 min a una velocidad de 5 rpm a 37 °C.
5. Para descelularizar el riñón, perfundir el riñón con 1% Tritón X-100 (1 L) durante 3 h y luego con 0,75% dodecil sulfato de sodio (SDS) solución (2 L) durante 6 h a una presión constante de 40 mmHg.
   NOTA: El riñón se volverá transparente después de 8 h.
6. Para eliminar el SDS residual, perfunda la muestra con penicilina al 1% en agua destilada (6 L) durante 18 h (durante la noche) y luego con DPBS estéril (500 mL) y 16 U/mL de heparina durante 90 min.

La morfología gruesa de los riñones de rata fue de color rojo oscuro (Figura 1A). Después de la descelularización, el riñón se volvió pálido y translúcido (Figura 1D). El ADN genómico residual se evaluó con un kit comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en andamios renales descelularizados y en comparación con el de los riñones nativos (control). El análisis cuantitativo confirmó que la DNA genomic del tejido casi fue eliminada después de la descelularización. De 14 casos, el contenido medio de ADN fue de 115,05 ng/μL para el control y de 1,96 ng/μL para el andamio descelularizado. En total, se eliminó el 98,3% del ADN(Figura 2),aunque se mantuvo la estructura tridimensional, y se conservaron los gromeruli acelulares en el parénquima cortical(Figura 3).

Figura 1: Riñones de rata sometidos a descelularización de perfusión arterial renal. (A) Inmediatamente después del inicio de la descelularización. (b) Después del tratamiento de Triton X-100. (c) Después del tratamiento del almacenador intermediario de SDS. (D) Después del lavado nocturno del andamio. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2: Concentraciones de ADN en los riñones de rata control y descelularizados, mostrando un contenido reducido de ADN después de la descelularización. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3: Tinción de hematoxilina y eosina de muestras de riñón control y descelularizadas. (A)corteza control(A') corteza descelularizada(B)médula de control(B') médula descelularizada (C) vena de control (C ') vena descelularizada. Barra de escala, 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se han utilizado varios protocolos para la descelularización de órganos y otros tejidos. El protocolo óptimo de descelularización debe preservar la arquitectura tridimensional de la matriz extracelular (ECM). En general, tales protocolos consisten en lisear la membrana celular mediante procesamiento físico o soluciones iónicas, disociar el citoplasma y el núcleo de la ECM mediante procesamiento enzimático o detergentes, y luego eliminar los desechos celulares del tejido^3. Los procesos físicos incluyen raspado, agitación de la solución, gradientes de presión, congelación instantánea, electroporación permanente no térmico y fluidos supercríticos^2. Las células en la superficie externa de un tejido u órgano, como la piel o el intestino delgado, pueden ser eliminadas eficientemente por procesos mecánicos combinados con enzimas⁴. Los detergentes iónicos o no iónicos disuelven las interacciones ADN/proteína, los lípidos y las lipoproteínas, pero pueden dañar la estructura de la^{ECM 5.} Las enzimas eliminan el citoplasma disociado y el material nuclear, pero dejan estos materiales en la ECM, lo que puede provocar una respuesta inmunitaria⁶. Los agentes óptimos para la descelularización están determinados por el grosor y la densidad del tejido o el uso clínico del tejido descelularizado.

Para la descelularización, se utilizó una combinación de detergentes no iónicos e iónicos: Triton X-100 y SDS. Triton X-100, como detergente no iónico, interrumpe eficazmente las interacciones lípido/lípido y lípido/proteína. Sin embargo, Triton X-100 también puede destruir la ultraestructura de ECM debido a la pérdida de glicosaminoglicano (GAG), laminina y contenido de fibronectina. Sds, como un detergente iónico, elimina eficazmente los restos nucleares y proteínas citoplasmáticas, pero también interrumpe la ultraestructura ecm por la pérdida de GAG y colágeno³. Aunque estos agentes destruyen la microestructura del ECM, sds y Triton X-100 eliminar con éxito todos los contenidos de ADN^7,8. Esto es esencial porque el contenido restante de ADN dentro de un andamio puede causar rechazo inmunológico. En el tejido que ha sido correctamente descelularizado, el contenido de ADN debe ser inferior a 50 ng/mg^9,10.

En el método, la presión de la perfusión de descelularización fue de 40 mmHg. El control de la presión es necesario para la perfusión de descelularización. La presión óptima de perfusión varía de un órgano a otro, y 60 mmHg es la presión óptima para la descelularización renal o cardíaca humana y porcina^11. En ratas, 40 mmHg se considera suficiente para la perfusión de descelularización¹².

Un tratamiento prometedor para reemplazar el trasplante de aloinjerto es el trasplante de células madre utilizando un andamio vascularizado. Esperamos que este protocolo para la descelularización del órgano pueda proporcionar una fundación para futuros estudios de ingeniería de tejidos.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este estudio fue apoyado por una beca del Instituto de Investigación Biomédica del Hospital Universitario Nacional de Pusan.