Preparazione di impalcature renali decellularizzate nei ratti

Questo protocollo introduce un metodo per sviluppare un'impalcatura utilizzando reni di ratto decellularizzati. Il protocollo include processi di decellularizzazione e ricellularizzazione per confermare la biodisponibilità. La decellularizzazione viene eseguita utilizzando Tritone X-100 e solfato di dodecil di sodio.

L'ingegneria tissutale è una disciplina all'avanguardia in biomedicina. Le tecniche di coltura cellulare possono essere applicate per la rigenerazione di tessuti e organi funzionali per sostituire gli organi matti o danneggiati. Le impalcature sono necessarie per facilitare la generazione di organi o tessuti tridimensionali utilizzando cellule staminali differenziate in vivo. In questa relazione descriviamo un nuovo metodo per lo sviluppo di impalcature vascolarizzate che utilizzano reni di ratto decellularizzati. In questo studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley di otto settimane, ed l'eparina è stata iniettata nel cuore per facilitare il flusso nei vasi renali, permettendo all'eparina di perfondersi nei vasi renali. La cavità addominale è stata aperta e il rene sinistro è stato raccolto. I reni raccolti sono stati perfusi per 9 ore usando detergenti, come Triton X-100 e solfato di dodecil di sodio, per decellularizzare il tessuto. Le impalcature renali decellularizzate sono state poi lavate delicatamente con l'1% di penicillina/streptomicina ed eparina per rimuovere detriti cellulari e residui chimici. Il trapianto di cellule staminali con le impalcature vascolari decellularizzate dovrebbe facilitare la generazione di nuovi organi. Pertanto, le impalcature vascolarizzate possono fornire una base per l'ingegneria tissutale degli innesti di organi in futuro.

Le tecniche di coltura cellulare sono applicate per la rigenerazione di tessuti e organi funzionali per sostituire gli organi matti o danneggiati. Il trapianto di organi allogenici è attualmente il trattamento più comune per danni irreversibili agli organi; tuttavia, questo approccio richiede l'uso di immunosoppressione per prevenire il rigetto dell'organo trapiantato. Inoltre, nonostante i progressi nell'immunologia dei trapianti, il 20% dei riceventi di trapianti può sperimentare un rigetto acuto entro 5 anni e, entro 10 anni dal trapianto, il 40% dei riceventi può perdere l'innesto trapiantato o morire¹.

I progressi nelle tecnologie di ingegneria tissutale hanno prodotto un nuovo paradigma per il trapianto di nuovi organi senza rigetto immunitario utilizzando cellule staminali differenziate. Dopo la differenziazione delle cellule staminali, è necessaria un'impalcatura, chiamata matrice extracellulare sintetica, per facilitare la generazione di organi tridimensionali e consentire al nuovo tessuto di prosperare all'interno del ricevente. Le impalcature provenienti da organi nativi decellularizzati hanno vantaggi, tra cui un ambiente più efficace per la creazione di cellule e il miglioramento della proliferazione delle cellule staminali, sebbene questi meccanismi non siano stati completamente chiariti². In particolare, il rene è un organo adatto per la generazione di impalcature perché ha una circolazione abbondante e una nicchia per lo stabilimento delle cellule staminali. Inoltre, a causa della complessa struttura del rene, è difficile rigenerare artificialmente i reni per il trapianto di organi.

In questa relazione introduciamo un metodo per sviluppare impalcature vascolarizzate utilizzando organi decellularizzati in un modello di ratto per facilitare futuri studi sugli animali a fini di ingegneria tissutale.

Questo studio è stato approvato dalla somministrazione della Pusan National University of Medicine ed è stato condotto in conformità con le linee guida etiche per l'uso e la cura degli animali. (certificato n. 2017-119). Prima di qualsiasi studio sugli animali, dovrebbe essere ottenuta l'approvazione istituzionale.
NOTA: Tutti gli strumenti/attrezzature chirurgiche e anestetiche e i reagenti raccomandati per una presentazione chirurgica di successo e l'imaging di organi addominali sono dettagliati nella tabella 1.

1. Procedure di preparazione per la raccolta dei reni del ratto

1. In preparazione all'intervento chirurgico, posizionare ratti Sprague-Dawley di 8 settimane (del peso di 200-250 g) su un tampone riscaldante. Posizionare una sonda termometro rettale nel retto per monitorare la temperatura interna.
2. Anestetizzare il ratto con una miscela al 5% di gas isoflurane (induzione: 5%, manutenzione: 3%).
3. Per iniziare l'operazione, posizionare il ratto in posizione supina dopo la somministrazione di anestesia. Montare i quattro arti del topo sul tavolo di funzionamento con del nastro adesivo.
4. Radere e pulire l'addome del ratto donatore con sapone germicida. Applicare il 2% di betadina per almeno 1-2 minuti e pulire con una soluzione di etanolo al 70%. Ripetere questa sequenza tre volte.
5. Coprire il campo operatorio con un drappo sterile fenestrato.
6. Fai un'incisione addominale verticale ed esponi il rene sinistro, l'utere, l'aorta addominale e la vena cava inferiore.
7. Visualizza e seziona il rene sinistro, l'utere, l'aorta addominale e la vena cava inferiore poco prima di tagliare il pedicolo.

2. Perfusione transcardica

1. Prima dell'intervento chirurgico, preparare la soluzione perfusionale.
   1. Fare 50 mL di soluzione perfusione per ratto.
   2. Mescolare 1x PBS con circa 10 U/mL di eparina (1 flaconcino da 25 kU farà 2,5 L di PBS+Hep).
   3. Mescolare volumi uguali di paraformaldeide all'8% con 1x PBS per realizzare la soluzione PFA/1xPBS al 4%.
      NOTA: L'8% di PFA prodotto in acqua può essere conservato a 4 °C per un massimo di 2 mesi. Tuttavia, il 4% di PFA diluito in PBS è stabile solo per 1 settimana a 4 °C. Rendi fresca la diluizione.
2. Estendere l'incisione addominale verticale cranicamente. Assicurati di distolare le forbici dagli organi durante il taglio per evitare di danneggiare gli organi interni.
3. Continuare l'incisione attraverso la gabbia toracica, quindi tagliare attraverso il diaframma sollevando lo sterno.
4. Pin il lembo sciolto della pelle fuori strada, e liberare il cuore strappando qualsiasi tessuto connettivo con le pinie.
   ATTENZIONE: Non usare le forbici per liberare il cuore e questo potrebbe causare sanguinamento indesiderato.
5. Aprire la linea salina tamponata con fosfato (PBS) e assicurarsi che la linea fluisco prima di posizionare l'ago nel ventricolo sinistro. Tenere delicatamente il cuore con pini smussati e utilizzare un emostato per controllare l'ago. L'ago deve essere inserito non più di 1/4 di pollice.
   NOTA: L'inserimento superiore a 1/4 di pollice può comportare una perforazione sull'altro lato del tessuto.
6. Mentre si sostiene il cuore con l'ago e l'emostato, individuare l'atrio destro e tagliarlo attraverso di esso con forbici per iridectomia. Appoggia l'emostato sul corpo del topo e assicurati che l'ago sia ancora posizionato all'interno del cuore.
   NOTA: Se il taglio è sufficiente, ci dovrebbe essere sangue nella cavità corporea mentre la pressione del PBS che scorre nel topo viene alleviata.
7. Rimuovere con cura i piedi anteriori e il lembo della pelle.
8. Continuare a perfondere PBS per 4 minuti o più se c'è ancora sangue visibile nel rene e nel fegato.

3. Raccolta e decellularizzazione dei reni

1. Raccogliere il rene sinistro con l'aorta addominale e la vena cava inferiore.
2. Ligate l'urigatore, l'aorta toracica, la vena cava superiore e i rami dell'aorta addominale.
3. Mantenere l'organo idratato nel PBS (DPBS) di Dulbecco in una piastra di Petri di 10 cm.
4. Cannulate l'aorta addominale e la vena cava inferiore con un catetere calibro 23. Per rimuovere il sangue residuo, collegare la cannula con una pompa peristaltica e lavare con DPBS (500 mL) e 16 Eparina U /mL per 90 min ad una velocità di 5 giri/min a 37 °C.
5. Per decellularizzare il rene, perfondere il rene con 1% di Tritone X-100 (1 L) per 3 ore e quindi con soluzione di solfato di dodecil di sodio (SDS) allo 0,75% (SDS) per 6 h a una pressione costante di 40 mmHg.
   NOTA: Il rene diventerà trasparente dopo 8 ore.
6. Per rimuovere l'SDS residuo, perfondere il campione con 1% di penicillina in acqua distillata (6 L) per 18 ore (durante la notte) e quindi con DPBS sterile (500 mL) e 16 Eparina U/mL per 90 min.

La morfologia grossolana dei reni del ratto era rosso scuro(figura 1A). Dopo la decellularizzazione, il rene è diventato pallido e traslucido (Figura 1D). Il DNA genomico residuo è stato valutato con un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore, in impalcature renali decellularizzate e confrontato con quello nei reni nativi (controllo). L'analisi quantitativa ha confermato che il DNA genomico tissutale è stato quasi eliminato dopo la decellularizzazione. Da 14 casi, il contenuto medio di DNA era di 115,05 ng/μL per il controllo e di 1,96 ng/μL per l'impalcatura decellularizzata. In totale, il 98,3% del DNA è stato rimosso (Figura 2), sebbene la struttura tridimensionale sia stata mantenuta e i gromeruli acellulari siano stati conservati nel parenchima corticale(figura 3).

Figura 1: Reni di ratto sottoposti a decellularizzazione perfusione arteriosa renale. (A) Subito dopo l'inizio della decellularizzazione. (B) Dopo il trattamento con Tritone X-100. (C) Dopo il trattamento tampone SDS. (D) Dopo il lavaggio notturno delle impalcature. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Concentrazioni di DNA nei reni del ratto di controllo e decellularizzati, che mostrano un contenuto ridotto di DNA dopo la decellularizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Colorazione ematossilina ed eosina dei campioni renali di controllo e decellularizzati. (A) corteccia di controllo (A')corteccia decellularizzata (B) midollo di controllo (B')midollo decellularizzato (C) vena di controllo(C') vena decellularizzata. Barra di scala, 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Vari protocolli sono stati utilizzati per la decellularizzazione di organi e altri tessuti. Il protocollo di decellularizzazione ottimale deve preservare l'architettura tridimensionale della matrice extracellulare (ECM). In generale, tali protocolli consistono nel lisciviare la membrana cellulare mediante elaborazione fisica o soluzioni ioniche, dissociare il citoplasma e il nucleo dall'ECM mediante lavorazione enzimatica o detergenti, quindi rimuovere i detriti cellulari dal tessuto³. I processi fisici includono raschiatura, agitazione della soluzione, gradienti di pressione, congelamento a scatto, elettroporazione permanente non termica e fluidi supercritici². Le cellule sulla superficie esterna di un tessuto o di un organo, come la pelle o l'intestino tenue, possono essere rimosse in modo efficiente con processi meccanici combinati con enzimi⁴. I detergenti ionici o non ionici dissolvono le interazioni DNA/proteina, lipidi e lipoproteine, ma possono danneggiare la struttura ECM⁵. Gli enzimi rimuovono il citoplasma dissociato e il materiale nucleare, ma lasciano questi materiali nell'ECM, che può causare una risposta immunitaria⁶. Gli agenti ottimali per la decellularizzazione sono determinati dallo spessore e dalla densità dei tessuti o dall'uso clinico del tessuto decellularizzato.

Per la decellularizzazione, abbiamo utilizzato una combinazione di detergenti non ionici e ionici: Triton X-100 e SDS. Tritone X-100, come detergente non ionico, interrompe efficacemente le interazioni lipidico/lipidico e lipidico/proteico. Tuttavia, Triton X-100 può anche distruggere l'ultrastruttura ECM a causa della perdita di glicosaminoglicano (GAG), laminina e contenuto di fibronectina. SDS, come detergente ionico, rimuove efficacemente i resti nucleari e le proteine citoplasmatiche, ma interrompe anche l'ultrastruttura ECM per perdita di GAG e collagene³. Sebbene questi agenti distruggano la microstruttura dell'ECM, SDS e Triton X-100 rimuovono con successo tutto il contenuto di DNA^7,8. Questo è essenziale perché il contenuto di DNA rimanente all'interno di un'impalcatura può causare il rigetto immunitario. Nei tessuti che sono stati correttamente decellularizzati, il contenuto di DNA deve essere inferiore a 50 ng/mg^9,10.

Nel metodo, la pressione della perfusione di decellularizzazione era di 40 mmHg. Il controllo della pressione è necessario per la perfusione di decellularizzazione. La pressione ottimale perfusione varia da organo a organo e 60 mmHg è la pressione ottimale per la decellularizzazione umana e suina del rene o del^{cuore 11}. Nei ratti, 40 mmHg sono considerati sufficienti per la perfusione di decellularizzazione¹².

Un trattamento promettente per sostituire il trapianto di allografto è il trapianto di cellule staminali utilizzando un'impalcatura vascolarizzata. Speriamo che questo protocollo per la decellularizzazione degli organi possa fornire una base per futuri studi di ingegneria tissutale.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Questo studio è stato supportato da una borsa di studio del Biomedical Research Institute del Pusan National University Hospital.