Portanto, o foco principal de nossa pesquisa é estudar células estromais mesenquimais, vesículas extracelulares para regeneração tecidual. Um problema e um objetivo para nossa pesquisa é traduzir a abordagem livre de células em aplicação clínica juntamente com terapias celulares. A caracterização é crucial e hoje ter vesícula pura para uma caracterização profunda é muito difícil porque não existem protocolos para atingir alta pureza.
Portanto, queríamos implementar a tecnologia de classificação de células para estudar, caracterizar e, eventualmente, traduzir para a prática clínica essa nova abordagem baseada em vesículas extracelulares, Nosso protocolo consiste em quatro partes, a preparação da amostra, caracterização de vesículas extracelulares, classificação e análise pós-triagem. Vamos nos concentrar na parte de classificação. Como você verá, alguns comandos serão executados no software classificador enquanto outros na tela sensível ao toque.
Nosso protocolo oferece vantagens significativas em comparação com outros métodos de separação de EV. Em primeiro lugar, o uso de 70 micro bicos a 35 psi preserva a integridade da pós-classificação de EV. Em seguida, é possível isolar uma população específica de EV e, finalmente, o instrumento permite salvar a configuração de classificação para tornar o processo reprodutível.
Em nosso laboratório, estamos trabalhando para desenvolver um novo painel multicolorido para análise de vesículas extracelulares. Em particular, estamos nos concentrando na configuração do instrumento e no estudo dos fluorocromos. Acreditamos que ser capaz de identificar e separar populações raras de vesículas, poderia proporcionar um bom aprimoramento para sua caracterização e também, para o estudo de seu papel em processos biológicos.
Para começar, abra a linha de pressão e o sistema de vácuo do classificador de células. Ligue o instrumento, abra o gabinete de biossegurança e inicie o software do classificador. Pressurizar o sistema fluídico e, em seguida, ligar o sistema fluídico.
Ative o drop drive do cristal piezoelétrico no bico que vibra para gerar gotículas. Execute o procedimento de remoção de bolhas para eliminar bolhas no sistema. Em seguida, execute um tubo de cinco mililitros de solução de limpeza por cinco minutos em alta pressão diferencial, seguido por um tubo de cinco mililitros de água deionizada por cinco minutos.
Para executar o procedimento de inicialização manual, vá para a guia de controle do laser e ligue a alimentação do laser. Examine o alinhamento vertical do fluxo. Para determinação do ponto do laser, pressione a guia de interceptação do fluxo de laser.
Clique no botão de seta verde e siga as instruções no monitor da tela sensível ao toque. Inicialize o IntelliSort e defina a frequência do drive de queda junto com o valor de amplitude padrão que faz com que o fluxo forme uma gota. Para o procedimento de alinhamento a laser fino, carregue um tubo de cinco mililitros de grânulos de alinhamento de CQ no amostrador e execute-o no protocolo de CQ.
Na guia de alinhamento fino, selecione os parâmetros desejados nos eixos X e Y para visualizar grânulos bem compactados e columados. Uma vez verificado o alinhamento manual, execute o QC automático com o diâmetro dos grânulos QC definido para três micrômetros. Salve a aquisição de CQ no protocolo de alinhamento de software.
Para finalizar o IntelliSort, localize as placas de deflexão na posição correta no classificador e ligue a tensão para cerca de 3.000 volts. Escolha a saída de classificação do suporte de seis tubos. Selecione os fluxos no indicador de fluxo para habilitá-los e executar o fluxo de teste.
Habilite o botão de determinação automática de atraso de queda do IntelliSort para definir o atraso de queda correto e verificar os fluxos novamente. Em seguida, ative o modo de manutenção do IntelliSort e verifique o atraso de queda manualmente. Carregue o protocolo manual de atraso de queda no software do classificador e adquira esferas de controle fluorescentes.
Depois de inserir o suporte de slide correto, selecione classificar, seguido pelo assistente de atraso de queda e lógica de classificação. Verifique com um microscópio fluorescente se 97% das esferas fluorescentes estão presentes na quinta poça. Para começar, configure o classificador de células e ative o IntelliSort.
Depois de realizar a calibração de dispersão, execute as etapas de aquisição de amostra para cada amostra. Para criar um novo protocolo para classificação de amostras, selecione arquivo seguido de protocolo e novo na barra de ferramentas. Clique na configuração de aquisição de dados no software classificador.
Na janela de parâmetros de aquisição, selecione os canais de interesse e desative os demais. Em seguida, colocar um tubo de cinco mililitros da amostra no amostrador. Na tela sensível ao toque, clique no botão carregar.
Na barra de ferramentas do software classificador, selecione aquisição e pressione iniciar. Quando a janela de propriedades da amostra for exibida, insira o nome da amostra e clique em OK. Para criar a estratégia de gating, selecione histograma e, em seguida, crie histograma.
Crie três gráficos de pontos, o primeiro com o log 488-FSC1-Height no eixo X e o log 488-SSC-Height no eixo Y. O segundo com registro de altura 488-FSC-2 no eixo X e registro de altura 488-SSC no eixo Y, e o terceiro com registro de altura 488 513 X 26 CFSE no eixo X e registro de altura 488-SSC no eixo Y. Clique em aquisição seguido de iniciar e insira o nome da amostra.
Durante a aquisição, desenhe a região identificando os eventos negativos do CFSE e uma identificando os eventos positivos do CFSE. Em seguida, na guia de classificação, identifique a região a ser classificada. Quando a taxa de fluxo estiver estável, selecione aquisição seguida de parada.
Comece a classificar selecionando classificar na barra de ferramentas do software classificador. Para salvar as configurações de classificação, selecione classificar na barra de ferramentas e clique em salvar configurações de classificação. Para verificar a pureza da população classificada, primeiro adquira um tubo de cinco mililitros de solução de limpeza por 10 minutos a alta pressão diferencial, seguido por um tubo de cinco mililitros de água deionizada por 10 minutos.
Adquira PBS filtrado de 0,22 micrômetro e verifique se nenhum evento positivo de CFSE está presente. Em seguida, dilua cinco microlitros da amostra classificada em 100 microlitros de PBS filtrado de 0,22 micrômetro. Adquira as amostras classificadas e registre os volumes A expressão de CD9, CD63, CD81 e CD44, nas vesículas extracelulares derivadas do tecido adiposo, não se alterou após a classificação do CFSE.
A análise de rastreamento de nanopartículas mostrou que a distribuição de tamanho das vesículas permaneceu consistente antes e depois da classificação. A análise por microscopia eletrônica de transmissão indicou que a morfologia das vesículas não foi significativamente alterada pelo processo de classificação. Além disso, o tratamento foi de 0,1% Triton X-100 reduziu o número de vesículas positivas para CFSE, confirmando sua origem vesicular.
