L’objectif principal de notre recherche est donc d’étudier les cellules stromales mésenchymateuses, vésicule extracellulaire pour la régénération tissulaire. L’un des enjeux et l’un des objectifs de notre recherche est de traduire l’approche acellulaire en application clinique aux côtés des thérapies cellulaires. La caractérisation est cruciale et aujourd’hui avoir une vésicule pure pour une caractérisation profonde est très difficile car il n’existe pas de protocoles pour atteindre une grande pureté.
Par conséquent, nous avons voulu mettre en œuvre la technologie du trieur de cellules pour étudier, caractériser et, éventuellement, traduire en pratique clinique cette nouvelle approche basée sur la vésicule extracellulaire, Notre protocole se compose de quatre parties, la préparation de l’échantillon, la caractérisation des vésicules extracellulaires, le tri et l’analyse post-tri. Nous allons nous concentrer sur la partie tri. Comme vous le verrez, certaines commandes seront exécutées sur le logiciel de tri tandis que d’autres sur l’écran tactile.
Notre protocole offre des avantages significatifs par rapport à d’autres méthodes de séparation des VE. Tout d’abord, l’utilisation d’une micro-buse de 70 à 35 psi psi préserve l’intégrité du post-tri EV. Ensuite, il est possible d’isoler une population spécifique d’EV et enfin, l’instrument permet d’enregistrer le réglage de tri afin de rendre le processus reproductible.
Dans notre laboratoire, nous travaillons à la mise au point d’un nouveau panel multicolore pour l’analyse des vésicules extracellulaires. En particulier, nous nous concentrons sur la configuration de l’instrument et sur l’étude des fluorochromes. Nous pensons que le fait de pouvoir identifier et séparer des populations rares de vésicules, pourrait apporter une bonne amélioration à leur caractérisation et aussi, pour l’étude de leur rôle dans les processus biologiques.
Pour commencer, ouvrez la conduite de pression et le système de vide du trieur de cellules. Allumez l’instrument, ouvrez l’armoire de biosécurité et lancez le logiciel du trieur. Mettez le système fluidique sous pression, puis allumez le système fluidique.
Activez l’entraînement de goutte le cristal piézoélectrique dans la buse qui vibre pour générer des gouttelettes. Effectuez la procédure de désoxyssage pour éliminer les bulles dans le système. Ensuite, faites fonctionner un tube de cinq millilitres de solution de nettoyage pendant cinq minutes à haute pression différentielle, suivi d’un tube de cinq millilitres d’eau déminéralisée pendant cinq minutes.
Pour effectuer la procédure de démarrage manuel, accédez à l’onglet de contrôle du laser et allumez l’alimentation laser. Examinez l’alignement vertical du cours d’eau. Pour la détermination du point laser, appuyez sur l’onglet d’interception du flux laser.
Cliquez sur le bouton fléché vert et suivez les instructions sur le moniteur à écran tactile. Initialisez IntelliSort et définissez la fréquence du lecteur de dépôt ainsi que la valeur d’amplitude par défaut qui provoque la formation d’une gouttelette dans le flux. Pour la procédure d’alignement laser fin, chargez un tube de cinq millilitres de billes d’alignement QC dans l’échantillonneur et exécutez-le dans le protocole QC.
Dans l’onglet alignement fin, sélectionnez les paramètres souhaités sur les axes X et Y pour visualiser les billes bien compactées et collumées. Une fois l’alignement manuel vérifié, effectuez le contrôle qualité automatique avec le diamètre des billes de contrôle qualité réglé sur trois micromètres. Enregistrez l’acquisition QC sur le protocole d’alignement logiciel.
Pour finaliser l’IntelliSort, placez les plaques de déviation dans la bonne position dans le trieur et allumez la tension à environ 3 000 volts. Choisissez la sortie de tri du support à six tubes. Sélectionnez les flux sur l’indicateur de flux pour les activer et exécuter le flux de test.
Activez le bouton de détermination automatique du délai de chute IntelliSort pour définir le délai de chute correct et vérifier à nouveau les flux. Activez ensuite le mode de maintenance IntelliSort et vérifiez manuellement le délai de chute. Chargez le protocole manuel de délai de chute dans le logiciel de tri et acquérez des billes de contrôle fluorescentes.
Après avoir inséré le support de diapositive approprié, sélectionnez tri, puis Assistant de délai de chute et logique de tri. Vérifiez à l’aide d’un microscope fluorescent que 97 % des billes fluorescentes sont présentes sur la cinquième flaque d’eau. Pour commencer, configurez le trieur de cellules et activez IntelliSort.
Après avoir effectué l’étalonnage de la diffusion, effectuez les étapes d’acquisition de l’échantillon pour chaque échantillon. Pour créer un nouveau protocole pour le tri des échantillons, sélectionnez fichier suivi de protocole et nouveau dans la barre d’outils. Cliquez sur le paramètre d’acquisition de données dans le logiciel du trieur.
Dans la fenêtre des paramètres d’acquisition, sélectionnez les chaînes qui vous intéressent et désactivez les autres. Placez ensuite un tube de cinq millilitres de l’échantillon dans l’échantillonneur. Sur l’écran tactile, cliquez sur le bouton de chargement.
Dans la barre d’outils du logiciel de tri, sélectionnez acquisition, puis appuyez sur Démarrer. Lorsque la fenêtre des propriétés de l’exemple s’affiche, insérez le nom de l’échantillon et cliquez sur OK. Pour créer la stratégie de contrôle, sélectionnez histogramme, puis créez un histogramme.
Créez trois diagrammes à points, le premier avec le log 488-FSC1-Height sur l’axe X et le log 488-SSC-Height sur l’axe Y. La deuxième avec le diagraphe de hauteur 488-FSC-2 sur l’axe X et le diagraphe de hauteur 488-SSC sur l’axe Y, et la troisième avec le diagraphe de hauteur 488 513 X 26 CFSE sur l’axe X et le journal de hauteur 488-SSC sur l’axe Y. Cliquez sur acquisition puis sur démarrer et insérez le nom de l’échantillon.
Lors de l’acquisition, dessinez une région identifiant les événements négatifs CFSE et une autre identifiant les événements positifs CFSE. Ensuite, dans l’onglet Trier, identifiez la région à trier. Lorsque le débit est stable, sélectionnez acquisition suivie d’arrêt.
Commencez le tri en sélectionnant trier dans la barre d’outils du logiciel de tri. Pour enregistrer les paramètres de tri, sélectionnez trier dans la barre d’outils, puis cliquez sur Enregistrer les paramètres de tri. Pour vérifier la pureté de la population triée, procurez-vous d’abord un tube de cinq millilitres de solution de nettoyage pendant 10 minutes à une pression différentielle élevée, suivi d’un tube de cinq millilitres d’eau déminéralisée pendant 10 minutes.
Acquérez un PBS filtré de 0,22 micromètre et vérifiez qu’aucun événement positif au CFSE n’est présent. Diluez ensuite cinq microlitres de l’échantillon trié dans 100 microlitres de PBS filtré de 0,22 micromètre. Acquérir les échantillons triés et enregistrer les volumes L’expression de CD9, CD63, CD81 et CD44 dans les vésicules extracellulaires dérivées du tissu adipeux n’a pas changé après le tri CFSE.
L’analyse du suivi des nanoparticules a montré que la distribution de la taille des vésicules restait cohérente avant et après le tri. L’analyse par microscopie électronique à transmission a indiqué que la morphologie des vésicules n’était pas significativement modifiée par le processus de tri. De plus, le traitement était de 0,1 %Triton X-100 a réduit le nombre de vésicules positives au CFSE, confirmant leur origine vésiculaire.
