Este protocolo é significativo porque concentra vesículas extracelulares, EVs, através de uma combinação de tecnologias, ao mesmo tempo que permite a separação de virions longe dos EVs. Este método maximiza a recuperação de EV acima do padrão ouro atual de ultracentrifugação para análise múltipla a jusante e caracterização de preparações EV livres de vírus. Este protocolo é ideal para o estudo de EV's e infecções virais.
Esse método pode ser adaptado a outros sistemas de vírus, como HTLV, Ebola, Zika e muito mais. Eu esperaria que um usuário pela primeira vez deste método lutasse com a preparação de nanopartículas, por isso recomendamos seguir cuidadosamente nossas especificações. Alguma otimização pode ser necessária, dependendo do sistema.
A demonstração visual deste método é importante para ilustrar o fluxo de trabalho global e as nuances do protocolo, o que reduzirá o tempo e os erros para os usuários iniciantes. Comece por preparar a cultura sobrenante de células infectadas ou transfectadas. Cultura aproximadamente 10 mililitros de células de tronco tardias por cinco dias a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono, certificando-se de que todos os reagentes médios estão livres de vesículas extracelulares.
Quando a cultura estiver pronta, pelota as células por centrifugação a 3.000 vezes G por cinco minutos e descarte a pelota. Filtre o supernatante com um filtro estéril de 0,22 micrômetros e colete o filtrado em um tubo limpo. Adicione um volume igual de reagentes de precipitação PEG ao filtrado e inverta o tubo várias vezes para misturar.
Incubar a mistura a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação, centrifufique a mistura a 1500 vezes G por 30 minutos, para produzir uma vesícula extracelular heterogênea, ou EV, pelota. Descarte o supernascer e suspenda a pelota em 150 a 300 microlitres de 1X PBS, sem cálcio e magnésio.
Mantenha a pelota no gelo, enquanto prepara um gradiente de densidade. Prepare o meio gradiente de densidade iodixanol com 11 frações de densidade, variando de seis a 18% de iodixanol, como descrito no manuscrito. Misture cada tubo por vórtice e coloque as frações de densidade em um tubo de ultracentrifuge de balde limpo e seco.
Adicione a pelota EV re-suspensa ao topo do gradiente em camadas e ultracentrifugar o tubo a 10.000 vezes G e quatro graus Celsius por 90 minutos. Transfira cuidadosamente cada fração do tubo ultracentrífuga para um novo tubo de microcentrífuga. Prepare um chorume de 30% de nanopartículas para enriquecimento de fração de EV, misturando volumes iguais de NT80, NT82 e 1X-PBS.
Vórtice a mistura de nanopartículas para garantir a homogeneidade. Adicione 30 microliters da pasta a cada fração de densidade e misture por pipetar ou inverter os tubos. O passo mais crítico é a adição dos nano-artigos para concentrar os EV's, após a separação do gradiente de densidade.
Sem isso, a recuperação do EV é ruim. Gire a nanopartícula contendo frações de densidade durante a noite, a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugar as frações de densidade a 20.000 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente.
Descarte o líquido e lave a pelota EV duas vezes com 1X-PBS. Para preparar a pelota para o isolamento do RNA, suspenda-a 50 microliters de água autoclavada, deionizada, filtrada e tratada com depsia, de acordo com as instruções do manuscrito. O RNA pode então ser isolado, usando um kit comercial.
Para análise com eletroforese de gel, suspenda novamente a pelota em 15 microlitres de tampão Laemmli. Aqueça a amostra a 95 graus Celsius por três minutos. Repita o passo de aquecimento mais duas vezes, vórtice suavemente e girando a amostra entre os ciclos de calor.
Centrifugar a amostra por 15 segundos a 20.000 vezes G, e carregar o supernante diretamente no gel. Para obter melhores resultados, limite a quantidade de partículas carregadas no gel, e execute-a a 100 volts, para evitar que quaisquer nanopartículas carregadas entrem no gel. A precipitação peg permite uma recuperação ev significativamente mais eficiente do que a ultracentrifugação tradicional.
Ao usar 10 mililitros de cultura, essa abordagem resulta em um rendimento aproximadamente 500 vezes maior do que a ultracentrifugação. Essa abordagem também resulta em um aumento da eficiência de isolamento dos exosóis, o que é evidente através de níveis mais elevados de proteínas marcadoras exósiais. A análise do PLA ocidental mostra que um aumento de 3000 vezes no CD81, um aumento de quatro vezes no CD63 e um aumento de 40 vezes no CD9.
Além disso, este protocolo permite estudos a jusante de mecanismos mediados por VE na infecção pelo HIV1, isolando os VE de verões. A análise do PLA Ocidental mostra que os EV são encontrados em três populações fracionárias. Enquanto o vírus está presente em apenas dois deles.
A infração do EV 10,8 a 12 está livre de contaminação do vírus. A coisa mais importante a se lembrar é que as nanopartículas são cruciais para o enriquecimento ideal do EV. A adição deles é imperdível.
Muitos ensaios a jusante, como mancha ocidental, PCR, análise pura de diomeca por espectrometria de massa em ensaios celulares baseados em placas podem ser realizados. Estes permitem a caracterização, estudos mecanicistas e/ou funcionais. Esta técnica permite estudos específicos que examinam a carga e a funcionalidade de EV sem contaminar o fundo viral.
Isso fornece uma base para estudar os EV em patogênese e desenvolvimento de potenciais terapêuticas. Para superar as limitações dessa técnica, e aplicar a preparação e isolamento de EV a grandes volumes, recomendamos o uso de sistemas avançados, como filtragem de fluxo tangencial. O instrumento mais perigoso a ser usado é o ultracentrifuuge, durante a separação gradiente de densidade.
Certifique-se de que todos os tubos de centrífuga ponderem o mesmo, para evitar desequilíbrio e potencial falha do rotor.
