Nosso método fornece uma maneira rápida de entender o impacto funcional das variantes em Ube3a, uma ubiquitina ligase que causa a síndrome de Angelman e está fortemente ligada a uma forma genética de autismo conhecida como síndrome de Dup15q. A caracterização da atividade da ubiquitina ligase é tradicionalmente trabalhosa e lenta, e tais métodos são difíceis e não realmente passíveis de caracterizar as centenas de variantes identificadas para Ube3a. A síndrome de Angelman é causada pela deleção do gene Ube3a materno, enquanto a síndrome Dup15q é causada pela duplicação do Ube3a materno, por isso é importante deduzir como variantes missense mudaram a atividade da enzima Ube3a, e isso é algo que é difícil de fazer sem testar empiricamente cada variante.
Demonstrando o procedimento estará Jalin Stelzer, um técnico de pesquisa no meu laboratório. Comece realizando os ensaios em células HEK293T, cultivadas no Meio Águia Modificado de Dulbecco a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono em um recipiente umidificado, conforme descrito no manuscrito. Em um gabinete de biossegurança, coloque as células HEK293T suspensas em uma placa de fundo plano 96 bem tratada com cultura de tecidos e incube as células durante a noite a 37 graus.
No segundo dia, transfecte as células em um gabinete de biossegurança com plasmídeos repórteres Firefly e Renilla luciferase e plasmídeos Ube3a em triplicado. Realizar as transfecções em um volume total de 10 microlitros por poço. Crie uma mistura mestra para as transfecções para cada variante em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e incube à temperatura ambiente por 15 minutos.
Após a incubação, agite suavemente a mistura de transfecção batendo no tubo e, em seguida, adicione 10 microlitros da mistura de transfecção diretamente ao meio de crescimento existente nos poços. Depois, devolva as células à incubadora e permita que os plasmídeos se expressem por 48 horas. Usando um microscópio de fluorescência, monitore a eficiência da transfecção por fluorescência GFP.
Mais de 80% das células devem expressar GFP após 48 horas. Aspirar cuidadosamente os meios de cultura das células HEK293T transfectadas e, em seguida, lavar as células com PBS frio. Aspirar o PBS.
Adicione 25 microlitros de tampão de lise não desnaturante para lise celular e incube por 15 minutos no gelo com balanço suave. Em seguida, adicione 20 microlitros do lisado resultante em uma nova placa de ensaio de 96 poços contendo 100 microlitros de um reagente de substrato de luciferase Firefly e misture a placa suavemente tocando suavemente. Carregue a placa até um leitor de placas e meça a luminescência usando um detector superior com uma altura de leitura de um milímetro e um tempo de integração de um segundo.
Imediatamente após a leitura da luminescência da luciferase Firefly, adicione 100 microlitros de substrato de luciferase Renilla aos poços, o que extingue a atividade da luciferase Firefly enquanto avalia a atividade da luciferase Renilla. Misture as amostras por agitação suave da placa e meça a luminescência novamente para avaliar a atividade da luciferase de Renilla. Compare a atividade relativa das proteínas variantes quantificando as respostas do repórter e normalizando o valor de Firefly e Renilla para cada variante em relação ao tipo selvagem Ube3a.
As células HEK293T transfectadas com quantidades crescentes de plasmídeos que codificam Ube3a do tipo selvagem mostram um aumento linear na resposta BAR. O ensaio BAR identifica variantes dos plasmídeos ligadas à doença, demonstrando a precisão e a generalidade deste método. A tela de ensaio BAR para 152 variantes de Ube3a exibe perda benigna de função e ganho de mutações de função em relação ao Ube3a do tipo selvagem.
O ganho de função de substituição de glutamato, perda de função de substituição de prolina e outra perda de função substituição de arginina na posição 588 de Ube3a produziram efeitos drasticamente diferentes, ressaltando assim a importância da avaliação empírica de variantes. O gráfico de calor mostra resultados normalizados de BAR para análise mutacional abrangente na posição 588 em Ube3a. O sombreamento branco representa os níveis de atividade Ube3a do tipo selvagem, o sombreamento azul indica perda de função e o sombreamento vermelho indica ganho de mutações de função.
Além das implicações clínicas do nosso trabalho, o Ube3a é um membro da família de ligases ubiquitina do domínio HECT, que possuem o domínio catalítico HECT conservado. E eu acho que um dos aspectos fascinantes do nosso trabalho é que ele fornece dados ricos de função de estrutura sobre Ube3a, e isso pode ser usado para obter uma compreensão mecanicista mais profunda para esta classe de enzimas.
