Unsere Methode bietet einen schnellen Weg, um die funktionellen Auswirkungen von Varianten in Ube3a zu verstehen, einer Ubiquitin-Ligase, die das Angelman-Syndrom verursacht und stark mit einer genetischen Form von Autismus verbunden ist, die als Dup15q-Syndrom bekannt ist. Die Charakterisierung der Ubiquitin-Ligase-Aktivität ist traditionell arbeitsintensiv und langsam, und solche Methoden sind schwierig und nicht wirklich geeignet, um die Hunderte von Varianten zu charakterisieren, die für Ube3a identifiziert wurden. Das Angelman-Syndrom wird durch die Deletion des mütterlichen Ube3a-Gens verursacht, während das Dup15q-Syndrom durch die Duplikation des mütterlichen Ube3a verursacht wird, daher ist es wichtig abzuleiten, wie Missense-Varianten die Aktivität des Ube3a-Enzyms verändert haben, und dies ist etwas, das schwierig ist, ohne jede Variante empirisch zu testen.
Jalin Stelzer, ein Forschungstechniker in meinem Labor, demonstriert das Verfahren. Beginnen Sie mit der Durchführung der Assays in HEK293T-Zellen, die in Dulbeccos modifiziertem Adlermedium bei 37 Grad Celsius gezüchtet wurden, mit 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Behälter, wie im Manuskript beschrieben. In einer Biosicherheitswerkbank die suspendierten HEK293T-Zellen auf eine mit Gewebekultur behandelte 96-Well-Flat-Bottom-Platte auffüllen und die Zellen über Nacht bei 37 Grad inkubieren.
Am zweiten Tag transfizieren Sie die Zellen in einer Biosicherheitswerkbank mit Firefly- und Renilla-Luciferase-Reporterplasmiden und Ube3a-Plasmiden in dreifacher Ausfertigung. Führen Sie die Transfektionen in einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern pro Vertiefung durch. Erstellen Sie eine Mastermischung für die Transfektionen für jede Variante in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Nach der Inkubation rühren Sie die Transfektionsmischung vorsichtig, indem Sie auf das Rohr klopfen, und fügen Sie dann 10 Mikroliter der Transfektionsmischung direkt zu den vorhandenen Wachstumsmedien in den Vertiefungen hinzu. Danach bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück und lassen Sie die Plasmide 48 Stunden lang exprimieren. Überwachen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop die Transfektionseffizienz durch GFP-Fluoreszenz.
Mehr als 80% der Zellen sollten GFP nach 48 Stunden exprimieren. Saugen Sie die Kulturmedien vorsichtig aus transfizierten HEK293T-Zellen ab und waschen Sie die Zellen dann mit kaltem PBS. Saugen Sie die PBS ab.
Fügen Sie 25 Mikroliter nicht denaturierenden Lysepuffer für die Zelllyse hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten auf Eis mit leichtem Schaukeln. Dann fügen Sie 20 Mikroliter des resultierenden Lysats in eine neue 96-Well-Assay-Platte hinzu, die 100 Mikroliter eines Firefly-Luciferase-Substratreagenz enthält, und mischen Sie die Platte vorsichtig durch Anklopfen. Laden Sie die Platte auf einen Plattenleser und messen Sie die Lumineszenz mit einem Top-Detektor mit einer Lesehöhe von einem Millimeter und einer Integrationszeit von einer Sekunde.
Unmittelbar nach dem Lesen der Firefly-Luciferase-Lumineszenz fügen Sie 100 Mikroliter Renilla-Luciferase-Substrat in die Vertiefungen hinzu, wodurch die Firefly-Luciferase-Aktivität bei der Beurteilung der Renilla-Luciferase-Aktivität gelöscht wird. Mischen Sie die Proben durch sanftes Plattenrühren und messen Sie erneut die Lumineszenz, um die Renilla-Luciferase-Aktivität zu beurteilen. Vergleichen Sie die relative Aktivität von varianten Proteinen, indem Sie die Reporterantworten quantifizieren und den Firefly- und Renilla-Wert für jede Variante gegen den Wildtyp Ube3a normalisieren.
HEK293T-Zellen, die mit zunehmenden Mengen an Plasmid transfiziert wurden, die für den Wildtyp Ube3a kodieren, zeigen einen linearen Anstieg der BAR-Antwort. Der BAR-Assay identifiziert krankheitsgebundene Varianten der Plasmide und demonstriert die Genauigkeit und Allgemeingültigkeit dieser Methode. Der BAR-Assay-Screen für 152 Ube3a-Varianten zeigt einen gutartigen Funktionsverlust und Funktionsgewinn im Vergleich zum Wildtyp Ube3a.
Der Funktionsgewinn bei der Glutamatsubstitution, der Funktionsverlust der Prolinsubstitution und ein weiterer Funktionsverlust der Argininsubstitution an Position 588 von Ube3a führten zu drastisch unterschiedlichen Effekten, was die Bedeutung der empirischen Variantenbewertung unterstreicht. Das Heatplot zeigt normalisierte BAR-Ergebnisse für eine umfassende Mutationsanalyse an Position 588 in Ube3a. Die weiße Schattierung stellt Wildtyp-Ube3a-Aktivitätsniveaus dar, die blaue Schattierung zeigt Funktionsverlust an und die rote Schattierung zeigt den Gewinn von Funktionsmutationen an.
Über die klinischen Implikationen unserer Arbeit hinaus ist Ube3a ein Mitglied der HECT-Domänenfamilie von Ubiquitin-Ligasen, die alle die konservierte katalytische HECT-Domäne besitzen. Und ich denke, einer der faszinierenden Aspekte unserer Arbeit ist, dass sie reichhaltige Strukturfunktionsdaten über Ube3a liefert, und dies kann verwendet werden, um ein tieferes mechanistisches Verständnis für diese Klasse von Enzymen zu gewinnen.
