Nosso protocolo observa que o uso de extratos renais de vacas e suínos é um excelente recurso econômico para o estudo da fisiologia renal, examinando particularmente a correlação entre fator de crescimento endotelial vascular e outros analitos. Sempre foi um desafio correlacionar o VEGF, fator essencial de crescimento na angiogênese de órgãos, com outras proteínas. Essa técnica nos permite examinar a associação entre VEGF e analitos como hormônios.
Isso certamente avançará nossa base de conhecimento em relação a este importante fator de crescimento. Este método pode ser útil para correlacionar outros analitos em extratos cortical renais além dos mencionados neste vídeo. A demonstração visual ajudará outras pessoas a obter resultados reprodutíveis sem erros de amostragem.
O uso de tecido fresco é essencial para o sucesso desta técnica. É importante obter rins inteiros frescos imediatamente após o abate de um animal. Sempre transfira o tecido para o laboratório no gelo.
Use tesouras estéreis, fórceps, uma faca e placas de Petri para dissecar rins e extirir a porção de tecido necessária. Corte suavemente o rim ao meio ao longo do plano sagital e corte um pedaço de tecido da região do córtex no centro do rim. Pique o tecido em pequenos pedaços com a faca e transfira-o para um tubo de microfuge com um mililitro de tampão de extração de lise RIPA 1X frio.
Rotule o tubo com detalhes específicos da amostra e coloque-o no gelo. Use um homogeneizador portátil com uma sonda estéril para homogeneizar o tecido por um a dois minutos até que nenhum pedaço seja visível, em seguida, imediatamente centrifugar o tubo a 9.600 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, prepare alíquotas separadas da amostra para ELISA e análise total de proteínas para evitar múltiplos ciclos de congelamento/degelo.
Antes de iniciar o ensaio, leve todos os reagentes e a placa de ensaio à temperatura ambiente removendo os poços em excesso e armazenando-os a quatro graus Celsius até que usem mais. Diluir o tampão de lavagem 20X para 300 mililitros com água dupla destilada e configurar os poços em branco sem qualquer solução. Adicione 50 microliters de padrão ou amostra e outros 50 microliters de peroxidase de rabanete conjugados a cada poço, em seguida, adicione imediatamente 50 microliters de solução de anticorpos para cada poço e selar a placa.
Misture a placa e incuba-a a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, lave cada poço com 200 microliters de tampão de lavagem. Adicione 50 microliters de substrato A e substrate B a cada poço, misture a placa suavemente tocando na lateral, depois lacre e incuba-a no escuro por 15 minutos a 37 graus Celsius.
Adicione 50 microliters de solução stop a cada poço. Bata suavemente na placa e leia a absorvância em 450 nanômetros com um espectrômetro. Prepare os reagentes e lave o tampão como descrito anteriormente, em seguida, adicione 100 microliters de padrão ou amostra para cada poço, sele a placa, misture bem e incuba-a por duas horas a 37 graus Celsius.
Remova o líquido em cada poço e adicione 100 microliters de reagente de detecção A.Sele a placa e incuba-a por mais uma hora. Em seguida, lave cada poço com 400 microliters de tampão de lavagem, em seguida, adicione 90 microliters de solução de substrato para cada poço, bata suavemente na placa e incuba-a por mais uma hora a 37 graus Celsius. Após a última incubação, adicione 50 microliters de solução stop a cada poço, toque suavemente na placa e leia a absorvência em 450 nanômetros com um espectotógrafo.
Estime a proteína total dos extratos renais bovinos e suínos com um ensaio BSA padrão e use esta estimativa para normalizar os resultados de LH e VEGF-A-ELISA. Os níveis médios e medianos de LH e VEGF foram calculados tanto para animais quanto para os sexos. Após verificar a normalidade dos dados, foram utilizados modelos de regressão linear para examinar a relação entre LH e VEGF.
Foi encontrado um forte e significativo preditor de VEGF nos rins bovinos e suínos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de provar áreas idênticas em cada tecido. Um procedimento semelhante pode ser usado para extrair qualquer tipo de tecido.
Lembre-se de normalizar analitos por extrato total de proteína de qualquer tecido que você usa.
