Наш протокол отмечает, что использование экстрактов почек от коров и свиней является отличным и экономичным ресурсом для изучения физиологии почек, в частности изучения корреляции между сосудистым эндотелиальным фактором роста и другими аналитами. Это всегда было проблемой для корреляции VEGF, важным фактором роста в ангиогенезе органов, с другими белками. Этот метод позволяет нам исследовать связь между VEGF и аналитами, такими как гормоны.
Это, безусловно, будет способствовать нашей базе знаний в отношении этого важного фактора роста. Этот метод может быть полезен для корреляции других аналитов в почечных корковых экстрактов, кроме тех, упомянутых в этом видео. Визуальная демонстрация поможет другим получить воспроизводимые результаты без каких-либо ошибок выборки.
Использование свежих тканей имеет важное значение для успеха этого метода. Важно получить свежие целые почки сразу после забоя у животного. Всегда перенесите ткань в лабораторию на льду.
Используйте стерильные ножницы, типсы, нож и чашки Петри, чтобы вскрыть почки и вырезать необходимую часть ткани. Аккуратно разрежьте почку пополам вдоль сагиттальной плоскости и вырежьте кусок ткани из области коры головного мозга в центре почки. Фарш ткани на мелкие кусочки с ножом и передать его в трубку микрофуза с одним миллилитров ледяной 1X RIPA лиза извлечения буфера.
Этикетка трубки с конкретными деталями образца и поместите его на лед. Используйте портативный гомогенизатор со стерильным зондом, чтобы гомогенизировать ткани в течение одной-двух минут, пока не видны куски, а затем немедленно центрифуга трубки на 9, 600 раз g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугации подготовьте отдельные алициты образца для ELISA и общего анализа белка, чтобы избежать нескольких циклов замораживания/оттепели.
Перед началом анализа, довести все реагенты и анализ пластины для комнатной температуры удаления избыточных скважин и хранения их при четырех градусах по Цельсию до дальнейшего использования. Разбавить буфер 20X мыть до 300 миллилитров с двойной дистиллированной водой и создать пустые колодцы без какого-либо решения. Добавьте 50 микролитров стандартного или образца и еще 50 микролитров пероксидиса хрена к каждой хорошо, затем сразу добавьте 50 микролитров раствора антител к каждой хорошо и запечатайте пластину.
Смешайте пластину и инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. После инкубации, мыть каждый хорошо с 200 микролитров мыть буфера. Добавьте 50 микролитров субстрата А и субстрата B к каждой хорошо, аккуратно перемешайте пластину, постукивая по стороне, затем запечатайте и инкубировать ее в темноте в течение 15 минут при 37 градусах цельсия.
Добавьте 50 микролитров стоп-раствора к каждой колодец. Аккуратно коснитесь пластины и прочитайте абсорбанс на 450 нанометров с помощью спектрофотометра. Подготовка реагентов и мыть буфер, как описано ранее, а затем добавить 100 микролитров стандарта или образца для каждого хорошо, печать пластины, хорошо перемешать, и инкубировать его в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию.
Удалите жидкость в каждой хорошо и добавить 100 микролитров реагента обнаружения A.Seal пластины и инкубировать его еще на час. Затем промойте каждый колодец 400 микролитров буфера для мытья, затем добавьте 90 микролитров субстратного раствора к каждой хорошо, аккуратно коснитесь пластины и инкубировать ее еще на час при 37 градусах по Цельсию. После последней инкубации добавьте к каждой хорошо 50 микролитров стоп-раствора, аккуратно коснитесь пластины и прочитайте абсорбцию на 450 нанометров с помощью спектрофотометра.
Оцените общий белок экстрактов бычьих и свиных почек со стандартным анализом BSA и используйте эту оценку для нормализации результатов LH и VEGF-A-ELISA. Средний и средний уровни LH и VEGF были рассчитаны как для животных, так и для полов. После проверки нормальности данных для изучения взаимосвязи между LH и VEGF были использованы модели линейной регрессии.
Было установлено, что LH является сильным и значительным предиктором VEGF как в бычьих, так и в свиных почках. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы образец идентичных областей в каждой ткани. Аналогичная процедура может быть использована для извлечения любого типа ткани.
Не забудьте нормализовать аналиты по общей экстракт белка любой ткани вы используете.
