A interação HBX-DDB1 é um passo crucial para promover a transcrição do HPV a partir do CCCDNA, de modo que este protocolo pode se tornar um ativo fundamental para descobrir novos agentes terapêuticos para a cura funcional do HPV. Nosso procedimento é simples e requer apenas um curto período de tempo para tela. A interação que misturo pode ser detectada em tempo real sem precisar de lise celular.
Além disso, a qualidade de triagem é satisfatória com uma pontuação máxima Z. A inibição da interação HBX-DDB1 leva à restauração do Smc5/6, que resulta em supressão da transcrição do HPV, expressão proteica e produção de CCCDNA. Este novo mecanismo de ação antiviral pode superar as inadequações das terapias atuais do HPV.
Interações proteína-proteína são importantes alvos de drogas. O ácido à base de luciferase dividido descrito aqui, que tem como alvo as interações entre proteínas virais e hass, pode fornecer uma nova estratégia para desenvolver curas para outras doenças infecciosas. Embora nosso protocolo seja simples e fácil de entender, alguns passos podem ser difíceis de reproduzir sem a demonstração visual.
Assim, a demonstração visual será uma grande ajuda para entender nosso protocolo. Comece semeando cinco vezes 10 para as células HEK293T em um prato de 100 milímetros com 10 mililitros de DMEM, e incubando-as durante a noite a 37 graus celsius. No dia seguinte, diluir um micrograma cada um de HBx-LgBit e SmBit-DDB1 expressando plasmídeos de DNA e tampão de condensação de DNA para um volume total de 300 microliters.
Adicione 16 microliters de solução melhoradora e misture os tubos por vórtice por um segundo. Incubar a amostra à temperatura ambiente por três minutos e, em seguida, adicionar 60 microliters de reagente de transfecção. Vórtice do tubo por 10 segundos, e incubar a amostra por mais oito minutos.
Enquanto isso, aspire o meio do prato com as células e lave-os com cinco mililitros de PVS. Aspire o PVS e adicione sete mililitros de DMEM. Adicione três mililitros de DMEM ao tubo com os complexos de transfecção, pipeta para cima e para baixo para misturar, e adicione a mistura às células.
Em seguida, incubar as células a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por 10 horas. Após a incubação, remova o meio de cultura gasto e lave as células com cinco mililitros de PVS. Remova o PVS a um mililitro de 0,25% de trippsina EDTA, e incuba as células a 37 graus celsius para desligá-las.
Em seguida, adicione quatro mililitros de DMEM e disperse o meio ao escoria-lo sobre a superfície da camada celular várias vezes, e transfira a suspensão para um tubo. Centrifugar as células a 500 vezes G por cinco minutos, depois descartar o supernasce, e suspender novamente a pelota celular em um mililitro de PVS. Repita a cetrifugação e descarte o supernatante.
Em seguida, suspenda novamente a pelota celular com meio de cultura celular tamponada complementada com 10% de FBS a uma densidade de semeadura de um milhão de células por mililitro. Pipeta 50 microliters da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços, e retornar as células para a incubadora de 37 graus celsius por 10 horas. Enquanto as células estão incubando, dilui os compostos de triagem e solvente para concentração de 13,5 X.
Adicione 12,5 microliters de substrato luminescente a cada poço e incubar a placa por cinco minutos em temperatura ambiente. Meça a luminescência da linha de base com um luminômetro e adicione cinco microliters dos compostos e DMSO controlados a cada poço imediatamente depois. Meça a luminescência a cada 30 minutos durante duas horas e, em seguida, calcule os efeitos inibitórios dos compostos em comparação com o tratamento DMSO.
Os sinais de luminescência da linha de base foram medidos, e a relação sinal-fundo foi calculada para ser superior a 80. O z prime foi superior a 0,5, indicando que este sistema de ensaio é aceitável para a triagem de alto rendimento. Ao definir o limiar para maior inibição de 40% em comparação com o controle somente do DMSO, o nitazoxanide foi identificado como uma droga candidata.
Identificamos anteriormente o nitazoxanida como um inibidor da interação HBX-DDB1, rastreando uma biblioteca composta de pequena escala de reatividade com este método. Usando nitazoxanida, confirmamos essa inibição da interação HBX-DDB1, essa redução da transcrição viral e os níveis subsequentes do produto viral. A porção ideal da luciferase dividida fundida a uma proteína alvo deve ser determinada de antemão.
Neste caso, o HPX fundido ao Large Bit no cupins C do HPX e DDB1 fundido ao Small Bit no final do DDB1 proporcionou os melhores resultados.
