Meu laboratório tem estudado o papel do caminho de Hipopótamo no câncer de mama e pulmão, e recentemente, desenvolvemos um novo biosensor para monitorar a atividade de sinalização de Hipopótamo. Este método pode ser usado para responder a perguntas-chave sobre redes de sinalização celular, como como a via hipopótamo responde a fatores e como interage com outras vias de sinalização. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é sua grande sensibilidade e também o grande número de amostras pode ser processado de forma rápida e simultânea.
Esta técnica possui diversas aplicações em pesquisas básicas e translacionais para investigar os reguladores da via de sinalização hipopótamo tanto in vitro quanto in vivo. Para começar, mini-prep LATS-BS plasmids frescos da cultura líquida de bactérias DH5-Alpha. Uma hora antes da transfecção, aspire o meio da placa e adicione 500 microliters de meio de crescimento a cada poço.
Um ponto importante é que o biosensor LATS deve ser preparado fresco para obter a máxima expressão e atividade. Além disso, recomenda-se sempre usar um regulador upstream da via hipopótamo, como o MSD, como um controle positivo na realização de ensaios de luciferase. Depois disso, devolva as células à incubadora.
Em seguida, prepare a solução A, uma solução de DNA e a solução B, um reagente de transfecção à base de polímero diluído, conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, adicione imediatamente a solução B à solução A, e gentilmente pipeta para cima e para baixo para misturar. Incubar a amostra à temperatura ambiente por 15 minutos para permitir que os complexos de transfecção se formem.
Em seguida, adicione o volume total de peles de transfecção em termos de gota a cada poço da placa com redemoinho suave. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, remova a mídia de transfecção e substitua-a por uma nova mídia completa.
Em seguida, cultura as células a 37 graus Celsius por mais um dia. Diluir uma quantidade apropriada de 5x Tampão de lise passiva com água destilada. Então, aspire completamente a mídia da placa.
Adicione um mililitro de PBS a cada poço, e gire a placa suavemente para remover células separadas e mídia de crescimento residual. Em seguida, aspire completamente o PBS. Em seguida, adicione 250 microliters de 1xPLB a cada poço.
Coloque a placa de cultura em uma plataforma de balanço por 15 minutos para garantir a cobertura uniforme da monocamada celular com PLB. Depois disso, transfira o lysate para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Remova o LAR-2 do armazenamento de 80 graus Celsius e equilibre-o à temperatura ambiente.
Em seguida, prepare o reagente de detecção de Renilla para uma quantidade apropriada de ensaios. Adicione o reagente de detecção de Renilla ao substrato de 50x e ao seu buffer. Em seguida, distribua 10 microliters de cada célula lysate em tubos de 1,5 mililitro.
Em seguida, programe um luminômetro para realizar um atraso de dois segundos antes da medição, seguido de um período de medição de 10 segundos. Cuidadosamente, transfira 20 microliters de reagente LAR-2 em um tubo, e rapidamente pipeta para cima e para baixo para misturar. Em seguida, coloque imediatamente o tubo no luminômetro e inicie a leitura.
Após a leitura, remova o tubo de amostra do luminômetro, adicione 20 microliters de reagente Renilla e pipeta para cima e para baixo para misturar. Em seguida, coloque a amostra no luminômetro e inicie a próxima leitura. Primeiro, cultura, desprendimento, contagem e placa HEK293 Células-Ad como descrito no protocolo de texto.
Em seguida, uma hora antes da transfecção, aspire a mídia da placa e substitua-a por cinco mililitros de mídia de crescimento completa fresca. Por fim, adicione a solução diluída B à solução A e a pipeta para cima e para baixo para misturar. Em seguida, incubar a amostra à temperatura ambiente por 15 minutos antes de adicionar o volume total dos complexos de transfecção à placa, enquanto gira suavemente.
Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, tentepsinizar e contar as células. Placa 10.000 a 20.000 células em cada poço de uma placa de 96 poços em um volume total de 100 microliters de mídia por poço.
Depois disso, incubar as células por mais um dia. Uma a quatro horas antes de realizar o ensaio de luciferase, adicione agentes potencialmente regulando a via hipopótamo, em uma concentração final de 10 micromolar por poço. Em seguida, aspire a mídia completamente das células e lave as células em cada poço com 100 microliters de PBS.
Em seguida, adicione 20 microliters de PLB a cada poço. Coloque a placa de cultura em uma plataforma de balanço por 15 minutos. Em seguida, transfira 20 microliters de reagente LAR-2 para cada poço da placa, e pipeta para cima e para baixo para misturar.
Imediatamente depois disso, coloque a placa em um luminômetro de leitura de placas e inicie a leitura. Na primeira parte deste protocolo, o LATS-BS foi cotransfectado com diferentes genes para avaliar seu efeito na atividade de quinase LATS. No segundo protocolo, LATS-BS foi transfeinado em HEK293-Ad, e as células foram passadas para placas de 96 poços.
40 horas após a transfecção, as células foram tratadas com diferentes reguladores de pequenas moléculas conhecidas da sinalização de Hipopótamo, seguidos por um ensaio de luciferase. Ao interpretar os resultados desses ensaios, deve-se notar que proteínas e tratamentos medicamentosos podem ativar caminhos de feedback que influenciam a atividade biosensora. Outros experimentos serão necessários para confirmar uma relação entre o candidato e o caminho de sinalização do Hipopótamo.
Após este procedimento, outros métodos como PCR quantitativo em tempo real, ou Western Blot, podem ser usados para responder a perguntas adicionais sobre a atividade de quinase LATS. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores do campo da biologia do câncer explorarem a dinâmica e a atividade da quinase LATS e do caminho de sinalização de Hipopótamo em muitos processos biológicos e bioquímicos. Não se esqueça que os medicamentos para triagem podem ser extremamente perigosos, e as precauções apropriadas devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
