Este método facilita a caracterização efetiva dos métodos de quinase raf relacionados à doença. Esta técnica é altamente sensível e reprodutível, econômica, fácil de usar, e não requer nenhum equipamento avançado. Para medir a atividade catalítica dos mutantes da RAF, introduza mutações tecnológicas de bandeira na sequência de codificação da RAF pelo PCR, antes de inserir sequências inteiras no vetor apropriado de acordo com os protocolos padrão.
Insira o glutationo como sequência de codificação transferase a montante das sequências de codificação mutantes da RAF, para gerar vetores codificando glutationa como mutantes da RAF fundidos transferase, da mesma forma. Transvect 80%a 90% confluente culturas celulares 293T com os vetores codificando a bandeira marcada raf kinases ou seus mutantes, de acordo com protocolos de padrões. Após 24 horas de cultura, substitua o meio em cada cultura.
Após 48 horas de cultura, adicione 400 microliters de tampão de lise suplementados com inibidores de protease e fosfatase, a cada poço no gelo. Após cinco a 10 minutos, transfira os lises celulares para um tubo de 1,5 mililitro para centrifugação para sedimentar os detritos celulares. Transfira 300 microliters de cada amostra para tubos individuais de micro centrífugas de 1,5 mililitro.
Reserve 40 microliters por amostra para o sinal celular extra fóssil a jusante regulado quinase um e dois análises de expressão e atividade amino blot. Adicione 20 microliters de contas de afinidade anti-FLAG a cada tubo, para uma incubação de uma hora com rotação em uma sala fria de quatro graus Celsius. No final da incubação, lave rapidamente e suavemente as contas anti-bandeira uma vez com tampão de lise na sala fria e uma vez com tampão de reação de quinase antes de adicionar 20 microliters de mistura de reação quinase.
Mutantes gráficos com baixa afinidade dima podem perder sua atividade catalítica in vitro por causa da dissociação de Dima. Portanto, a lavagem rápida e suave é crítica. Depois de 10 minutos em temperatura ambiente com a inversão a cada dois minutos, pare as reações de quinase com cinco microliters de cinco tampão de amostra XSDS, por amostra e ferva as amostras a 90 graus Celsius por cinco minutos.
No final da incubação, execute as amostras em um gel de eletroforrose de 9 a 12% de poliacrilamida com SDS 0,1%, depois transfira as proteínas para uma membrana nitrocelulose para permitir a detecção dos níveis de proteína mitogógena ativada por fosfogênio quinase e mutantes raf em cada amostra, por imuno-blotting. Para avaliar a atividade alusica de mutantes da RAF mortos pela quinase, construa vetores codificando o receptor RAF ou os ativadores da RAF mortos quinase. Transvect 293 Células T com dois vetores codificando tanto o receptor RAF quanto o ativador RAF morto quinase, ou um único vetor codificando uma das proteínas como demonstrado.
Colhe toda a célula lysates após 48 horas de cultura como demonstrado, e misture rapidamente todo o lysato celular limpo com cinco tampão de amostra XSDS à temperatura ambiente, antes de ferver os lises por cinco minutos a 90 graus Celsius. Em seguida, execute as amostras de lise celular inteira cozida em um gel de eletroforese de 9 a 12% de poliacrilamida que é 0,1%SDS e transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose para detectar os níveis de sinal celular extra fosfo regulado quinase um e dois e controlar proteínas por manchas imunológicas como demonstrado. Para medir a relativa afinidade dimer e ou estabilidade dos mutantes da RAF construir vetores codificando os mutantes de rascunho de bandeira fundidos ao término da luciferase firefly ou o C Terminus uma luciferase vagalume.
Transvect 293 Células T com um par de vetores codificando diferentes e Terminus de mutantes da RAF de flumebra e C Terminus uma luciferase de vagalume mutantes da RAF como demonstrado. 24 horas após a transvecção relatar duas vezes 10 para a quinta transação de células T 293 por poço em placas de imagem preta cristalina em meio livre de cores. 48 horas após a transvesção adicione a luciferina a transvectents de células T de 293 e incubar por 30 minutos.
Antes de medir os sinais de luciferase em um sistema de detecção multi. No final da medição aspiram os supernatents, e os blices transacionados 293 células T com tampão lysas como demonstrado. Execute as amostras de lise celular inteira em um gel de eletroforese de poliacrilamida de 9 a 12% com SDS de 0,1%.
Detecte os níveis de expressão do término final dos mutantes da RAF firefly, ou o termo C dos mutantes da RAF por anti-bandeira amino blot como demonstrado. Em seguida, normalize os sinais de luciferase dos transvectantes de células 293 T de acordo com os níveis de expressão do término final da luciferase Firefly e C terminus de mutantes da RAF. A quinase in vitro pode ser usada para sondar efetivamente a atividade catalítica de alguns mutantes da coluna vertebral, mas não a de mutantes mortos da quinase com uma espinha C fundida.
A atividade catalítica de mutantes da RAF constitutivamente ativos com uma fraca afinidade ou estabilidade dimer, no entanto, pode não ser sondada usando este ASA como seus dimers são quebrados durante o processo de purificação. Para evitar a perda de atividade catalítica de mutantes da RAF com fraca afinidade ou estabilidade, esses mutantes podem ser fundidos com glutothionas transferase para resgatar a atividade catalítica dos mutantes. A CO-ativação DA RAF ASA pode ser usada para avaliar a atividade alusica dos mutantes da RAF mortos pela quinase.
Como ilustrados mutantes mortos quinase com um motivo terminal final ácido e fusão da coluna C, funcionam como ativadores alósicos para desencadear a atividade catalítica de mutantes com um motivo terminal final ácido não fosfor, quando co expresso em células 293T. Além disso, uma luciferase dividida gratuita pode ser usada para medir a relativa afinidade ou estabilidade das quinases familiares da RAF e seus mutantes. O uso de um tampão de lysas com baixa concentração de detergente, e um procedimento rápido de lavagem suave durante a purificação da amostra é essencial para um SA de quinase in vitro bem sucedido. Essa técnica ajudará os pesquisadores a determinar precisamente como a doença retransmite os mutantes da RAF, ativar o caminho a jusante, facilitando a seleção de estratégias terapêuticas adequadas para o tratamento da doença.
