Este método torna possível manipular e quantificar como as células se organizam coletivamente. Isso é importante porque podemos modelar o padrão em pistas in vitro e desembaraçar firmemente acoplado in vivo. A técnica requer equipamentos especializados mínimos, permitindo que seja estabelecida em um laboratório de biologia padrão, e é quantitativa, possibilitando a descoberta de eventos de padronização subfísico.
Este método pode ser facilmente aplicado a qualquer sistema celular onde a padronização possa surgir e descobrir padrões não aleatórios de diferenciação, proliferação e competição célula-celular. O principal com este método é a otimização sistemática dos parâmetros de micropatterning para novos tipos de células. Por exemplo, tamanho e forma do padrão, tipo de matriz e tempo de adesão celular.
Usando luvas, coloque um pedaço de filme de laboratório no fundo de uma placa de Petri de 10 centímetros quadrados. Use um furo de 12 milímetros para cortar lâminas de plástico hidrofóbicas para criar deslizamentos de cobertura de 12 milímetros e colocar os deslizamentos de cobertura em uma nova placa de Petri. Use pinças para remover cuidadosamente a película protetora dos deslizamentos da tampa.
Coloque a máscara fotográfica em uma superfície limpa e estável, lado cromado para cima, e adicione uma gota de dois microlitos de água duplamente destilada na posição do design do chip desejado. Pressione suavemente um deslizamento de tampa sobre a gota e coloque o suporte em cima dos slides de plástico. Conserte cuidadosamente este sanduíche com grampos para manter as peças plásticas em contato com a máscara fotográfica.
Coloque o conjunto em uma lâmpada de ozônio ultravioleta a aproximadamente dois centímetros da fonte de luz para uma iluminação de 10 minutos. No final do período de iluminação, segure o sanduíche com a máscara de foto na parte inferior e remova cuidadosamente os grampos enquanto mantém a pressão com uma mão para evitar que os slides se movam enquanto desmontam o sanduíche. Quando todos os grampos tiverem sido removidos, remova o suporte, tomando cuidado para que todas as peças de plástico ainda estejam na máscara e não grudem no suporte, e adicione água duplamente destilada aos chips para separar suavemente os chips da máscara fotográfica.
Coloque os chips com padrão fotográfico dentro da câmara de deposição de matriz, lado iluminado para cima e adicione 200 microliters de solução de revestimento em cada chip. Em seguida, adicione uma placa de Petri de três centímetros cheia de água duplamente destilada à câmara para limitar a evaporação a quatro graus Celsius durante a noite. Para semear células embrionárias nos chips, lave os chips com duas lavagens de pelo menos cinco minutos em PBS fresco e estéril por lavagem, antes de distribuir uma vez dez para as quintas células em 200 microliters do meio de cultura celular apropriada em cada chip.
Então feche a câmara de semeadura. Incubar por uma hora para permitir que as células aderam aos chips. Quando as células tiverem se acoplado, encha os poços de uma placa multiwell com 500 microliters de meio quente por poço, e use pinças estéreis para transferir os chips para poços de placas individuais.
Agite a placa vigorosamente para desprender quaisquer células não aderentes, e substitua imediatamente o supernante por meio fresco e quente. Em seguida, verifique sob o microscópio para observar se a padronização é visível. 48 horas após seu revestimento, as células devem formar colônias densas que seguem rigorosamente a forma dos padrões.
Deixando os chips na placa, remova todos, mas apenas o suficiente para evitar que os chips sequem, e adicione pelo menos 500 microliters de solução de fixação baseada em paraformaldeído ou PFA por poço. Após dez minutos, lave brevemente os poços três vezes com solução de lavagem, seguida de uma lavagem com cloreto de amônio de 50 milillar diluído em solução de lavagem para saciar a atividade de crosslinking pfa residual. Após a última lavagem, trate as amostras com solução de bloqueio por pelo menos 30 minutos.
Para imunossucultura das culturas de chip, transfira os chips para uma célula de câmara de coloração para cima, e adicione imediatamente 100 microliters da solução primária de anticorpos de interesse para cada chip. Depois de uma hora em uma plataforma rotativa à temperatura ambiente, lave os chips três vezes com solução de lavagem como demonstrado, e incuba os chips com os anticorpos secundários apropriados por uma hora na plataforma rotativa. No final da incubação secundária de anticorpos, lave os chips três vezes na solução de lavagem e monte o chip em um slide de microscopia com 20 microliters de qualquer meio de montagem padrão.
Para a imagem dos chips, ajuste primeiro a velocidade de digitalização, resolução de imagem, média de quadros e ganhos do detector para identificar um ideal entre a qualidade da imagem e o tempo de imagem. Em seguida, adquira imagens de cada chip. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, instale e execute PickCells seguindo a documentação disponível online, crie um novo experimento e importe as imagens para o programa.
Use o módulo Nessys para segmentar os núcleos com base no sinal do envelope nuclear. Use o módulo de segmentação básica para identificar o sinal de autofluorescência do padrão. Em seguida, clique em Concluir"e aguarde que todas as imagens sejam processadas.
Para criar objetos de núcleos e calcular os recursos básicos do objeto, inicie o módulo Recursos Intrínsecos a partir da barra de tarefas e feche os painéis Ellipsoid Fitter e Surface Extractor para manter apenas o painel Recursos Básicos aberto. Selecione o núcleo"como o Tipo de Objeto e selecione o prefixo fornecido para as imagens segmentadas. Em seguida, clique em Computar"e aguarde que todas as imagens sejam processadas.
Nesta fase, recursos adicionais precisam ser escritos em núcleos antes de exportar os dados para nossa análise. Por exemplo, para armazenar o nome da imagem a que cada núcleo pertence como atributo de núcleo, clique em Data"e Novo Atributo" e selecione núcleo" no diálogo pop-up. Clique em OK"selecione Coletar dados de outros objetos conectados ao nó" e clique em "Próximo" No painel esquerdo, selecione Imagem" e clique duas vezes na marca de interrogatório para definir o nó da imagem como alvo do caminho.
Expanda o painel de operação de redução e selecione Obter um"Expandir o painel atributo disponível e selecionar o atributo Nome. Em seguida, clique em Alterar"e Seguir"Digite o nome da imagem, pressione a tecla 'Guia' e clique em "Finalizar" Em seguida, exporte os dados para um arquivo de valor separado por guias. Para nossa análise, loop os dados exportados para a pasta de dados da pasta R-Script.
Abra nosso estúdio"e abra o modelo de mapa binned R-Script"Em seguida, defina o diretório de trabalho para o local do arquivo de origem e execute o script para gerar mapas de densidade. Uma hora após a semeadura celular, a cultura celular individual pode não ser totalmente confluente à medida que as células se proliferam ao longo do tempo. No entanto, os padrões se tornarão totalmente colonizados com apenas pouquíssimas células fora das superfícies adesivas.
A padronização que não está clara até duas horas após a semeadura indica uma falha do procedimento. O confinamento espacial de células-tronco embrionárias de camundongos em grandes discos ou micropatterns de anel guia a padronização de uma subsumes populacional de células expressando o marcador de braquiury mesodérmico. Por exemplo, quando as células-tronco embrionárias do rato são cultivadas em micropatterns de disco grande, as células braquiura-positivas são preferencialmente restritas à periferia do padrão onde a densidade celular local é a mais baixa.
Esta padronização é confirmada pelo mapa da intensidade cérebro-braquiury. Esses dados demonstram que o método pode revelar informações sub-visuais, pois a inspeção de uma colônia não é suficiente para identificar qualquer forma de organização espacial em marcador de expressão de interesse. Isso é notavelmente explicado pela importante variabilidade colônia-colônia.
A técnica também demonstra que não existe padronização detectável para inibidor de vinculação de DNA que pode indicar que a padronização T não é impulsionada pela sinalização de proteína morfogenética óssea neste contexto. Lembre-se sempre de que lado do deslizamento de tampa foi eliminado e revestido e também certifique-se de que as células aderiram corretamente antes de lavar as células em excesso. Este método permite o estudo das pistas ambientais importantes na orientação da auto-organização das células e também pode informar modelos matemáticos que nos ajudam melhor sob a padronização rudimentar.
