Nossa equipe de pesquisa desenvolve tecnologias e protocolos para microscopia crio-elétron e tomografia crio-elétron. Desenvolvemos protocolos para micropatterar redes TEM para direcionar o crescimento celular e o posicionamento para experimentos crio-ET. A tomografia crio-elétron de células inteiras é usada para produzir estruturas de resolução em nível de nanômetro de complexos macromoleculares dentro de células preservadas em um estado hidratado congelado nativo.
A micropatterning pode aumentar o rendimento de crio-ET de células inteiras, microscopia de elétrons de luz crio-correlativa e experimentos de moagem de feixe de íon-íon-crio-focado. O número e a distribuição de células nas redes EM são cruciais para estudos crio-ET de células inteiras. Este protocolo fornece um método rápido, reprodutível e amplamente adaptável para direcionar o crescimento celular nas redes EM através de micropatters.
O pesquisador deve estar confortável usando pipetas, pinças, técnicas básicas de cultura celular e microscópios eletrônicos de fluorescência e transmissão. Ao padronizar pela primeira vez, use um tipo de célula bem conhecido e combinação ECM e teste-os em tampas ou pratos MatTek. Os membros da equipe de pesquisa envolvidos neste desenvolvimento de protocolos são:Dr.
Brian Sibert, Sr. Joseph Kim e Dr. Jae Yang. Para começar, transfira as grades para um suporte de preparação de grade e descarrehe as grades do lado carbono para cima. Em seguida, transfira as grades com o lado carbono até um escorregador de vidro limpo ou deslize com pelo menos um centímetro de separação entre as grades.
Pipeta 10 microlitres de 0,05 poli-L-lysine em cada grade e incubar as grades em uma câmara úmida por pelo menos 30 minutos. Após a incubação, lave cada grade três vezes com 15 microlitres de 0,1 molar HEPES em pH 8,5. Incubar a grade em cada lavagem por 30 segundos e, em seguida, remova a maior parte do líquido da rede com uma pipeta sem deixar a grade secar.
Após a lavagem final, deixe cada grade em 15 microliters de 0,1 molar HEPES. Em seguida, prepare a solução PEG-SVA e substitua imediatamente a solução HEPES nas redes por 10 microliters da solução PEG-SVA e, em seguida, incubar as grades em uma câmara úmida por pelo menos uma hora. Após a incubação, lave cada grade três vezes com 15 microliters de água estéril, incubando a rede em cada lavagem por 30 segundos.
Após a lavagem final, deixe cada grade em 15 microliters de água. Coloque uma gota de água de um microliter no centro de uma nova tampa limpa, em seguida, transfira cuidadosamente a rede da gota de água de 15 microliter para a queda no novo deslizamento de tampas com o lado carbono para cima. Em seguida, coloque cuidadosamente no estêncil PDMS sobre a grade mantendo a grade centrada e minimizando o contato de estêncil com a folha de carbono da rede.
Em seguida, adicione um microliter de gel PLPP na grade e pipeta suavemente para misturar. Mova a tampa com a grade para um local escuro para secar. O gel secará em 15 a 30 minutos.
Para micropatterning, abra o software com uma visão Brightfield ao vivo do microscópio. Para projetar um novo modelo para uma execução inicial, selecione Adicionar ROI e escolha um círculo de 3.000 micrômetros. Posicione o ROI do círculo sobre a grade usando a imagem Brightfield na tela como guia e pressione Lock para proteger o ROI.
Depois de bloquear o ROI no lugar, selecione Adicionar padrão e escolha o padrão apropriado. Usando as opções de replicação, gere cópias do padrão inicial para criar uma região quadrada de oito por oito grades. Ajuste o espaçamento e o ângulo conforme necessário para alinhar os padrões com os quadrados da grade.
Posicione o padrão em um canto da grade. Em seguida, duplique o padrão e coloque uma cópia em cada um dos quatro cantos da grade movendo o estágio do microscópio conforme necessário para cada região. Use as opções de replicação para modificar uma região quadrada de oito por oito grades em uma região quadrada de duas por oito grades para ser colocada em ambos os lados do centro.
Deixe o centro quatro quadrados de grade sem ser forretado. Para cada padrão, ajuste a dose total, se necessário. 30 milijoules por milímetro quadrado é um bom ponto de partida.
Em Opções especializadas, iterar ajustando o ângulo, posição, espaço entre e proporção do padrão para refinar o alinhamento do padrão com os quadrados da grade. Mova o estágio do microscópio para alterar a região da grade no visor Brightfield. Uma vez que o modelo e os padrões estejam posicionados, desmarque todas, exceto uma das regiões do painel de ação do software.
Use o estágio do microscópio para navegar até aquela região e se concentrar na folha de carbono. Clique no ícone do globo ocular no painel de ação para alternar a exibição de sobreposição de padrão. Uma vez que a grade esteja em foco, feche o obturador Brightfield e pressione o ícone Play no canto inferior direito do software para iniciar o processo de padronização, que pode ser monitorado ao vivo.
Repita esta etapa até que todas as regiões estejam padronizadas. Finalmente, remova o deslizamento de tampa com a grade do microscópio e adicione imediatamente 10 microlitros de PBS estéreis na grade. Após 10 minutos, remova o estêncil com pinças, depois lave a rede três vezes com 15 microliters de PBS e deixe cada grade em PBS em um local escuro.
Prepare 15 microliters da matriz extracelular para cada grade, substitua o PBS de cada grade por 15 microliters da matriz extracelular e incubar a rede em uma câmara úmida por pelo menos uma hora. Após a incubação, lave cada grade cinco vezes com 15 microliters de PBS estéril, como demonstrado anteriormente. Após a lavagem final, deixe cada grade na PBS.
Usando um microscópio de fluorescência, detecte o fluoróforo na matriz extracelular para confirmar a padronização e que a folha de carbono permanece intacta. As células HeLa semeadas em grades TEM micropatteradas e não despachadas são visíveis por manchas fluorescentes usando um ensaio de viabilidade celular baseado em calcário AM e ethidium homodimer-1. Usando uma matriz extracelular de colágeno e fibrinogênio misto, as células HeLa facilmente aderem a padrões em toda a grade.
A morfologia geral das células que se expandiu ao longo do padrão é semelhante à das células cultivadas em grades não padronizadas. Uma imagem brightfield de células BEAS-2B infectadas 18 horas após a semeadura mostra a adesão e crescimento celular ao longo da região central do padrão. A maioria das células infectadas estão posicionadas ao longo da região central de maior densidade do padrão gradiente.
As variantes RSV estão localizadas perto da periferia das células BEAS-2B infectadas cultivadas em redes micropatteradas. Muitas proteínas estruturais RSV são identificadas dentro dos tomogramas, incluindo a proteína de fusão nucleocapsida e viral. Em redes micropatteradas, neurônios de Drosophila com expressão GFP pan-neuronal podem ser facilmente rastreados por microscopia leve devido à rotulagem fluorescente e sua localização estar dentro dos micropatterns.
Neurônios em redes não respingadas também podem ser rastreados através da sinalização GFP por microscopia leve. No entanto, localizá-los na microscopia crio-elétron torna-se difícil devido a detritos celulares e contaminação da mídia. Devido às dimensões do corpo celular neurônio e neurites estendidos, séries de inclinação crio-elétron são coletadas ao longo de regiões mais finas das células com maior ampliação.
A membrana celular neuronal, mitocôndrias, microtúbulos, filamentos de actina, estruturas vesiculares e macromoléculas como ribossomos são bem resolvidas em montagens de imagens de ampliação mais altas e fatias através do tomograma 3D. Características subcelulares semelhantes são observadas a partir de tomogramas 3D de neurônios não padrões. Aplicar o estêncil na grade e adicionar no gel PLPP é a etapa mais sensível que pode afetar os resultados de padronização e deve ser feito com cautela.
O Crio-CLEM pode ser usado para localizar alvos de interesse dentro das células para coleta de dados crio-ET. O Crio-FIB-SEM pode ser usado para finar células em áreas de outra forma muito grossas para coleta de dados.
