Cette méthode permet de manipuler et de quantifier la façon dont les cellules s’organisent collectivement. C’est important parce que nous pouvons modéliser le modèle in vitro et démêler les indices étroitement couplés in vivo. La technique nécessite un minimum d’équipement spécialisé, ce qui lui permet d’être établi dans un laboratoire de biologie standard, et il est quantitatif, ce qui permet la découverte d’événements de modelage sous-visuels.
Cette méthode peut facilement être appliquée à n’importe quel système cellulaire où le modelage pourrait émerger et pour découvrir des modèles non aléatoires de différenciation, de prolifération et de concurrence de cellule à cellule. Le principal avec cette méthode est l’optimisation systématique des paramètres de micropatration pour les nouveaux types de cellules. Par exemple, la taille et la forme du motif, le type de matrice et le temps d’adhérence cellulaire.
En portant des gants, placez un morceau de film de laboratoire au fond d’une boîte de Pétri carrée de 10 centimètres. Utilisez un poinçon de trou de 12 millimètres pour couper les glissières en plastique hydrophobe pour créer des glissements de couverture de 12 millimètres et placer les glissements de couverture dans une nouvelle boîte de Pétri. Utilisez des pinces à épiler pour retirer soigneusement le film protecteur des feuillets de couverture.
Placez le masque photo sur une surface propre et stable, côté chrome vers le haut, et ajoutez une goutte de deux microlitres d’eau double-distillée à la position de la conception désirée de puce. Appuyez doucement sur un slip de couvercle sur la chute et placez le support sur les glissières en plastique. Fixez soigneusement ce sandwich avec des pinces pour maintenir les morceaux en plastique en contact avec le masque photo.
Placez l’assemblage dans une lampe à ozone ultraviolet à environ deux centimètres de la source lumineuse pour un éclairage de 10 minutes. À la fin de la période d’éclairage, saisir le sandwich avec le masque photo en bas et retirer soigneusement les pinces tout en maintenant la pression d’une main pour empêcher les glissières de se déplacer tout en démontant le sandwich. Lorsque toutes les pinces ont été enlevées, retirez le support, en prenant soin que toutes les pièces en plastique sont encore sur le masque et non collées au support, et ajoutez de l’eau double-distillée aux copeaux pour détacher doucement les copeaux du masque photo.
Placez les copeaux photo-modelés dans la chambre de dépôt de matrice, le côté illuminé vers le haut, et ajoutez 200 microlitres de solution de revêtement sur chaque puce. Ensuite, ajoutez une boîte de Pétri de trois centimètres remplie d’eau double distillée à la chambre pour limiter l’évaporation à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour l’ensemencement des cellules embryonnaires sur les copeaux, lavez les copeaux avec deux lavages d’au moins cinq minutes dans du PBS frais et stérile par lavage, avant de distribuer une fois dix à la cinquième cellule dans 200 microlitres du milieu de culture cellulaire approprié sur chaque puce.
Fermez ensuite la chambre d’ensemencement. Incuber pendant une heure pour permettre aux cellules d’adhérer aux puces. Lorsque les cellules se sont fixées, remplissez les puits d’une plaque multiwell de 500 microlitres de milieu chaud par puits et utilisez des pinces stériles pour transférer les copeaux dans des puits de plaques individuels.
Secouez vigoureusement l’assiette pour détacher les cellules non adhérentes et remplacez immédiatement le supernatant par un milieu frais et chaud. Ensuite, vérifiez au microscope si le modelage est visible. 48 heures après leur placage, les cellules doivent former des colonies denses qui suivent rigoureusement la forme des motifs.
En laissant les copeaux dans la plaque, retirer tout sauf juste assez moyen pour empêcher les copeaux de sécher, et ajouter au moins 500 microlitres de paraformaldéhyde ou de solution de fixation à base de PFA par puits. Après dix minutes, laver brièvement les puits trois fois avec une solution de lavage, suivie d’un lavage avec du chlorure d’ammonium de 50 millimlaire dilué dans la solution de lavage pour étancher l’activité résiduelle de liaison croisée PFA. Après le dernier lavage, traiter les échantillons avec une solution de blocage pendant au moins 30 minutes.
Pour l’immunostaining des cultures de puce, transférez les puces dans un côté de cellule de chambre de coloration vers le haut, et ajoutez immédiatement 100 microlitres de la solution primaire d’anticorps d’intérêt à chaque puce. Après une heure sur une plate-forme rotative à température ambiante, laver les copeaux trois fois avec la solution de lavage comme démontré, et incuber les puces avec les anticorps secondaires appropriés pendant une heure sur la plate-forme rotative. À la fin de l’incubation secondaire d’anticorps, lavez les copeaux trois fois dans la solution de lavage et montez la puce sur une glissière de microscopie avec 20 microlitres de n’importe quel milieu de montage standard.
Pour imager les puces, ajustez d’abord la vitesse de numérisation, la résolution d’image, la moyenne des images et les gains de détecteur pour identifier un optimum entre la qualité de l’image et le temps d’imagerie. Puis acquérir des images de chaque puce. Lorsque toutes les images ont été acquises, installez et exécutez PickCells en suivant la documentation disponible en ligne, créez une nouvelle expérience et importez les images dans le programme.
Utilisez le module Nessys pour segmenter les noyaux en fonction du signal de l’enveloppe nucléaire. Utilisez le module de segmentation de base pour identifier le signal d’autofluorescence du motif. Ensuite, cliquez sur Terminer » et attendre que toutes les images soient traitées.
Pour créer des objets nucléaires et calculer les caractéristiques de base de l’objet, lancez le module Caractéristiques intrinsèques à partir de la barre des tâches et fermez les panneaux Ellipsoid Fitter et Surface Extractor pour ne garder que le panneau Fonctionnalités de base ouvert. Sélectionnez noyau " comme type d’objet, et sélectionnez le préfixe fourni pour les images segmentées. Ensuite, cliquez sur Calculer » et attendre que toutes les images soient traitées.
À ce stade, des fonctionnalités supplémentaires doivent être écrites en noyaux avant d’exporter les données pour notre analyse. Par exemple, pour stocker le nom de l’image à laquelle chaque noyau appartient en tant qu’attribut nucleus, cliquez sur Données « et Nouvel Attribut » et sélectionnez noyau"dans le dialogue pop-up. Cliquez sur OK « sélectionnez Collecter des données d’autres objets connectés au nœud » et cliquez sur Suivant"Dans le panneau gauche, sélectionnez Image » et double-cliquez sur la marque d’interrogation pour définir le nœud d’image comme cible du chemin.
Élargissez le volet Opération de réduction et sélectionnez Get One"Expand the Available Attribute pane et sélectionnez l’attribut Nom. Cliquez ensuite sur Modifier et Suivant « Entrez le nom de l’image, appuyez sur la touche Onglet et cliquez sur Terminer"Puis exportez les données vers un fichier de valeur séparé par onglets. Pour notre analyse, bouclez les données exportées vers le dossier de données du dossier R-Script.
Ouvrez notre studio » et ouvrez le modèle de carte binned R-Script"Puis définissez l’annuaire de travail à l’emplacement du fichier source, et exécutez le script pour générer des cartes de densité. À une heure après l’ensemencement cellulaire, les pattens de culture cellulaire individuelle peuvent ne pas être complètement confluents à mesure que les cellules prolifèrent au fil du temps. Cependant, les modèles deviendront entièrement colonisés avec seulement très peu de cellules en dehors des surfaces adhésives.
Le modelage qui n’est pas clair jusqu’à deux heures après l’ensemencement indique un échec de la procédure. L’enfermement spatial des cellules souches embryonnaires de souris sur de grands disques ou micropatrins d’anneau guide le modelage d’une sous-population de cellules exprimant le marqueur brachyury mésodermique. Par exemple, lorsque les cellules souches embryonnaires de souris sont cultivées sur des micropatrins à gros disques, les cellules brachyury-positives sont préférentiellement limitées à la périphérie du modèle où la densité cellulaire locale est la plus faible.
Cette configuration est confirmée par la carte de l’intensité cerveau-brachyurie. Ces données démontrent que la méthode peut révéler des informations sous-visuelles car l’inspection d’une colonie n’est pas suffisante pour identifier toute forme d’organisation spatiale dans le marqueur d’expression d’intérêt. Cela s’explique notamment par l’importante variabilité entre les colonies.
La technique démontre également qu’il n’existe aucun modelage détectable pour l’inhibiteur de l’ADN liant celui qui peut indiquer que t-modelage n’est pas entraîné par la signalisation de protéine morphogénétique d’os dans ce contexte. Rappelez-vous toujours quel côté de la feuille de couverture a éliminé et enduit et assurez-vous également que les cellules ont correctement adhéré avant de laver les cellules excédentaires. Cette méthode permet l’étude des indices environnementaux importants pour guider l’auto-organisation des cellules et peut également éclairer les modèles mathématiques qui nous aident mieux sous le modèle rudimentaire.
