A preparação de amostras compatíveis com espectrometria de massa de alta qualidade para análise abrangente de amostras oculares é fundamental para elucidar os mecanismos moleculares e caminhos de sinalização implicados na saúde e na doença. O fluxo de trabalho descrito representa uma abordagem simples, mas robusta, para rigorosas etapas de preparação amostral atendidas especificamente para análise de amostras limitadas em massa, como micro vasos sanguíneos oculares. Embora o principal objetivo do estudo seja estabelecer uma metodologia compatível com EM para vasos sanguíneos oculares, o fluxo de trabalho descrito pode ser amplamente aplicado a várias amostras baseadas em células e tecidos.
Geralmente, indivíduos novos nesse método podem lutar porque a identificação e isolamento da artéria ciliar curta posterior escolhida, ou ramos SPCA, pode ser desafiador. Os olhos suínos frescos, juntamente com nervo óptico e tecidos extraoculares, foram obtidos do matadouro local imediatamente após a morte. Coloque o globo ocular em uma câmara de dissecção contendo tampão Krebs-Henseleit gelado.
Corte cuidadosamente os músculos e tecidos ao redor com um par de tesouras mayo afiadas. Faça uma incisão com um bisturi, e corte o globo ao longo do plano equatorial com um par de tesouras mayo afiadas até que o olho seja separado nas metades anterior e posterior. Remova o máximo possível de corpo vítreo da metade posterior do olho usando um par de fórceps padrão padrão.
Depois de usar pinos de dissecção para fixar cuidadosamente a metade posterior do olho, corte suavemente os tecidos conjuntivos ao redor do nervo óptico, para expor a vasculatura retrobulbar subjacente com um par de tesouras de mola vannas estudantes. Isole a artéria ciliar posterior posterior parapótica e distal juntamente com os tecidos conjuntivos circundantes com um par de pinças de precisão tipo cinco e tesouras de capsulotomia Vannas. Remova suavemente os tecidos conjuntivos dos segmentos arteriais usando pinças e tesouras finas extras antes de enxaguar as artérias isoladas em PBS gelado para remover contaminantes e resíduos sanguíneos.
Artérias da piscina de dois olhos para obter uma réplica biológica, em seguida, pesar as amostras usando um equilíbrio analítico. Em cada tubo, adicione uma mistura de 0,5 e um milímetro de contas de óxido de zircônio seguido de reagente de extração de proteína tecidual. Agora, carregue os tubos de amostra em um homogeneizador de liquidificador.
Defina o temporizador para dois minutos, defina o nível de velocidade para seis e inicie a homogeneização. Após a execução, verifique as amostras para obter uma homogeneização completa e mantenha amostras no gelo entre cada corrida. Repita o ciclo até que as amostras estejam completamente homogeneizadas.
Homotize cuidadosamente a pipeta em tubos de microcentrifuuagem frescos. Centrifugar as amostras a 10.000 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius para pellet proteínas insolúveis. Pipeta cuidadosamente o supernascer contendo as proteínas solúveis sem tocar na camada de pelotas, e transfira para tubos de microcentrifuuge frescos.
Adicione 200 microliters de Protetor de Extração 2A e cinco microliters de coquetel inibidor de protease a cada amostra de pelota. Em seguida, suspenda a pelota várias vezes com uma pipeta. Use um homogeneizador ultrassônico para homogeneizar completamente a pelota.
Defina a amplitude para 60 e pedale para um. Use uma sonda feita de titânio, que é apropriada para homogeneização de amostras com pequenos volumes. Mergulhe a sonda na mistura de pelotas e tampão de extração no gelo e pressione o botão de partida.
Sonicar a amostra até que as moitas de pelotas estejam completamente homogeneizadas, parando por alguns segundos entre cada sônica. Verifique se há homogeneização completa visualmente. Misture o homogeneizar várias vezes com uma pipeta para garantir que não haja aglomerados.
Use dispositivos de filtro centrífugo com corte de três quilodalton para este procedimento. Insira a unidade do filtro de corte de três quilodaltons em um tubo de microcentrifuuagem. Pipeta 200 microliters de amostra homogeneizam-se a um dispositivo filtro, e adicionam 200 microliters de água deionizada no mesmo filtro.
Depois de cobri-lo com segurança, coloque a unidade do filtro em uma centrífuga e gire por 14.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, separe a unidade do filtro contendo o concentrado amostral do tubo de microcentrifuuagem contendo o filtrado, descartando o filtrado. Reconstitua o concentrado adicionando 400 microliters de água desionizada na unidade do filtro.
Depois de repetir a filtragem três vezes, pipeta cuidadosamente o concentrado da amostra limpa em um microtubo limpo. Prepare as amostras para eletroforese de gel unidimensional conforme listado no protocolo de texto e misture bem com uma pipeta. Aqueça as amostras a 70 graus Celsius em um aquecedor de bloco seco por 15 minutos e esfrie até a temperatura ambiente.
Carregue cuidadosamente 50 microgramas de amostra por faixa usando uma pipeta, bem como o padrão proteico prestained como marcador de massa molecular. Execute os géis por aproximadamente 60 minutos a uma tensão constante de 175 volts. No final da corrida, remova cuidadosamente o gel da placa de usando uma faca de gel, e transfira o gel para uma caixa de coloração de gel.
Realize a fixação e a coloração do gel conforme descrito no protocolo de texto. Agite os géis na solução de coloração durante a noite para obter melhores resultados globais. Decante cuidadosamente a solução de coloração e substitua por 200 mililitros de água deionizada antes de agitar os géis por pelo menos sete a oito horas na água para limpar o fundo.
Extite as bandas de proteína do gel com novas lâminas de microtome limpas. Corte a banda em pequenos pedaços e transfira cuidadosamente as peças de gel em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro. Adicione 500 microliters de solução de desestabilização contendo bicarbonato de amônio de 100 mililitros e acetonitrilo.
Incubar as amostras em temperatura ambiente por 30 minutos, com agitação ocasional. Pipeta cuidadosamente a solução de desestabilização. Verifique visualmente se há tubos com mancha residual e repita esta etapa se as peças de gel ainda estiverem manchadas de azul.
Adicione aproximadamente 400 microliters de solução DTT recém-preparada e incubar a 56 graus Celsius por 30 minutos. Depois de descartar a solução redutora com uma pipeta, adicione aproximadamente 400 microliters de solução IAA recém-preparada e incuba no escuro à temperatura ambiente por 30 minutos. Remova o tampão de alquilação com uma pipeta e descarte.
Adicione 500 microliters de acetonitrilo puro à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos, até que as peças de gel encolher e se tornar opacas. Pipeta para fora do acetonitrilo, e seque as peças de gel por cinco a 10 minutos sob o capô. Em seguida, pipeta 50 microliters de solução de trippsina em cada tubo para cobrir completamente as peças de gel, e incubar os tubos a quatro graus Celsius.
Após 30 minutos, adicione volume suficiente de tampão de trippsina para cobrir completamente as peças de gel, se necessário. Incubar as amostras durante a noite a 37 graus Celsius. Para realizar a extração de peptídeos, pipeta cuidadosamente a solução de peptídeo extraído dos tubos e transfira para microtubos limpos.
Seque o supernatante em um evaporador de vácuo centrífuga. Adicione 100 microliters de tampão de extração a cada tubo com peças de gel, e incubar por 30 minutos com agitação. Pipeta o supernatante nos mesmos microtubos contendo os peptídeos extraídos de acordo com suas respectivas bandas, e seque em uma centrífuga de vácuo.
Proceder à purificação de peptídeos e às análises de cromatização-eletrospramia líquida MS/MS, conforme descrito no protocolo de texto. A quantidade total de proteínas em amostras extraídas com cada tipo de detergente é retratada aqui. O maior rendimento veio dos tecidos extraídos com tampão de extração de proteína tecidual, seguido por DDM, CHAPS, ASB-14, e o menor rendimento da ACN e TFA.
Consistentemente, as proteínas totais identificadas também foram as mais altas na amostra extraída de proteínas teciduais, e seguiram a mesma tendência do rendimento total. Aqui é mostrada a comparação dos perfis proteicos de eletroforese de gel de uma dimensão da SPCA, antes e depois de serem submetidos às etapas otimizadas de preparação e limpeza da amostra. No geral, observou-se alto grau de mancha e má separação das faixas proteicas na faixa três.
Este perfil demonstra que as amostras podem conter reagente de extração, e também contaminantes como lipídios e detritos celulares. No entanto, as amostras de SPCA que foram separadas em supernasces e pelotas, e então submetidas ao protocolo otimizado, resultaram em perfis exemplares de eletroforese de gel unidimensional exemplar. O método otimizado para extração de proteínas rápidas, robustas e eficientes a partir de microvexes oculares também pode ser facilmente aplicado a outras amostras baseadas em tecidos.
Aqui são mostrados perfis proteicos do supernasal e a pelota de amostras de cérebro murino e tecido cardíaco. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar de submeter as amostras para completar a homogeneização, separar o sobrenante da pelota e remover os contaminantes e os reagentes de extração. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da oftalmologia experimental e translacional explorarem minuciosamente o proteome da vasculatura oscular usando os olhos suínos como modelo.
