Die Herstellung hochwertiger massenspektrometrieskompatibler Proben für eine umfassende Proteomanalyse von Augenproben ist entscheidend, um die molekularen Mechanismen und Signalwege zu klären, die mit Gesundheit und Krankheit zu kämpfen haben. Der beschriebene Arbeitsablauf stellt einen einfachen, aber robusten Ansatz für strenge Probenvorbereitungsschritte dar, die speziell für die Analyse von massenbegrenzten Proben wie okulären Mikroblutgefäßen vorgesehen sind. Obwohl das Hauptziel der Studie darin besteht, eine MS-kompatible Methodik für okuläre Blutgefäße zu etablieren, kann der beschriebene Arbeitsablauf weitgehend auf verschiedene zell- und gewebebasierte Proben angewendet werden.
Im Allgemeinen können Personen, die neu mit dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil die Identifizierung und Isolierung der gewählten kurzen hinteren Ziliararterie oder SPCA-Zweige eine Herausforderung darstellen kann. Frische Schweineaugen, zusammen mit Sehnerv und extraokularen Geweben, wurden sofort nach dem Tod aus dem lokalen Schlachthof gewonnen. Legen Sie die Augenkugel in eine Sezierkammer mit eiskaltem Krebs-Henseleit-Puffer.
Mit einer scharfen Mayo-Schere vorsichtig umumliegende Muskeln und Gewebe abschneiden. Machen Sie einen Schnitt mit einem Skalpell, und schneiden Sie den Globus entlang der äquatorialen Ebene mit einem Paar scharfer Mayo-Schere, bis das Auge in die vordere und hintere Hälfte getrennt ist. Entfernen Sie so viel Glaskörper wie möglich aus der hinteren Hälfte des Auges mit einem Paar Standard-MusterZange.
Nach der Verwendung von Sezierstiften, um die hintere Hälfte des Auges vorsichtig festzunageln, schneiden Sie das Bindegewebe, das den Sehnerv umgibt, vorsichtig ab, um die zugrunde liegende retrobulbare Vaskulatur mit einer Student-Vannas-Federschere freizulegen. Isolieren Sie die paraoptische und distale kurze hintere Ziliararterie zusammen mit den umgebenden Bindegeweben mit einer Präzisions-Pinzette vom Typ fünf und einer Vannas-Capsulotomieschere. Entfernen Sie das Verbindungsgewebe vorsichtig aus den arteriellen Segmenten mit einer extra fein gekippten Pinzette und Schere, bevor Sie die isolierten Arterien in eiskaltes PBS spülen, um Verunreinigungen und Blutrückstände zu entfernen.
Pool Arterien von zwei Augen, um eine biologische Replikation zu erhalten, dann wiegen Sie die Proben mit einem analytischen Gleichgewicht. Fügen Sie jeder Röhre eine Mischung aus 0,5- und ein Millimeter-Zirkonoxidperlen gefolgt von Gewebeproteinextraktionsreagenz hinzu. Laden Sie nun die Probenröhrchen in einen Mischerhomogenisator.
Stellen Sie den Timer auf zwei Minuten ein, stellen Sie den Geschwindigkeitspegel auf sechs ein, und starten Sie die Homogenisierung. Überprüfen Sie nach dem Laufen die Proben auf vollständige Homogenisierung und halten Sie die Proben zwischen den einzelnen Läufen auf Eis. Wiederholen Sie den Zyklus, bis die Proben vollständig homogenisiert sind.
Pipette sorgfältig zu frischen Mikrozentrifugenrohren homogenisieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, um unlösliche Proteine zu pelleten. Den Überstand, der die löslichen Proteine enthält, sorgfältig pipetten, ohne die Pelletschicht zu berühren, und in frische Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen.
Fügen Sie 200 Mikroliter Extraktionspuffer 2A und fünf Mikroliter Protease-Hemmer-Cocktail zu jeder Pelletprobe hinzu. Dann das Pellet mehrmals mit einer Pipette aufhängen. Verwenden Sie einen Ultraschallhomogenisator, um das Pellet vollständig zu homogenisieren.
Stellen Sie die Amplitude auf 60 ein und fahren Sie auf eins. Verwenden Sie eine Sonde aus Titan, die für die Homogenisierung von Proben mit kleinen Volumina geeignet ist. Tauchen Sie die Sonde in das Pellet- und Extraktionspuffergemisch auf Eis und drücken Sie den Startknopf.
Beschallen Sie die Probe, bis die Pelletklumpen vollständig homogenisiert sind, und pausieren Sie für ein paar Sekunden zwischen jeder Beschallung. Prüfen Sie visuell auf vollständige Homogenisierung. Mischen Sie das Homogenat mehrmals mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass es keine Klumpen gibt.
Verwenden Sie für dieses Verfahren Zentrifugalfiltergeräte mit Drei-Kilodalton-Cutoff. Legen Sie die Drei-Kilodalton-Cutoff-Filtereinheit in ein Mikrozentrifugenrohr ein. Pipette 200 Mikroliter Probe homogenisieren zu einem Filtergerät, und fügen Sie 200 Mikroliter entionisiertes Wasser in den gleichen Filter.
Nachdem Sie sie sicher gedeckelt haben, legen Sie die Filtereinheit in eine Zentrifuge und drehen Sie 14.000 Mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Trennen Sie nach der Zentrifugation die Filtereinheit, die das Probenkonzentrat enthält, vom Mikrozentrifugenrohr, das das Filtrat enthält, und entsorgen Sie das Filtrat. Rekonstituieren Sie das Konzentrat, indem Sie 400 Mikroliter entionisiertes Wasser in die Filtereinheit einfügen.
Nachdem Sie die Filtration dreimal wiederholt haben, konpipetten Sie das gereinigte Probenkonzentrat vorsichtig in ein sauberes Mikrorohr. Bereiten Sie die Proben für die eindimensionale Gelelektrophorese vor, wie im Textprotokoll aufgeführt, und mischen Sie sie gut mit einer Pipette. Die Proben bei 70 Grad Celsius in einem trockenen Blockheizer 15 Minuten erhitzen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Laden Sie vorsichtig 50 Mikrogramm Probe pro Spur mit einer Pipette sowie den vorgefärbten Proteinstandard als Molekularmassenmarker. Führen Sie die Gele ca. 60 Minuten bei einer konstanten Spannung von 175 Volt. Am Ende des Laufs das Gel vorsichtig mit einem Gelmesser von der Kassettenplatte entfernen und in eine Gel-Färbebox geben.
Führen Sie die Fixierung und Färbung des Gels wie im Textprotokoll beschrieben durch. Schütteln Sie die Gele in der Färbelösung über Nacht für beste Gesamtergebnisse. Dekantieren Sie die Färbelösung sorgfältig und ersetzen Sie sie durch 200 Milliliter entionisiertes Wasser, bevor sie die Gele mindestens sieben bis acht Stunden im Wasser schütteln, um den Hintergrund zu klären.
Die Proteinbänder mit sauberen neuen Mikrotomklingen aus dem Gel ausnehmen. Schneiden Sie das Band in kleine Stücke und übertragen Sie die Gelstücke sorgfältig in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren. Fügen Sie 500 Mikroliter Entsalzungslösung mit 100-Millimolar-Ammonium-Bicarbonat und Acetonitril hinzu.
Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 30 Minuten, mit gelegentlichem Schütteln. Die Entkernungslösung sorgfältig herausführen. Überprüfen Sie visuell auf alle Rohre mit Restfleck, und wiederholen Sie diesen Schritt, wenn Gelstücke noch blau gefärbt sind.
Etwa 400 Mikroliter frisch zubereitete DTT-Lösung hinzufügen und 30 Minuten bei 56 Grad Celsius brüten. Nach dem Wegwerfen der Reduktionslösung mit einer Pipette ca. 400 Mikroliter frisch zubereitete IAA-Lösung hinzufügen und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln brüten. Entfernen Sie den Alkylierungspuffer mit einer Pipette und entsorgen Sie ihn.
500 Mikroliter ordentliches Acetonitril bei Raumtemperatur 10 bis 15 Minuten hinzufügen, bis die Gelstücke schrumpfen und undurchsichtig werden. Das Acetonitril auspfeifen und die Gelstücke fünf bis zehn Minuten unter der Haube lüften. Dann Pipette 50 Mikroliter Trypsin-Lösung in jedes Rohr, um die Gel-Stücke vollständig zu bedecken, und bebrüten die Rohre bei vier Grad Celsius.
Nach 30 Minuten ausreichend Trypsinpuffer hinzufügen, um die Gelstücke bei Bedarf vollständig abzudecken. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius. Um die Peptidextraktion durchzuführen, pipettedien Sie vorsichtig die extrahierte Peptidlösung aus den Rohren und übertragen Sie sie in saubere Mikroröhren.
Trocknen Sie den Überstand in einem Zentrifugal-Vakuumverdampfer. Fügen Sie 100 Mikroliter Extraktionspuffer in jedes Rohr mit Gelstücken und inkubieren für 30 Minuten mit Schütteln. Den Überstand in die gleichen Mikroröhrchen, die die extrahierten Peptide entsprechend ihren jeweiligen Bändern enthalten, zu zerkleinern und in einer Vakuumzentrifuge auszutrocknen.
Fahren Sie mit Peptidreinigung und Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisation MS/MS-Analysen fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier wird die Gesamtmenge der Proteine in Proben dargestellt, die mit jedem Waschmitteltyp extrahiert werden. Der höchste Ertrag stammte aus Geweben, die mit Einem Gewebeproteinextraktionspuffer extrahiert wurden, gefolgt von DDM, CHAPS, ASB-14 und dem niedrigsten Ertrag von ACN und TFA.
Konsequenterweise waren die identifizierten Gesamtproteine auch die höchsten in der Gewebeproteinextraktionspuffer extrahiert E-Probe, und folgte dem gleichen Trend wie die Gesamtausbeute. Hier ist der Vergleich der eindimensionierten Gelelektrophorese-Proteinprofile von SPCA vor und nach der optimierten Probenvorbereitung und -reinigung zu sehen. Insgesamt wurde in Bahn drei ein hohes Maß an Verschmierung und schlechte Trennung der Proteinbänder beobachtet.
Dieses Profil zeigt, dass die Proben Extraktionsreagenz und auch Verunreinigungen wie Lipide und Zellablagerungen enthalten können. Die SPCA-Proben, die in Überstand und Pellet getrennt und dann dem optimierten Protokoll unterzogen wurden, führten jedoch zu beispielhaften eindimensionalen Gelelektrophoreseprofilen. Die optimierte Methode zur schnellen, robusten und effizienten Proteinextraktion aus augenförmigen Mikrogefäßen kann auch problemlos auf andere gewebebasierte Proben angewendet werden.
Gezeigt werden hier Proteinprofile des Überstandes und des Pellets von murinen Hirn- und Herzgewebeproben. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Proben einer vollständigen Homogenisierung zu unterwerfen, den Überstand vom Pellet zu trennen und die Verunreinigungen und die Extraktionsreagenzien zu entfernen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der experimentellen und translationalen Ophthalmologie den Weg, um das Proteom der oskulären Vaskulatur unter Verwendung von Schweineaugen als Modell gründlich zu erforschen.
