يعد إعداد عينات عالية الجودة متوافقة مع الطيف الطيفي لتحليل البروتيوم الشامل لعينات العين أمرًا بالغ الأهمية لتوضيح الآليات الجزيئية ومسارات الإشارة المتورطة في الصحة والمرض. يمثل تدفق العمل الموصوف نهجًا بسيطًا ولكنه قوي لخطوات إعداد العينات الصارمة التي يتم تلبيتها خصيصًا لتحليل العينات المحدودة الكتلة مثل الأوعية الدموية الدقيقة العينية. على الرغم من أن الهدف الرئيسي من الدراسة هو وضع منهجية متوافقة مع MS لأوعية الدم العينية، يمكن تطبيق تدفق العمل الموصوف على نطاق واسع على عينات مختلفة من الخلايا والأنسجة.
عموما، قد الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال لأن تحديد وعزلة اختيار الشريان الخلفي القصير، أو فروع SPCA، يمكن أن يكون تحديا. تم الحصول على عيون بورسين جديدة ، جنبا إلى جنب مع العصب البصري والأنسجة الخارجية ، من المسلخ المحلي على الفور بعد الوفاة. ضع كرة العين في غرفة تشريح تحتوي على عازلة Krebs-Henseleit الباردة للجليد.
قطع بعناية بعيدا العضلات المحيطة والأنسجة مع زوج من مقص مايو حادة. جعل شق مع مشرط، وقطع الكرة الأرضية على طول الطائرة الاستوائية مع زوج من مقص مايو حادة حتى يتم فصل العين إلى النصفين الأمامي والخلفي. إزالة الجسم الزجاجي قدر الإمكان من النصف الخلفي للعين باستخدام زوج من ملقط نمط القياسية.
بعد استخدام دبابيس التشريح لتثبيت بعناية أسفل النصف الخلفي من العين، وقطع بلطف بعيدا الأنسجة الضامة المحيطة العصب البصري، لفضح الأوعية الدموية الرجعية الكامنة مع زوج من مقص الربيع Vannas الطالب. عزل الشريان الأمامي القصير paraoptic وsytal مع الأنسجة الضامة المحيطة بها مع زوج من ملاقط الدقة من النوع الخامس ومقص فاناس capsulotomy. قم بإزالة الأنسجة الضامة بلطف من الأجزاء الشريانية باستخدام ملاقط ومقصات إضافية دقيقة قبل شطف الشرايين المعزولة في PBS الباردة لإزالة الملوثات وبقايا الدم.
تجمع الشرايين من عينين للحصول على تكرار بيولوجي واحد، ثم تزن العينات باستخدام توازن تحليلي. إلى كل أنبوب، إضافة خليط من 0.5 و1 ملليمتر من الخرز أكسيد الزركونيوم تليها الخرز أكسيد بروتين الأنسجة استخلاص. الآن، تحميل الأنابيب عينة في الخلاط التجانس.
تعيين جهاز ضبط الوقت إلى دقيقتين، تعيين مستوى السرعة إلى ستة، وبدء التجانس. بعد تشغيل، والتحقق من العينات التجانس الكامل والحفاظ على عينات على الجليد في ما بين كل تشغيل. كرر الدورة حتى يتم التجانس تماما العينات.
المتجانسة بعناية في أنابيب صغيرة جديدة. الطرد المركزي العينات في 10،000 مرات G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية إلى بيليه البروتينات غير القابلة للذوبان. بعناية الماصات الفائقة التي تحتوي على البروتينات القابلة للذوبان دون لمس طبقة بيليه، ونقلها إلى أنابيب صغيرة مركزية جديدة.
إضافة 200 ميكرولترات من استخراج العازلة 2A وخمسة microliters من كوكتيل مثبطات البروتياز لكل عينة بيليه. ثم، تعليق بيليه عدة مرات مع ماصة. استخدام التجانس بالموجات فوق الصوتية لتجانس تماما بيليه.
تعيين السعة إلى 60 ودورة واحدة. استخدام مسبار مصنوع من التيتانيوم، وهو مناسب لتجانس العينات ذات الأحجام الصغيرة. تزج في التحقيق في بيليه واستخراج خليط العازلة على الجليد، واضغط على زر البداية.
Sonicate العينة حتى يتم تجانس كتل بيليه تماما، والتوقف لبضع ثوان بين كل sonication. تحقق من التجانس الكامل بصريا. اخلطي المتجانس عدة مرات مع ماصة لضمان عدم وجود كتل.
استخدام أجهزة تصفية الطرد المركزي مع قطع ثلاثة كيلودالتون لهذا الإجراء. أدخل وحدة فلتر القطع ذات الثلاثة كيلودالتون في أنبوب microcentrifuge. Pipette 200 ميكرولترات من التجانس عينة لجهاز تصفية واحد، وإضافة 200 ميكرولترات من المياه ديونيد في نفس المرشح.
بعد وضعها بشكل آمن، ضع وحدة التصفية في جهاز طرد مركزي، وتدور لمدة 14،000 مرة G لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، فصل وحدة التصفية التي تحتوي على تركيز العينة من أنبوب الطرد المجهري الذي يحتوي على الترشيح، والتخلص من الترشيح. إعادة تشكيل التركيز عن طريق إضافة 400 ميكرولترات من المياه ديوند في وحدة التصفية.
بعد تكرار الترشيح ثلاث مرات، بعناية ماصة العينة تنظيفها التركيز في ميكروتيوب نظيفة. إعداد العينات لكهربية جل أحادية البعد كما هو مبين في بروتوكول النص، وخلط جيدا مع ماصة. سخني العينات على حرارة 70 درجة مئوية في سخان كتلة جافة لمدة 15 دقيقة، وتبرد لدرجة حرارة الغرفة.
قم بتحميل 50 ميكروغرام من العينة لكل حارة باستخدام ماصة بعناية، بالإضافة إلى معيار البروتين الملطخ كمعيار كتلة جزيئية. تشغيل المواد الهلامية لمدة 60 دقيقة تقريبا في الجهد المستمر من 175 فولت. في نهاية المدى، وإزالة بعناية هلام من لوحة كاسيت باستخدام سكين هلام، ونقل هلام في مربع تلطيخ هلام.
تنفيذ تحديد وتلطيخ الجل كما هو موضح في بروتوكول النص. يهز المواد الهلامية في حل تلطيخ بين عشية وضحاها للحصول على أفضل النتائج الشاملة. بعناية decant حل تلطيخ واستبدالها ب 200 ملليلتر من المياه الأيونية قبل هز المواد الهلامية لمدة سبع إلى ثماني ساعات على الأقل في الماء لمسح الخلفية.
استخراج عصابات البروتين من هلام مع شفرات microtome جديدة نظيفة. قطع الفرقة إلى قطع صغيرة، ونقل بعناية القطع هلام في أنابيب microcentrifuge 1.5 ملليلتر. إضافة 500 ميكرولترات من محلول الديستين التي تحتوي على 100 ميليملي الميكربونات و acetonitrile.
احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، مع اهتزاز في بعض الأحيان. ماصة بعناية من حل destaining. تحقق بصريا عن أي أنابيب مع البقعة المتبقية، وتكرار هذه الخطوة إذا قطع هلام لا تزال ملطخة باللون الأزرق.
إضافة ما يقرب من 400 ميكرولترات من حل DTT الطازجة، واحتضان في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد التخلص من محلول الخفض مع ماصة، أضف ما يقرب من 400 ميكرولترات من محلول IAA الطازج، واحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. إزالة العازلة alkylating مع ماصة وتجاهل.
إضافة 500 ميكرولتر من الأسيتونيتريل أنيق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة، حتى تتقلص قطع هلام وتصبح مبهمة. الماصات خارج الأسيتونيتريل، والهواء الجافة قطع هلام لمدة خمس إلى 10 دقائق تحت غطاء محرك السيارة. ثم، ماصة 50 ميكرولترات من محلول التربسين في كل أنبوب لتغطية قطع هلام تماما، واحتضان الأنابيب في أربع درجات مئوية.
بعد 30 دقيقة، إضافة حجم كاف من المخزن المؤقت التربسين لتغطية قطع هلام تماما إذا لزم الأمر. احتضان العينات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. لأداء استخراج الببتيد، ماصة بعناية محلول الببتيد المستخرج من الأنابيب ونقلها لتنظيف الأنابيب الدقيقة.
جفف المتبخر الفائق في جهاز تبخر فراغ الطرد المركزي. إضافة 100 ميكرولترات من استخراج العازلة إلى كل أنبوب مع القطع هلام، واحتضان لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز. الماصات المكبر في نفس الأنابيب الدقيقة التي تحتوي على الببتيدات المستخرجة وفقاً للنطاقات الخاصة بها، وتجف في جهاز طرد مركزي فراغي.
الانتقال إلى تنقية الببتيد و السائل الكروماتوغرافيا- كهربية تأين MS /MS التحليلات كما هو موضح في بروتوكول النص. يتم تصوير الكمية الإجمالية من البروتينات في العينات المستخرجة مع كل نوع من المنظفات هنا. وجاء أعلى عائد من الأنسجة المستخرجة مع العازلة استخراج بروتين الأنسجة، تليها DDM، CHAPS، ASB-14، وأقل عائد من ACN و TFA.
وعلى نحو متسق، كانت البروتينات الإجمالية المحددة هي الأعلى أيضاً في العينة العازلة المستخلصة من استخراج البروتينات النسيجية، واتبعت نفس الاتجاه الذي اتبعه إجمالي العائد. يظهر هنا هو مقارنة من البعد واحد جل الكهربائية الكهربائية ملامح البروتين من SPCA، قبل وبعد التعرض لإعداد العينة الأمثل وخطوات التنظيف. وعموما، لوحظ وجود درجة عالية من التشوه وسوء الفصل بين عصابات البروتين في الممر الثالث.
ويبين هذا الملف أن العينات قد تحتوي على كاشف الاستخراج، وكذلك الملوثات مثل الدهون والحطام الخلوي. ومع ذلك ، فإن عينات SPCA التي تم فصلها إلى فائقة بيليه ، ومن ثم خضعت للبروتوكول الأمثل ، أسفرت عن مثالية أحادية الأبعاد هلام التشكيلات الكهربائية. الطريقة الأمثل لاستخراج البروتين السريعة، قوية، وفعالة من microvessels العين يمكن أيضا أن تطبق بسهولة على عينات أخرى الأنسجة القائمة.
يظهر هنا ملامح البروتين من عظمى وبيليه من الدماغ مورين وعينات الأنسجة القلبية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر أن تخضع العينات إلى التجانس الكامل ، لفصل المابير عن البيليه ، وإزالة الملوثات وكواشف الاستخراج. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال طب العيون التجريبي والترجمة لاستكشاف بروتيوم الأوعية الدموية الداخلية بدقة باستخدام عيون البورcine كنموذج.
