Patógenos microbianos que se replicam intracelularmente devem eventualmente sair da célula infectada. Que, quando comparado com outros aspectos das interações de patógenos hospedeiros é relativamente subestudado. Aqui, descrevemos técnicas para analisar o efflux patógeno.
Mostramos como ensaios relativamente simples podem ser usados para avaliar a eficiência efflux ou caracterizar patógenos pós-efflux As técnicas gerais descritas aqui são amplamente aplicáveis, embora modelos específicos de células hospedeiras de patógenos possam diferir em cinéticas, dosagens e possivelmente leituras. Como na criação de qualquer sistema experimental, é essencial que sejam estabelecidos controles claros que garantam que processos biológicos genuínos sejam observados em amostras experimentais ou coortes. Demonstrando o procedimento será Petoria Gayle, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para começar com o experimento de infecção, use uma pipeta para adicionar 20 microliters do inóculo Lm recém-preparado aos poços, com o prato ligeiramente inclinado e a ponta da pipeta cuidadosamente colocada na mídia sobrelada. Evite tocar nas paredes do poço com a ponta da pipeta. Pipeta suavemente o conteúdo de cada poço para garantir a mistura completa.
Não agite ou incline significativamente a placa para evitar espalhar LM sobre as paredes do poço. Retorne o prato de cultura celular ao prato de 37 graus Celsius, 5% de incubadora de dióxido de carbono. Use mídia condicionada de células não infectadas como diluídas para preparar uma solução de 10 microgramas por mililitro de gentamicina.
Aos 30 minutos pós-infecção, adicione cuidadosamente 30 microliters da solução de gentamicina no prato para alcançar uma concentração final de microgramas de dois pontos e cinco por mililitro. Pipeta suavemente o conteúdo do poço para misturar e devolver o prato de cultura celular para a incubadora. Para colher, incline ligeiramente o prato e use cuidadosamente uma pipeta para remover toda a mídia do poço.
Adicione um ponto cinco mililitros de água destilada e estéril ao poço. Após 30 segundos, transfira o lise de água resultante para um tubo de microcentrífugo de um ponto e cinco mililitros e vórtice vigorosamente por 10 segundos. Adicione microlitres de quatro pontos e cinco e 50 microlitadores do liseu de água a 450 microliters de água destilada e estéril para preparar as diluições de dez vezes e cem vezes.
Brevemente vórtice para garantir a mistura completa. Adicione 50 microliters das amostras diluídas e cem vezes diluídas em placas de ágar de caldo lysogeny e espalhe usando um espalhador de placas. Para avaliar o LM emergente, extraia 10 microlitadores da mídia sobreposta do prato e divida-a em duas alíquotas de cinco microlitrais e tubos de microcrédito.
Adicione cinco microliters de DMEM/FCS a uma alíquota e adicione cinco microliters de DMEM/FCS contendo cinco microliters por gentamicina mililitro à segunda alíquota como controle. Espere cinco minutos em temperatura ambiente. Adicione 90 microliters de água estéril destilada a cada alíquota e vórtice os dois vigorosamente por 10 segundos.
Em seguida, adicione 50 microliters da amostra em placas de ágar LB e espalhe usando um espalhador de placas. Armazene as placas em incubadoras de 37 graus celsius por dois dias antes de enumerar colônias Lm. Usando um contador celular automatizado, ajuste as células preparadas, cruas de dois a quatro e sete pontos, para a concentração de uma vez 10 para a sexta célula-por-mililitro.
Adicione um mililitro da amostra a poços de uma placa de cultura de tecido de seis poços. Infecte as células com um Lm inóculo preparado, correspondendo a uma multiplicidade de infecção de 50. Em um ponto e cinco horas após a infecção, em um tubo de microcentrífuga de um ponto e cinco mililitros cheio de 500 microliters de 4% PFA, coletar mídia do primeiro conjunto de poços e colocar o tubo no gelo.
Para coletar Lm intracelular, adicione um mililitro de água destilada e estéril a cada poço. Após 60 segundos, transfira o lysato de água resultante para um tubo de microcentrífuga de um ponto e cinco mililitros com 500 microliters de 4% de PFA. Vórtice o tubo vigorosamente por 10 segundos e colocá-lo no gelo.
Para os poços remanescentes, remova a mídia e substitua por um mililitro de DMEM/FCS por cinco microgramas por mililitro gentamicin para matar lm extracelular.Devolva prontamente o prato à incubadora. Após 30 minutos, remova a mídia e substitua-a por DMEM/FCS sem gentamicina. Depois de mais duas e quatro horas, colete mídia em lysates pela segunda e terceira vez aponta para os tubos e coloque-os no gelo para esfriar.
Tubos de centrífuga a 10.000 vezes G por sete minutos. Usando uma pipeta, remova o supernasce sem perturbar a pelota. Adicione coquetel de coloração contendo 50 microliters de 4% pfa e 15 microliters de falo no tubo e misture para suspender cada pelota.
Incubar tubos no escuro a quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, adicione um mililitro de tampão FACS a cada tubo e pipeta para cima e para baixo para misturar. Gire tubos na centrífuga a 10.000 vezes G por sete minutos.
Remova o supernatante sem perturbar a pelota. Para uso imediato, suspenda cada pelota em 400 microliters de buffer FAX. Se armazenar para análise posterior, adicione 200 microliters de buffer FAX e 200 microliters de 4% PFA no tubo e misture para suspender.
Usando as condições de infecção no breve tratamento com o antibiótico gentamicina para eliminar lm não internalizado, zero-ponto-um-cinco por cento do tipo selvagem Lm é recuperado após um ponto-cinco horas de co-incubação com macrófagos cultivados. Na co-incubação subsequente, houve um aumento de quatro vezes e sete pontos na recuperação do LM viável, que representam exclusivamente a proliferação intracelular. Observou-se perfil comparável para a cepa Lm que possui um prfA hipervirulento durante a infecção inicial, mas não entre três e seis HPI.
Quando a prfA foi excluída da cepa Lm, há uma redução subsequente na recuperação da cepa após co-incubação prolongada. Quando a gentamicina é removida dos poços a seis HPI, o LM extracelular pode ser detectado uma hora depois para as cepas prfA do tipo selvagem e hipervirulenta, mas não para a cepa com prfA excluído. A sobreposição de mídia tanto macrófagos não infectados quanto infectados continha material particulado do tamanho de uma bactéria.
No entanto, apenas a mídia de macrófagos infectados possuía sinais positivos de GFP dentro do tamanho do gating. Observou-se aumento do tempo no aparecimento de mico-positivo de falo-positivo Lm com macrófagos infectados. Ao emplacar os macrófagos no prato de cultura tecidual de 48 poços, deixe alguns poços sem células.
Esses poços de controle sem células são então tratados exatamente como os poços contendo células, em termos da adição do patógeno, antibióticos, etc. para garantir que os sinais experimentais dependem da presença de células hospedeiras. Semelhante aos experimentos mostrados nas figuras um e três, fatores patógenos ou hospedeiros e ou pequenas moléculas podem ser testadas quanto ao seu impacto no efflux celular patógeno.
