Les agents pathogènes microbiens qui se répliquent intracellulairement doivent éventuellement sortir de la cellule infectée. Ce qui, par rapport à d’autres aspects des interactions avec les pathogènes de l’hôte, est relativement sous-étudié. Ici, nous décrivons les techniques d’analyse des efflux pathogènes.
Nous montrons comment des analyses relativement simples peuvent être employées pour évaluer l’efficacité d’efflux ou caractériser des agents pathogènes post-efflux Les techniques générales décrites ici sont largement applicables bien que les modèles spécifiques de cellules hôtes pathogènes puissent différer dans la cinétique, les dosages et peut-être les read-outs. Comme dans la mise en place de tout système expérimental, il est essentiel que des contrôles clairs soient établis pour s’assurer que des processus biologiques authentiques sont observés dans des échantillons ou des cohortes expérimentaux. Petoria Gayle, une étudiante diplômée de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pour commencer l’expérience d’infection, utilisez une pipette pour ajouter 20 microlitres de l’inoculum Lm fraîchement préparé aux puits, avec le plat légèrement incliné et la pointe pipette soigneusement placée dans le média qui s’en aille. Évitez de toucher les parois du puits avec la pointe de la pipette. Pipette doucement le contenu de chaque puits pour assurer un mélange complet.
Ne secouez pas ou n’inclinez pas de façon significative la plaque pour éviter de répandre du LM sur les parois du puits. Retourner le plat de culture cellulaire à l’incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et de cinq pour cent. Utilisez des supports conditionnés provenant de cellules non infectées comme diluant pour préparer une solution de gentamicine de 10 microgrammes par millilitre.
À 30 minutes après l’infection, ajouter soigneusement 30 microlitres de la solution de gentamicine dans le plat pour atteindre une concentration finale de deux points cinq microgrammes par millilitre. Pipette doucement le contenu du puits pour mélanger et retourner le plat de culture cellulaire à l’incubateur. Pour récolter, inclinez légèrement le plat et utilisez soigneusement une pipette pour retirer tout le corps du puits.
Ajouter des millilitres d’eau distillée stérile au puits. Après 30 secondes, transférer vigoureusement le lysate d’eau qui en résulte dans un tube de microcentrifugeuse d’un point cinq millilitres et vortex vigoureusement pendant 10 secondes. Ajouter quatre points cinq microlitres et 50 microlitres du lysate d’eau à 450 microlitres d’eau distillée et stérile pour préparer les dilutions décuplées et cent fois.
Vortex brièvement pour assurer un mélange complet. Ajouter 50 microlitres des échantillons dilués et cent fois dilués d’origine sur des plaques d’agar de bouillon de lysogène, et étendre à l’aide d’un épéiste de plaques. Pour faire des analyses pour l’émergence de LM, extraire 10 microlitres des supports superposés du plat et le diviser en deux aliquots de cinq microlitres et tubes de micro centrifugeuse.
Ajouter cinq microlitres de DMEM/FCS à un aliquot et ajouter cinq microlitres de DMEM/FCS contenant cinq microlitres par gentamicine millilitre au deuxième aliquot comme contrôle. Attendez cinq minutes à température ambiante. Ajouter 90 microlitres d’eau stérile distillée à chaque aliquot et vortex les deux vigoureusement pendant 10 secondes.
Ajouter ensuite 50 microlitres de l’échantillon sur les plaques d’agar LB et étendre à l’aide d’un épéiste. Conserver les assiettes dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant deux jours avant d’énumérer les colonies de Lm. À l’aide d’un compteur cellulaire automatisé, réglez les cellules préparées à deux six-quatre points sept brutes à la concentration d’une fois 10 à la sixième cellule par millilitre.
Ajouter un millilitre de l’échantillon aux puits d’une plaque de culture tissulaire de six puits. Infecter les cellules avec un inoculum Lm préparé, correspondant à une multiplicité d’infection de 50. À un point cinq heures après l’infection, dans un tube de microcentrifugeuse d’un point cinq millilitres rempli de 500 microlitres de quatre pour cent de PFA, recueillir les médias de la première série de puits et placer le tube sur la glace.
Pour recueillir lm intracellulaire, ajouter un millilitre d’eau distillée et stérile à chaque puits. Après 60 secondes, transférer le lysate d’eau résultant à un tube de microcentrifugeuse d’un point cinq millilitres avec 500 microlitres de PFA de quatre pour cent. Vortex le tube vigoureusement pendant 10 secondes et le placer sur la glace.
Pour les puits restants, retirer les supports et les remplacer par un millilitre de DMEM/FCS par de cinq microgrammes par gentamicine millilitre pour tuer lm.Promptement retourner le plat à l’incubateur. Après 30 minutes, retirer les supports et les remplacer par du DMEM/FCS sans gentamicine. Après encore deux et quatre heures, recueillir les médias en lysates pour les deuxième et troisième points dans les tubes et les placer sur la glace pour se détendre.
Tubes de centrifugeuse à 10 000 fois G pendant sept minutes. À l’aide d’une pipette, retirer le surnatant sans déranger la pastille. Ajouter le cocktail de coloration contenant 50 microlitres de PFA de quatre pour cent et 15 microlitres de phalloidin dans le tube et mélanger pour suspendre chaque granule.
Incuber les tubes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, ajouter un millilitre de tampon FACS à chaque tube et pipette de haut en bas pour mélanger. Faire tourner les tubes dans la centrifugeuse à 10 000 fois G pendant sept minutes.
Retirer le surnatant sans déranger la pastille. Pour une utilisation immédiate, suspendre chaque granulé dans 400 microlitres de tampon FAX. Si vous stockez pour une analyse ultérieure, ajouter 200 microlitres de tampon FAX et 200 microlitres de quatre pour cent PFA dans le tube et mélanger à suspendre.
En utilisant les conditions d’infection dans le traitement bref avec la gentamicine antibiotique pour éliminer lm non intériorisé, zéro point-un-cinq pour cent du Lm de type sauvage est récupéré après un point-cinq heures de co-incubation avec des macrophages cultivés. Dans la co-incubation suivante, il y a eu une multiplication par quatre et sept points-quintuple dans le rétablissement de Lm viable, qui représentent exclusivement la prolifération intracellulaire. Profil comparable a été observé pour la souche Lm possédant un prfA hypervirulent pendant l’infection initiale, mais pas entre trois et six HPI.
Lorsque le prfA a été supprimé de la souche Lm, il y a une réduction subséquente de la récupération de la souche après une co-incubation prolongée. Lorsque la gentamicine est retirée des puits à six HPI, lm extracellulaire peut être détecté une heure plus tard pour les souches prfA de type sauvage et hypervirulent, mais pas pour la souche avec prfA supprimé. Les macrophages non infectés et infectés par les médias contenaient des particules de la taille d’une bactérie qui se répandaient dans la lumière.
Cependant, seuls les médias provenant de macrophages infectés possédaient des signaux positifs GFP dans la taille gating. Une augmentation temps-dépendante de l’aspect du Lm phalloidin-positif a été observée avec les macrophages infectés. Lors du placage des macrophages dans le plat de culture tissulaire de 48 puits, laissez certains puits sans cellules.
Ces puits de contrôle sans cellule sont ensuite traités exactement de la même manière que les puits contenant des cellules, en termes d’ajout de l’agent pathogène, des antibiotiques, etc. pour s’assurer que les signaux expérimentaux dépendent de la présence de cellules hôtes. À l’semblable des expériences présentées dans les figures 1 et 3, les facteurs pathogènes ou hôtes et ou les petites molécules peuvent être testés quant à leur impact sur les efflux cellulaires pathogènes.
