Mikrobielle Pathogene, die sich intrazellulär replizieren, müssen schließlich die infizierte Zelle verlassen. Welche, im Vergleich zu anderen Aspekten der Wirt spathogen Wechselwirkungen ist relativ unterstudiert. Hier beschreiben wir Techniken zur Analyse der Pathogen-Effizienz.
Wir zeigen, wie relativ einfach Assays verwendet werden können, um entweder die Effizienz der Effizienz zu bewerten oder Post-Efflux-Erreger zu charakterisieren Die hier beschriebenen allgemeinen Techniken sind allgemein anwendbar, obwohl sich spezifische Pathogen-Wirtszellmodelle in Kinetik, Dosierungen und möglicherweise Auslesungen unterscheiden können. Wie bei der Einrichtung eines Versuchssystems ist es von wesentlicher Bedeutung, dass klare Kontrollen eingeführt werden, die sicherstellen, dass echte, biologische Prozesse in Versuchsproben oder Kohorten beobachtet werden. Demonstriert wird das Verfahren von Petoria Gayle, einer Studentin aus meinem Labor.
Um mit dem Infektionsexperiment zu beginnen, verwenden Sie eine Pipette, um 20 Mikroliter des frisch zubereiteten Lm Inoculum zu Den Brunnen hinzuzufügen, wobei die Schale leicht geneigt und die Pipettenspitze sorgfältig in die darüber liegenden Medien gelegt wird. Vermeiden Sie es, die Wände des Brunnens mit der Pipettenspitze zu berühren. Den Inhalt jedes Brunnens vorsichtig pipette, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten.
Schütteln oder kippen Sie die Platte nicht, um zu vermeiden, dass LM über die Wände des Brunnens verteilt wird. Geben Sie die Zellkulturschale auf den 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator zurück. Verwenden Sie konditionierte Medien aus nicht infizierten Zellen als Verdünnungsmittel, um eine 10 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin-Lösung vorzubereiten.
Nach 30 Minuten nach der Infektion 30 Mikroliter der Gentamicin-Lösung vorsichtig in die Schale geben, um eine endgültige Konzentration von zwei Punkt-fünf Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Den Inhalt des Brunnens sanft pipette, um die Zellkulturschale zu mischen und an den Inkubator zurückzugeben. Um zu ernten, leicht kippen Sie die Schale und verwenden Sie vorsichtig eine Pipette, um das gesamte Medium aus dem Brunnen zu entfernen.
Fügen Sie Punkt-fünf Milliliter destilliertes, steriles Wasser in den Brunnen. Nach 30 Sekunden das resultierende Wasserlysat in ein Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und Wirbel kräftig für 10 Sekunden übertragen. Fügen Sie vier Punkt-fünf Mikroliter und 50 Mikroliter des Wasserlysats zu 450 Mikroliter destilliertes, steriles Wasser hinzu, um die zehn- und hundertfachen Verdünnungen vorzubereiten.
Kurz Wirbel, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. 50 Mikroliter der ursprünglichen zehnfach verdünnten und hundertfach verdünnten Proben auf Lysogeny-Brühe-Agarplatten geben und mit einem Plattenstreuer verteilen. Um nach aufkommenden LM zu suchen, extrahieren Sie 10 Mikroliter der überlagernden Medien aus der Schale und teilen Sie sie in zwei Fünf-Mikroliter-Aliquots und Mikrozentrifugenröhren auf.
Fügen Sie fünf Mikroliter DMEM/FCS zu einem Aliquot hinzu und fügen Sie dem zweiten Aliquot als Kontrolle fünf Mikroliter DMEM/FCS mit fünf Mikrolitern pro Milliliter Gentamicin hinzu. Warten Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie 90 Mikroliter destilliertes steriles Wasser zu jedem Aliquot hinzu und wirbeln Sie die beiden 10 Sekunden lang kräftig aus.
Dann 50 Mikroliter der Probe auf LB Agarplatten hinzufügen und mit einem Plattenstreuer verteilen. Bewahren Sie die Platten in 37 Grad Celsius Inkubator für zwei Tage auf, bevor Sie Lm-Kolonien aufzählen. Passen Sie mit einem automatisierten Zellzähler die vorbereiteten, rohen Zwei-Sechs-Punkte-Sieben-Zellen auf die Konzentration von ein mal 10 auf die sechste Zelle pro Milliliter an.
Fügen Sie einen Milliliter der Probe zu den Brunnen einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte hinzu. Infizieren Sie die Zellen mit einem vorbereiteten Lm-Inokulum, was einer Vielzahl von Infektionen von 50 entspricht. Bei einer Punkt-fünf Stunden nach der Infektion, in einem Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 500 Mikroliter von vier Prozent PFA gefüllt, sammeln Medien aus dem ersten Satz von Brunnen und legen Sie die Röhre auf Eis.
Um intrazelluläres Lm zu sammeln, fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter destilliertes, steriles Wasser hinzu. Übertragen Sie das resultierende Wasserlysat nach 60 Sekunden in ein Mikrozentrifugenrohr mit 500 Mikrolitern vierprozentigen PFA. Wirbeln Sie die Röhre 10 Sekunden lang kräftig an und legen Sie sie auf Eis.
Für die verbleibenden Brunnen entfernen Sie die Medien und ersetzen Sie sie mit einem Milliliter DMEM/FCS mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin, um extrazelluläres Lm zu töten. Nach 30 Minuten Medien entfernen und ohne Gentamicin durch DMEM/FCS ersetzen. Nach weiteren zwei und vier Stunden, sammeln Sie Medien in Lysaten für den zweiten und dritten Zeitpunkt in die Röhren und legen Sie sie auf Eis zu kühlen.
Zentrifugenrohre bei 10.000 mal G für sieben Minuten. Entfernen Sie mit einer Pipette überstand, ohne das Pellet zu stören. Färbecocktail mit 50 Mikrolitern PFA und 15 Mikroliter Phalloidin in die Röhre geben und mischen, um jedes Pellet aufzuhängen.
Röhren im Dunkeln bei vier Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation fügen Sie jedem Rohr und jeder Pipette einen Milliliter FACS-Puffer nach oben und unten hinzu, um sie zu mischen. Spin Rohre in der Zentrifuge bei 10.000 mal G für sieben Minuten.
Entfernen Sie Überstand, ohne das Pellet zu stören. Für den sofortigen Gebrauch, setzen Sie jedes Pellet in 400 Mikroliter FAX Puffer. Wenn Sie für eine spätere Analyse speichern, fügen Sie 200 Mikroliter FAX-Puffer und 200 Mikroliter von vier Prozent PFA in die Röhre und mischen, um zu suspendieren.
Mit den Infektionsbedingungen in der kurzen Behandlung mit dem Antibiotikum Gentamicin, um nicht-internalisiertes Lm zu beseitigen, wird Nullpunkt-ein-fünf Prozent des Wildtyps Lm nach einem Punkt-fünf Stunden Co-Inkubation mit kultivierten Makrophagen wiederhergestellt. In der anschließenden Ko-Inkubation gab es eine vervierfachte und sieben-punkte-verfünffachte Zunahme der Wiederherstellung von lebensfähigem Lm, die ausschließlich die intrazelluläre Proliferation darstellen. Vergleichbares Profil wurde für den Lm-Stamm beobachtet, der während der Erstinfektion einen hyperviruleenten PrfA besitzt, jedoch nicht zwischen drei und sechs HPI.
Wenn die prfA aus dem Lm-Stamm gelöscht wurde, gibt es eine nachfolgende Verringerung der Erholung des Stammes nach längerer Ko-Inkubation. Wenn Gentamicin bei sechs HPI aus den Brunnen entfernt wird, kann extrazelluläres Lm eine Stunde später sowohl für Wildtyp- als auch für hypervirulenprfA-Stämme nachgewiesen werden, jedoch nicht für die Sorte mit gelöschtem prfA. Medien, die sowohl nicht infizierte als auch infizierte Makrophagen überlagerten, enthielten lichtstreuende, bakteriumgroße Partikel.
Allerdings besaßen nur Medien aus infizierten Makrophagen GFP-positive Signale innerhalb der Größe gating. Eine zeitabhängige Zunahme des Auftretens von Phalloidin-positivem Lm wurde mit infizierten Makrophagen beobachtet. Beim Ausschichten der Makrophagen in der 48-Well-Gewebekulturschale lassen Sie einige Brunnen ohne Zellen.
Diese no-cell Control-Brunnen werden dann genau so behandelt wie die zellhaltigen Brunnen, in Bezug auf die Zugabe des Erregers, Antibiotika usw., um sicherzustellen, dass experimentelle Signale von der Anwesenheit von Wirtszellen abhängig sind. Ähnlich wie in den Abbildungen eins und drei gezeigt, können Krankheitserreger oder Wirtsfaktoren oder kleine Moleküle auf ihre Auswirkungen auf den zellulären Exlux des Erregers getestet werden.
