Name: a simple method for isolation of soybean protoplasts and application to transient gene expression analyses
Uploaded: 2018-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa do genoma de plantas da National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).

1. o crescimento das plantas
<ol><li>5-10 sementes de soja (82 Williams) em uma panela de 13 cm em estufa sob condições de longo-dia (16 h de luz em 1.500 µmol m-2 s-1) a 25 ° C, a mistura de solo personalizada da porca para soja (a 1: proporção de 1:1 de areia do solo, perlite e torpedo).</li>
</ol>2. preparação do ADN do plasmídeo
<ol><li>Usando a ponta da pipeta estéril ou palito de dente, escolher uma única colônia ou estoque de glicerol congelados de Escherichia coli , carregando o plasmídeo contendo o gene de interesse e inoculá-lo em 20 mL de meio líquido de Luria-Bertani (LB) com antibióticos apropriados em um balão de 50 mL.</li>
	<li>Incube o frasco a 37 ° C durante a noite em uma coqueteleira. Recolha as bactérias por centrifugação a suspensão a 12.000 x g, à temperatura ambiente por 5 min e descartar o sobrenadante. Extrair e purificar o plasmídeo seguindo o procedimento do fabricante de um kit de preparação do plasmídeo.</li>
</ol>3. isolamento de protoplastos
<ol><li>Corte recém-expandido unifoliate folhas de plântulas de soja 10 dias de idade (Figura 1). Nota: A seleção das folhas em uma fase do desenvolvimento é a chave para o sucesso de preparação de protoplastos de soja. Só use folhas apenas expandidas em estágios iniciais do desenvolvimento. Como folhas maduras, paredes celulares tornam-se mais difícil de digerir.</li>
	<li>Com uma lâmina de barbear fresca, retire a nervura central da folha unifoliate e em seguida, corte os restos em 0,5-1 mm tiras. Nota: Duas folhas unifoliate digeridas em 10 mL de solução de enzima dará protoplastas suficientes para mais de 10 transformações.</li>
	<li>Usando um par de pinças, transferência a folha retira imediatamente e suavemente em 10 mL de solução recentemente preparada de enzima (tabela 1) em um tubo de 15 mL. Vácuo infiltrar a folha tiras para 15 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incube as tiras de folha na solução enzimática com agitação suave (40 rpm) sob condições de pouca luz para 4-6 h à temperatura ambiente. Certifique-se de que a solução de enzima ficar verde-amarelo, como os protoplastas são liberados. Verifique se a solução de enzima/protoplastas sob o microscópio (X10). Nota: Os protoplastas lançados são esféricos, enquanto as células não digeridas tem forma oval ou irregular.</li>
	<li>Transferir a 10 mL da solução de enzima/protoplastos em um tubo de 50ml derramando suavemente e adicionar 10 mL de solução de W5 (tabela 1) à temperatura ambiente para parar a digestão. Inverta o tubo suavemente várias vezes. Despeje delicadamente a solução enzimática/protoplastas em uma malha de nylon limpo 75 µm colocada em cima de um tubo de 50 mL para remover os tecidos da folha não digerido.</li>
	<li>Centrifugue a solução de fluxo através da enzima/protoplastas em 100 g de x no tubo de 50 mL por 1-2 min à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta sorológica 10ml sem perturbar o sedimento de protoplastos.</li>
	<li>Ressuspender os protoplastas e diluir para uma concentração de 2 x 105 mL-1 , na solução de W5 refrigerada a 4 ° C, contando número de protoplastos em um hemacytometer sob o microscópio (x10). Manter os protoplastas no gelo por 30 min.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de 100 g de x para 1-2 min à temperatura ambiente e remova cuidadosamente a solução W5 usando uma pipeta de 1ml sem perturbar o sedimento de protoplastos. Ressuspender os protoplastas em solução MMG (tabela 1) na concentração de 2 x 105 mL-1 , à temperatura ambiente.</li>
</ol>4. transformação de protoplastos
<ol><li>Faça 100 alíquotas µ l de protoplastas (2 x 104 protoplastas em 2 x 105 mL-1) em tubos de microcentrifuga de baixa adesão de 1,5 mL usando sem cortes pontas de pipetas 200 µ l. Colocar uma alíquota de lado para servir como controle negativo. Adicione 10 µ l de plasmídeo (10-20 µ g) em cada uma das parte alíquota do resto dos protoplastas.</li>
	<li>Lentamente, adicionar 110 µ l de solução recentemente preparada de PEG (tabela 1) na parede interna do tubo de microcentrifuga de 1,5 mL e depois inverta suavemente e rodar o tubo até que a solução se torne homogênea.</li>
	<li>Incube a mistura de transformação à temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Para parar a transformação, lentamente adicione 400 µ l de solução W5 no tubo de 1,5 mL à temperatura ambiente e inverta suavemente o tubo até que a solução se torne homogênea. Centrifugar o tubo a 100 g para 1-2 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de solução WI (tabela 1) para o tubo e ressuspender delicadamente pipetando 1 - 2 vezes. Adicione 1 mL de soro de 5% (vol/vol) bezerro estéril em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6-poços para revestir a superfície e evitar os protoplastas de degola para a placa.</li>
	<li>Após alguns segundos, descarte o soro de vitela com uma pipeta. Transferi os protoplastas ressuspensão em um poço da placa de cultura. Cubra o prato com uma tampa.</li>
</ol>5. protoplastos incubação e colheita
<ol><li>Incube os protoplastas à temperatura ambiente durante 1-2 dias no escuro. Nota: Achamos que dois dias de incubação rende mais forte sinal de proteína fluorescente, em geral, em relação à incubação de um dia, e que o sinal de proteína fluorescente pode durar até 3-4 dias.</li>
	<li>Transferi a solução de protoplastos para um tubo de microcentrifugadora de baixa adesão de 1,5 mL. Centrifugar o tubo a 100 x g por 1-2 min à temperatura ambiente a colheita protoplastas. Remover o sobrenadante com uma pipeta e transferir 10 protoplastas µ l numa lâmina de vidro.</li>
	<li>Observe o sinal fluorescente sob fluorescência ou microscopia confocal. Use protoplastas não-transformadas como controlo negativo (nenhum sinal deve ser observado).</li>
</ol>

<ol>
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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Este protocolo para a isolação de protoplastas de soja e o aplicativo para estudos de expressão transiente tem sido exaustivamente testado e funciona muito bem em nosso laboratório. Os procedimentos são simples e fáceis e exigem equipamento normal e custo mínimo. Nosso protocolo produz grandes quantidades de protoplastas uniforme, de alta qualidade em comparação com métodos anteriormente relatados34,35,36,37,38. No entanto, uma vez que existem muitos fatores que afetam o rendimento de protoplastos e taxas de transformação, é altamente recomendável para os investigadores otimizar as condições de acordo com suas condições experimentais, resultados desejáveis e materiais utilizados. Enquanto este sistema é extremamente útil para análise de eventos bioquímicos e regulamentares imediatos em pilhas da planta, não é apropriado para a observação dos processos celulares de longo prazo e eventos que ocorrem no tecido ou dos níveis.
Nós achamos que a selecção das crescendo vigorosamente materiais vegetais numa fase do desenvolvimento ideal era o fator mais crucial para a preparação de protoplastos de soja. Ele determina não só os rendimentos de protoplastas, mas qualidade que afeta a transformação subsequente de DNA. É importante sempre crescer plantas de soja em um ambiente de constante longe de qualquer stress, tais como seca, enchentes, temperaturas extremas ou pragas. A mais alta eficiência de produção e transformação de protoplastos pode ser conseguida usando apenas expandidas unifoliate folhas de mudas jovens. Para iniciantes, é aconselhável usar folhas de unifoliate em diferentes estádios de desenvolvimento e fazer uma comparação para obter os melhores resultados.
Relação de protoplastos/DNA é um fator importante para a eficiência de transformação ideal. Geralmente é melhor começar com a proporção de 2 x 104 protoplastas/10-20 µ g de DNA, mas a otimização da relação para construções individuais é recomendado25. É recomendável o uso de DNA obtido por um kit de purificação de DNA de alta qualidade.
Para a escolha dos vetores para expressão transiente em protoplastas, número alto-cópia e vetores de pequeno porte são geralmente preferidos. Embora o binário vectores de Agrobacterium tumefaciens-transformação mediada de plantas pode ser usado para a transformação de protoplastos, o grande tamanho destes vetores pode resultar em menor eficiência de transformação ideal. Para a expressão da proteína GFP-fusão, normalmente usamos vetores que não possuem um marcador de seleção para plantas e são, portanto, relativamente pequenos (6-7kb), tais como p2GWF7 e p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
Vários vetores podem ser usadas para transformar os protoplastas simultaneamente. Tivemos sucesso em expressar BiFC vetores para testar interações da proteína-proteína, bem como várias proteínas fluorescentes para a organela e rotulagem subcellular em protoplastas de soja. Além disso, a simplicidade e grandes rendimentos do nosso método oferece um sistema ideal para exame de eventos bioquímicos e regulamentares, o projeto de vetor gene-alvo, o isolamento de proteínas expressas transitoriamente e complexo de proteínas e purificação de específicos aproxima-se a organela como núcleos, permitindo que aplicativos mais emergentes genômica e proteômica.

Protoplastas são células vegetais que possuem paredes celulares removidas. Como eles mantêm a maioria dos recursos e atividades das células vegetais, protoplastas são um bom modelo sistema para observar e avaliar diversos eventos celulares e são ferramentas valiosas para estudar a hibridação somática1 e regeneração2da planta. Protoplastas tem sido também amplamente utilizados para planta transformação3,4,5, desde paredes celulares caso contrário iria bloquear a passagem de DNA para a célula. Protoplastas de possuam algumas das respostas fisiológicas e processos celulares de plantas intactas, oferecendo, portanto, o valor fundamental na pesquisa básica para estudar a localização Subcellular da proteína6,7,8, de9,de interações proteína-proteína10e o promotor atividade11,12,13 em células vivem.
O isolamento dos protoplastas de planta foi primeiramente relatado em 196014 e os protocolos para isolamento e transformação de protoplastas foram desenvolvidos e optimizados. Um procedimento padrão de isolamento de protoplastos envolve o corte de folhas e digestão enzimática das paredes celulares, seguido de separação de protoplastas lançados de restos de tecido não-digeridos. Estratégias de transformação inclui electroporation15,16, microinjeção17,18e baseadas em polietileno glicol (PEG)4,5,19 métodos. Uma grande variedade de espécies têm sido relatados bem sucedida para o isolamento de protoplastos, incluindo cítricas20, Brassica21, Solanaceae22 e outras famílias de plantas ornamentais23,24. Enquanto o tecido diversos tipos são usados em várias espécies, um sistema de expressão transiente em protoplastos de mesofilo de Arabidopsis (TEAMP) isolado de folhas da planta modelo Arabidopsis thaliana tem sido bem estabelecida25 e amplamente adotado para diversas aplicações.
Feijão de soja (Glycine max (L.) Merr.) é uma das mais importantes proteínas e óleo para as culturas26. Ao contrário de Arabidopsis e arroz, obtenção de plantas transgênicas de soja é conhecido por ser um pouco difícil e baixa eficiência. Agrobacterium tumefaciens-mediada por infiltração foi usada popularmente para estudos de expressão transiente gene nas células epidérmicas em tabaco27 e mudas em Arabidopsis28,29, Considerando que Agrobacterium rhizogenes tem sido usado para transformação de raízes peludas na soja30. Abordagens de silenciamento de gene induzida por vírus têm sido utilizadas para downregulation de alvo genes31,32 e transiente expressão33 de forma sistêmica. Protoplastas fornecem uma alternativa valiosa e versátil para essas abordagens. Protoplastas podem ser obtidos de materiais na superfície do feijão de soja e permitam a expressão do transgene rápida e sincronizada. No entanto, desde o isolamento de sucesso inicial de protoplastas de soja no 198334, houve limitados relatórios sobre a aplicação da protoplastas em soja35,36,37, 38, principalmente devido à relativamente baixos rendimentos de protoplastas de soja.
Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficiente para o isolamento de protoplastas de soja e sua aplicação para estudos de expressão transiente de gene. Usando o jovens unifoliate folhas de plântulas de soja, fomos capazes de obter grandes quantidades de protoplastas vitais dentro de algumas horas. Além disso, otimizamos a um método de transformação de PEG-cálcio-mediada que é simples e de baixo custo para entregar o DNA nas protoplastas de soja com alta eficiência.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELLULASE &quot;ONOZUKA&quot; R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>ICN Biomedicals</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plates</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EZNA plasmid miniprep kit</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>eppendorf</td><td>5811000827</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Pipet Controller</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Ingram&#039;s Nursery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perlite</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Sand</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox (Powder)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method for isolation of soybean protoplasts and application to transient gene expression analyses

Feijão de soja (Glycine max (L.) Merr.) é uma espécie de cultura importante e tornou-se um modelo de vegetal para os estudos das vias genéticas e bioquímicas. Portanto, é importante estabelecer um sistema de expressão de gene transiente eficiente em soja. Aqui, nós relatamos um protocolo simples para a preparação de protoplastas de soja e sua aplicação para análises funcionais transitórias. Nós achamos que o jovens unifoliate folhas de plântulas de soja resultaram em grandes quantidades de protoplastas de alta qualidade. Otimizando um método de transformação PEG-cálcio-mediada, atingimos a eficiência elevada de transformação usando protoplastas de unifoliate de soja. Este sistema fornece um modelo eficiente e versátil para exame dos complexos mecanismos de regulamentação e sinalização em células vivas de soja e pode ajudar a melhor compreender diversos processos celulares, fisiológicos e de desenvolvimento das leguminosas.

Diferentes órgãos de soja 10 dia de idade foram testados para a preparação de protoplastos (Figura 1) e rendimentos foram observados ao microscópio (Figura 2). Paredes celulares do hypocotyl e epicotyl foram mal digeridas, e algumas células ficaram anexadas ao outro (Figura 2B, 2C). No cotilédone (Figura 2D) e raiz (Figura 2A), paredes celulares foram removidas somente em uma pequena porção de células. Em contraste, um grande número de protoplastas foram observado quando unifoliate foi usado (Figura 2E-G). Unifoliate folhas em diferentes estádios de desenvolvimento foram posteriormente examinadas (Figura 2 H). Enquanto ambas as folhas unifoliate não expandidas e expandidas só resultaram em rendimentos elevados de protoplastas, o tamanho dos protoplastas de apenas expandido unifoliate eram mais uniforme (Figura 2F) do que os não expandido unifoliate (Figura 2E). Para o totalmente expandida unifoliate, as paredes celulares estavam ainda intactas na maioria das células (Figura 2). Testamos as enzimas de parede celular-digestão de três fabricantes diferentes e obteve resultados comparáveis, conforme descrito acima. Baseia-se estas observações, concluiu-se que a seleção de materiais vegetais foi um fator crucial e que apenas expandidas unifoliate folhas de plântulas de soja jovens eram o melhor material para a preparação de protoplastos.
Uma gama de diferentes quantidades de plasmídeo (0.1 µ g, 1 µ g, 5 µ g e 20 µ g) foi testada para a eficiência de transformação ideal dos protoplastas de unifoliate de soja (Figura 3A-D). 20 µ g Plasmídeo mostrou a mais alta eficiência de transformação com mais do que a taxa de transformação de 50% (Figura 3D), enquanto que 0,1 µ g apresentou a mais baixa (menos de 1%) (Figura 3A). Obtivemos a eficiência de transformação comparáveis utilizando diferentes kits de purificação de DNA de três fabricantes. Este resultado sugere que quantidades maiores de ADN do plasmídeo ajudaria enormemente para aumentar a eficiência de transformação.
Figura 4 é imagens confocal de protoplastas de soja transformadas com a construção p2GWF7-E1, que expressa a GFP fundido ao gene vegetal específico E1 (Glyma.06G207800), conduzido pelo promotor CaMV 35S em p2GWF7 o vetor 39. a proteína de fusão E1-GFP mostra localização nuclear em protoplastas de soja, que é consistente com um estudo anterior usando o de sistema de protoplastos de Arabidopsis40. Dado que E1 é um gene vegetal específico, nosso resultado usando o sistema de protoplastos de soja fornece uma visão conclusiva a Localização subcellular da proteína E1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig1.jpg"> Figura 1. Ilustração mostrando os órgãos de um seedling de soja que são testados para a preparação de protoplastos neste estudo, incluindo raiz, hypocotyl, cotilédone, epicotyl e unifoliate. Depois de um par de folhas unifoliate, mudas de soja desenvolvem folhas trifolioladas. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57258/57258fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig2.jpg"> Figura 2. Células de protoplastos preparadas a partir de diferentes órgãos e estádios de desenvolvimento de plântulas de soja. (A-D) Células preparadas a partir de diferentes órgãos de 10 dias de idade mudas de soja: raiz (A), hypocotyl (B), epicotyl (C), cotilédone (D). (E-G) Células de protoplastos preparadas a partir de folhas de unifoliate em diferentes estádios de desenvolvimento: não expandido (E), apenas expandido (F) e totalmente expandido (G) unifoliate, correspondente as mudas de soja em (H) à esquerda, meio e direito, respectivamente. Barra de escala é de 25 µm (A-G) ou 25 mm (H). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57258/57258fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig3.jpg"> Figura 3. Confocal imagens mostrando a eficiência de transformação de soja unifoliate protoplastas com diferentes quantidades de ADN do plasmídeo. Imagens de GFP (representada em verde) e brilhante campo (cinza) são mescladas. Protoplastas transformaram-se com diferentes quantidades do plasmídeo p2GWF7-E1: 0,1 µ g (A), 1 µ g (B), 5 µ g (C) e 20 µ g (D). Sinal de fluorescência de GFP foi monitorado 24 horas após transformação sob microscopia. Barra de escala preta é 50 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57258/57258fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig4.jpg"> Figura 4. Imagens confocal, mostrando a Localização subcellular de E1-GFP no núcleo de soja protoplastas unifoliate. O plasmídeo p2GWF7-E1 foi usado para a transformação. Imagens de GFP (representada em verde) e brilhante campo (cinza) são mescladas. Sinal de fluorescência de GFP foi monitorado 24 horas após a transformação. Barra de escala preta é 5 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57258/57258fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Solução de enzima (preparada na hora)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5,7</td>
			<td>20mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Celulase CELF</td>
			<td>2% (p/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pectolyase Y-23</td>
			<td>0,1% (p/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Manitol</td>
			<td>0,75 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1% (p/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTT</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Solução de W5</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>154 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>125 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5,7</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Solução de MMg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5,7</td>
			<td>4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Manitol</td>
			<td>400 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>15 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Solução de PEG (preparada na hora)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEG4000</td>
			<td>20% (p/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Manitol</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Solução de WI</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5,7</td>
			<td>4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Manitol</td>
			<td>0,5 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Soluções utilizadas para transformação e isolamento de protoplastos de soja.

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A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente para a preparação de grandes quantidades de protoplastas de soja estudar mecanismos complexos regulatórios e sinalização em células vivas.

Um método simples para o isolamento de aplicativo para análises de expressão de Gene transiente e protoplastas de soja

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

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24.7K visualizações.  California State University, Northridge. Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente para a preparação de grandes quantidades de protoplastas de soja estudar mecanismos complexos regulatórios e sinalização em células vivas.

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genética

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Ambiente

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Bioquímica

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Biologia

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robótica e Análise de Imagem Dinâmica de Estudos de Expressão Gênica em Tecidos Vegetais

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Produção de alta eficiência de raízes pilosas de soja transgênica

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with soil-borne microbes that form symbiosis to fix nitrogen and pathogens, which makes research involving soybean root genetics of prime importance to improve its agricultural production. The genetic transformation of soybean hairy roots (HRs) is mediated by the Agrobacterium rhizogenes strain NCPPB2659 (K599) and is an efficient tool for studying gene function in soybean roots, taking only 2 months from start to finish. Here, we provide a detailed protocol that outlines the method for overexpressing and silencing a gene of interest in soybean HRs. This methodology includes soybean seed sterilization, infection of cotyledons with K599, and the selection and harvesting of genetically transformed HRs for RNA isolation and, if warranted, metabolite analyses. The throughput of the approach is sufficient to simultaneously study several genes or networks and could determine the optimal engineering strategies prior to committing to long-term stable transformation approaches.

Autor em destaque: Transformação da raiz peluda da soja para a análise da função gênica  

Here, we present a protocol for the high-efficiency production of transgenic soybean hairy roots.

Transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

Bioengenharia

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Uma análise comparativa de Expressão de proteínas recombinantes em Diferentes biofábricas: bactérias, células de insectos e Sistemas de Plantas

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Um método simples para o isolamento de aplicativo para análises de expressão de Gene transiente e protoplastas de soja

Resumo

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Transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica

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