This research was supported by Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

1. Estabelecimento de culturas de células em suspensão <ol><li> Prepara-líquido, por 2 meios adicionando 4,43 g Linsmaier e Skoog, meio basal de 30 g de sacarose, 200 mg de KH 2 PO 4, e 200 g de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 900 mL de água destilada de água e o pH para 5,8 com 0,1 M KOH. Depois de ajustar o pH, ajustar o volume final a 1000 mL com água destilada e autoclave. Os meios podem ser armazenado até 2 semanas a 4 ° C. </li><li> Inocular um frasco Erlenmeyer de 250 mL com 100 ml de líquido BY-2 meios de comunicação e um única peça de BY-2 de calo (&gt; 1 cm em diâmetro) cultivadas num sólido por-dois meios (líquido BY-2 meios com a adição de 1% agar) e selar com folha de alumínio. Incubar a cultura a 28-30 ° C com agitação durante 5 dias. NOTA: BY-2 calo é mantida em meio sólido para armazenamento de longo prazo, como culturas líquidas irão rapidamente crescer demais. volume de cultura pode ser ajustado como necessário, tipicamente, um mL de cultura de 100 será capaz de carregar trinta e três 6-wplacas ELL. </li><li> Transferência de 2 ml de fase log BY-2 cultura a 98 mL de frescos Media By-2 e incubar por 5-7 dias a 28-30 ° C com agitação. NOTA: Sub-cultura de culturas líquidas estabelecidas pode ser levada a cabo regularmente utilizando 1: 100 diluições de 5-7 dias de idade, culturas, em vez do que a inoculação com calo. </li><li> Misturar cuidadosamente a cultura, as células irão resolver rapidamente, e a transferência de 6 ml da cultura de células para um tubo de centrifugação de fundo cónico de 15 ml e deixa as células assentar durante pelo menos 10 min. Ajustar o volume de células empacotadas a 50% do volume total, removendo o sobrenadante. </li><li> Agitar tubo, invertendo e pipeta de 500 uL em cada poço de uma placa de 6 poços para a digestão. Use pipetas de grande calibre para transferir as células nesta fase, visto que são densos e vai obstruir pontas de pipetas convencionais. </li></ol> 2. protoplastos Isolamento <ol><li> Ligue todos os componentes do sistema robótico (Figura 1A) e abrir a tarefa placa movimentador de agendamento suavelouça. O programa de agendamento de tarefas integra o motor de microplacas com o outro equipamento para permitir a transferência de placas entre cada peça de equipamento. </li><li> Antes da experimentação, definir as especificações técnicas de material de laboratório (por exemplo, pratos, tampas) utilizados no protocolo, bem como posições inicial e final para cada peça de material de laboratório, no software de placa de motor, como segue: <ol><li> Clique em Configuração no bar principal ferramenta no software placa motor e selecione o Container de comando Gerenciar Tipos. </li><li> Se o tipo de recipiente é listada na biblioteca de tipo de recipiente existente, em seguida, selecione o recipiente adequado. </li><li> Se o tipo de recipiente não estiver listado na biblioteca tipo de recipiente existente, em seguida, clique em Adicionar para especificar um novo tipo de recipiente. </li><li> Depois de adicionar um novo tipo de recipiente, insira as dimensões do novo contêiner (altura, largura, dimensões de empilhamento, e pinça de compensação) nas guias apropriadas e clique em Salvar.<ol><li> Se as dimensões corretas não estão disponíveis a partir do fabricante, em seguida, determinar com precisão todas as dimensões ao milímetro utilizando pinças. Erros na medição das dimensões do contêiner irá resultar em falha do motor placa. </li></ol></li><li> Repita os passos 2.2.2 através 2.2.4.1 para todos os tipos de recipiente que o motor placa vai encontrar. Depois de se completar este passo para todo o material usado, é necessário definir o início e o fim de localização para cada recipiente (passo 2.2.6). NOTA: Para este protocolo o material de laboratório inclui a placa de 6 poços, a placa de poço profundo, ea placa de rastreio de 96 poços fluorescente. </li><li> Para definir a posição de início e fim de cada recipiente, clique na guia Início / Fim de um protocolo específico. Primeiro, selecione a posição de início de cada recipiente. Em seguida, marque a caixa Lidded / Unlidded tanto no início e fim posição. Repita o procedimento para todos os recipientes. NOTA: Se o recipiente será deixado em um outro pedaço de equipment (em vez do motor de placa) a localização final pode ser deixado em branco. </li></ol></li><li> Nesta fase carregar manualmente todas as placas para a posição inicial para todo o fluxo de trabalho. Carregar as placas de 96 poços de rastreio fluorescente no hotéis 2, placas de 6 poços com células BY-2 em Hotel 3, uma placa 96 de poço profundo que vai ser utilizado para a transformação em placa de aquecimento / arrefecedor ninho 2, e uma cónico de 50 ml tubo contendo a solução de enzima (ver arquivo suplementar, Secção 1.2.2) para o distribuidor multi-modo. <ol><li> Se transformação vai ser levada a cabo no protocolo, pré-carregar a placa de poços profundos com 96 a 10 ul de plasmídeo de ADN por cavidade (1 mg / mL, Uma 260/280&gt; 1,8) contendo a construção repórter OFP e incubar no prato aquecedor / refrigerador a 4 ° C. Cada poço vai ser usado para uma única transformação, portanto, o número de poços cheios dependerá da configuração experimental. </li></ol></li><li> Coloque todos os suprimentos e placas no automatizard plataforma de manipulação de líquidos nos locais designados e definir a posição de cada item no software de controle de automação (Figura 1B). <ol><li> Carregar uma placa de 96 poços pré-carregado com 200 uL de PEG a 40% em MMG (manitol 0,4 M, MgCl2 100, MES 4 mM, pH 5,7) na coluna 1, 200 ul de iodeto de propídio (PI, 1 ug / ml) na coluna 2, e 200 mL de etanol na coluna 3 (ninho 2), e uma caixa de pontas de pipeta no ninho 8. </li><li> Para definir a localização do material de laboratório no software da plataforma automatizada de manipulação de líquidos, selecione Ferramentas no menu e clique em Editor médico laboratorial. </li><li> Selecione o tipo de material de laboratório no menu suspenso ou definir um novo tipo de material de laboratório usando o botão New médico laboratorial. </li><li> Definir a posição de cada pedaço de material de laboratório selecionados, selecionando a guia Protocolo principal e clicando em Configurar médico laboratorial. Certifique-se de que cada pedaço de material de laboratório colocado sobre a plataforma de manuseamento de líquidos é automatizadodefinida antes de executar o protocolo. </li><li> Para acionar os protocolos automatizados, clique janela do Explorer do perfil e selecione o nome do protocolo a ser executado (protoplastos isolamento, contagem de células, e Transformação mediada por PEG). </li><li> Clique em Executar para inicializar todos os dispositivos que serão usados no protocolo. </li><li> Finalmente, na janela de trabalho Explorer, clique em Adicionar Unidade de Trabalho para verificar todos os recipientes / material de laboratório no sistema e começar o protocolo automatizado. NOTA: As descrições completas dos protocolos automatizados estão contidos no arquivo suplementar. </li></ol></li></ol> 3. Estabelecer curva padrão para contagem de células <ol><li> Concentrar manualmente protoplastos, a uma concentração de 1 x 10 6 protoplastos / ml num volume de 1 ml. Centrifugar protoplastos a 1.000 xg durante 10 min, e remover o sobrenadante. </li><li> Manualmente adicionar 900 ul de etanol a 70% (mantida a 4 ° C) para o sedimento de protoplastose re-suspender o pellet. Incubar durante 10 min em gelo para fixar as células. </li><li> Adicionar 100 ul de Pi (1 ug / ml) aos protoplastos para rotular os núcleos e permitem a detecção de pelo leitor de placas. </li><li> Carga de 80 ul de líquido BY-2 meios para cada coluna e linha de rastreio da placa de 96 poços de fluorescência a partir de coluna 2. </li><li> Na coluna 1 da placa de 96 poços de rastreio fluorescente, adicionar 70 ul de protoplastos e 50 uL BY-2 meios para cada poço na coluna. </li><li> Coloque a placa no ninho 6 da plataforma de manipulação de líquidos automatizado, e executar uma diluição em série de 2 vezes. <ol><li> Para realizar uma diluição em série na plataforma de manipulação de líquidos automatizado, clique em Assistente de diluição de série Lançamento e ajustar o volume de transferência (60 pi), o número de misturas e de volume (2, 70 mL), poços iniciais (coluna 1, linhas AF), a diluição Wells (Colunas 2-11, linhas AF), e aspirado e dispensar propriedades (0,5 mm de bem inferior). </li><li> Depois de definir os parâmetros, salvar umd executar o protocolo. NOTA: Uma vez que todos os protoplastos são marcadas com PI (devido à fixação das células), a fluorescência é proporcional à concentração de protoplastos. </li><li> Após a diluição em série é concluída, remova a placa do ninho 9 e inserir no leitor de placas e executar o protocolo de curva padrão no software leitor de placas. NOTA: Uma curva padrão irá então ser gerado por comparação da fluorescência de PI (excitação 536 nm / emissão 620 nm) em cada poço com a concentração de protoplastos conhecido. </li></ol></li><li> Após a conclusão do protocolo de leitor de placas, remova a placa e recolher as células transgênicas para autoclave ou outros procedimentos de-vitalização tal como definidas em protocolos de biossegurança &quot;. </li></ol> 4. Análise microscópica da Transformação <ol><li> Retire a placa com protoplastos transformados (o produto de Automated Protocolo 3, Supplemental Arquivo) do Hotel 1 do sistema robótico. </li><li> vezem microscópio invertido, câmera, e lâmpada fluorescente. </li><li> Seleccione a objectiva 10X inicial para incidindo sobre os protoplastos, ligue a lâmpada de halogéneo, e fechar o obturador para a lâmpada fluorescente. </li><li> placa de carga em sistema microscópica e foco nos protoplastos usando brightfield. </li><li> Depois de focar protoplastos, desligar a lâmpada de halogéneo e abrir o obturador para a lâmpada fluorescente. </li><li> Seleccionar o filtro CY3 / TRITC definido para a visualização da proteína expressa por pporRFP os protoplastos transgénicos. </li><li> Digitalizar cada poço para determinar o número de protoplastos expressando o pporRFP marcador fluorescente. </li><li> Calcula-se a eficiência de transformação medida que o número total de protoplastos que expressam o marcador fluorescente o número total de protoplastos. </li><li> Recolher quaisquer placas contendo células transgênicas em sacos de biossegurança aprovados para autoclave ou outros procedimentos de-vitalização tal como definidas em protocolos de biossegurança &quot;. </li></ol>

Os autores declaram que não têm qualquer interesse financeiro que faça concorrência.

O protocolo acima descrito foi validada com êxito para o isolamento de protoplastos, enumeração e transformação usando a cultura de células em suspensão BY-2 de tabaco; No entanto, o protocolo pode ser facilmente estendida a qualquer planta de cultura em suspensão. Actualmente, o isolamento e transformação de protoplastos foi alcançado em numerosas plantas, incluindo o milho (Zea mays) 10, cenoura (Daucus carota) 32, álamo (Populus euphratica) 33, d...

Nos últimos anos tem havido um impulso significativo colocado sobre a concepção de culturas transgênicas para superar várias doenças 1, dotar resistência a herbicida 2, conferem seca 3,4 e tolerância ao sal 5, evitar herbivoria 6, aumentar a produção de biomassa 7, e diminuir a recalcitrância da parede celular 8. Esta tendência foi ajudada pelo desenvolvimento de novas ferramentas moleculares para a geração de plantas transgénicas, incluindo genoma de edição utilizando CRISPR e TALENS 9, e silenciamento de genes por meio de ARNcd de 10, 11 miARN, e ARNsi 12. Embora estas tecnologias simplificaram a geração de plantas transgênicas, eles também criaram um gargalo, onde o grande número de plantas transgénicas gerada não podem ser rastreados usando sistemas tradicionais que dependem de regeneração de plantas. Relacionado com este gargalo, enquanto que o silenciamento e de edição de genoma construções podem ser rapidamente inserido em plantas, muitos doscaracterísticas visadas não conseguem produzir o efeito desejado, o que muitas vezes não é descoberto até que as plantas são analisados ​​na estufa. Neste trabalho, nós desenvolvemos um método para o rápido rastreio automatizado, de alto rendimento de protoplastos de plantas, especificamente para lidar com o gargalo de corrente no rastreio inicial de um grande número de genoma de edição e silenciamento de genes alvos. O uso de protoplastos, em oposição às células de plantas intactas, tem várias vantagens para o desenvolvimento de uma plataforma automatizada. Em primeiro lugar, os protoplastos são isolados após a digestão da parede celular de plantas, e com isso já não presente barreira, a eficiência de transformação é aumentada 13. Nas células vegetais intactas há apenas dois métodos bem estabelecidos para a transformação biolística, 14 e 15 de transformação mediada por Agrobacterium. Nenhum desses métodos podem ser facilmente convertidos para plataformas de manipulação de líquidos, como biolistics exige equipamento especializado para transformação, enquanto transformação mediada por Agrobacterium requer a co-cultura e a subsequente remoção das bactérias. Nem são passíveis de métodos de alto rendimento. No caso de protoplastos, a transformação é realizada rotineiramente utilizando polietileno-glicol (PEG) a transfecção mediada por 16, que só requer várias trocas de solução, e é especialmente adequado para plataformas de manipulação de líquidos. Em segundo lugar, os protoplastos, por definição, são as culturas de uma única célula, e assim os problemas associados com a acumulação e a formação da cadeia em culturas de células de plantas, não são observados em protoplastos. Em termos de rastreio rápida utilizando um espectrofotómetro de placa-base, a aglutinação de células, ou células em planos múltiplos irá conduzir a dificuldade em adquirir medições consistentes. Uma vez que os protoplastos são também mais denso do que o seu meio de cultura, eles sedimentar para o fundo dos poços, a formação de uma monocamada, o que é favorável para espectrofotometria à base de chapa. Finalmente, enquanto que as culturas em suspensão de células de plantas são Primarily derivado do calo 17, os protoplastos podem ser colhidas a partir de uma série de tecidos de plantas, conduzindo-se à capacidade para identificar a expressão específica de tecido. Por exemplo, a capacidade de analisar raiz- ou expressão específica de folha de um gene pode ser muito importante para a predição fenótipo. Por estas razões, os protocolos desenvolvidos neste trabalho foram validados utilizando protoplastos isolados do tabaco amplamente utilizado (Nicotiana tabacum L.) cultura em suspensão &quot;amarelo brilhante&quot; 2 (BY-2). A cultura em suspensão BY-2 foi descrito como a célula &quot;HeLa&quot; de plantas superiores, devido ao seu uso disseminado em análise molecular de células de plantas 18. Recentemente, BY-2 de células têm sido usadas para estudar os efeitos da planta estressores 19-22, localização da proteína intracelular 23,24, biologia celular e de base 25-27 demonstrando a ampla utilidade destas culturas na biologia das plantas. Uma vantagem adicional de a-2 é a culturascapacidade para sincronizar as culturas com afidicolina, que pode levar a reprodutibilidade melhorada para a expressão do gene 28 estuda. Além disso, têm sido desenvolvidos métodos para a extracção de 2-POR protoplastos utilizando enzimas de baixo custo 29,30, como as enzimas utilizadas tradicionalmente para gerar protoplastos são de custo proibitivo para sistemas de alto rendimento. Como tal, o protocolo descrito abaixo foi validado usando a cultura em suspensão BY-2, mas deve ser modificável com qualquer cultura em suspensão de células de plantas. Experimentos de prova de conceito são realizadas utilizando um gene repórter da proteína de fluorescência laranja (OFP) (pporRFP) a partir dos Porites de coral Porites rígidos 31 sob o controlo do promotor CaMV 35S.

<table><tbody><tr><td>Orbitor RS Microplate mover</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bravo Liquid Handler</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Multi-mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teleshake</td><td>Inheco</td><td>3800048</td><td></td></tr><tr><td>CPAC Ultraflat Heater/cooler</td><td>Inheco</td><td>7000190</td><td></td></tr><tr><td>Vworks Automation Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Momentum Software</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Task scheduling software for controlling Orbiter RS</td></tr><tr><td>Liquid Handling Control 2.17 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Software used to control and write protocols for MultiFlo FX</td></tr><tr><td>IX81 Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyla 3-Tap microscope camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3/TRITC Filter Set</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Rohament CL</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost cellulase</td></tr><tr><td>Rohapect UF</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase</td></tr><tr><td>Rohapect 10L</td><td>AB Enzymes</td><td>sample bottle</td><td>low-cost pectinase/arabinase</td></tr><tr><td>Linsmaier &amp;amp; Skoog Basal Medium</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>L689</td><td></td></tr><tr><td>2,4-dichlorophenoxyacetic acid</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>D295</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) 4000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904-250G-F</td><td>Formerly Fluka PEG</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>25535-16-4</td><td>Acros Organics</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan CM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1910-250G</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>103184</td><td></td></tr><tr><td>96-well 1.2 ml deep well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0564</td><td></td></tr><tr><td>96 well optical bottom plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Finntip 1000 Wide bore Pipet tips</td><td>Thermo Scientific</td><td>9405 163</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC17259-5000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a robotic platform for high-throughput protoplast isolation and transformation

Durante a última década tem havido um ressurgimento do uso de protoplastos vegetais que variam de espécie para espécie vegetal modelo, para análise de vias de sinal de transdução, redes reguladoras da transcrição, a expressão do gene, genoma, e de edição de gene silenciador. Além disso, o progresso significativo tem sido feito para a regeneração de plantas a partir de protoplastos, o que tem gerado ainda mais o interesse na utilização destes sistemas para genoma das plantas. Neste trabalho, um protocolo tem sido desenvolvido para a automatização de isolamento de protoplastos e transformação de cultura em suspensão de tabaco um &#39;amarelo brilhante&#39; 2 (A-2), utilizando uma plataforma robótica. Os procedimentos de transformação foram validados utilizando um gene repórter da proteína fluorescente laranja (OFP) (pporRFP) sob o controlo do promotor 35S do mosaico da couve-flor vírus (35S). OFP expressão em protoplastos foi confirmada por microscopia de epifluorescência. As análises também incluiu métodos de eficiência de produção de protoplastos usando propidium iodeto. Finalmente, as enzimas de grau alimentar de baixo custo foram usadas para o procedimento de isolamento de protoplastos, evitando a necessidade de enzimas laboratório-grade que são um custo proibitivo em high-throughput automatizado isolamento de protoplastos e análise. Com base no protocolo desenvolvida no presente trabalho, o procedimento completo de isolamento de protoplastos para transformação pode ser realizada em menos de 4 horas, sem qualquer entrada a partir do operador. Embora o protocolo desenvolvido neste trabalho foi validado com a cultura de células A-2, os procedimentos e métodos podem ser traduzidas a qualquer sistema de cultura em suspensão planta / protoplasto, o que deverá permitir a aceleração da pesquisa genómica de culturas.

No presente estudo, a taxa de duplicação de BY-2 variou entre dependente da temperatura à qual as culturas foram incubadas, consistente com relatórios anteriores de uma duração do ciclo celular médio de 15 h 14-18 h. Com esta taxa de duplicação, de 1: 100 a partir de inoculo foi utilizado para iniciar culturas, levando a culturas com um volume empacotado de células (PCV) de 50% em 5-7 dias. No protocolo actual, em que as culturas foram cultivadas em 200 ml de meio, o hematócri...

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

A metodologia de alto rendimento, automatizada, produção e transformação de protoplastos de tabaco é descrito. O sistema robótico permite a expressão do gene massivamente paralelo e descoberta no sistema modelo BY-2 que podem ser traduzidas para as culturas não-modelo.

A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

14.2K visualizações.  University of Tennessee, Knoxville.  A metodologia de alto rendimento, automatizada, produção e transformação de protoplastos de tabaco é descrito. O sistema robótico permite a expressão do gene massivamente paralelo e descoberta no sistema modelo BY-2 que podem ser traduzidas para as culturas não-modelo. 

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High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Alto Throughput Robotically Isolamento Assistida da temperatura sensível Lethal Mutantes em<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Genética

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Medicina

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many secondary metabolites and lipids. Chloroplasts require a large number of proteins for these various physiological processes. Over 95% of chloroplast proteins are nucleus-encoded and imported into chloroplasts from the cytosol after translation on cytosolic ribosomes. Thus, the proper import or targeting of these nucleus-encoded chloroplast proteins to chloroplasts is essential for the proper functioning of chloroplasts as well as the plant cell. Nucleus-encoded chloroplast proteins contain signal sequences for specific targeting to chloroplasts. Molecular machinery localized to the chloroplast or cytosol recognize these signals and carry out the import process. To investigate the mechanisms of protein import or targeting to chloroplasts in vivo, we developed a rapid, efficient protoplast-based method to analyze protein import into chloroplasts of Arabidopsis. In this method, we use protoplasts isolated from leaf tissues of Arabidopsis. Here, we provide a detailed protocol for using protoplasts to investigate the mechanism by which proteins are imported into chloroplasts.

Here we describe a protocol to express proteins into protoplasts by using PEG-mediated transformation method. The method provides easy expression of proteins of interest, and efficient investigation of protein localization and the import process for various experimental conditions in vivo.

Estudando a importação de proteínas em cloroplastos usando protoplastas

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Bioquímica

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Biologia

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Bioengenharia

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Robótico líquido manipulação montagem de dispositivos modulares DNA automática

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

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A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

Um método simples para o isolamento de aplicativo para análises de expressão de Gene transiente e protoplastas de soja

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation or polyethylene glycol (PEG). Previous methods were developed to produce tens of thousands of transfected protoplasts at once. Here,&#160;we describe a straightforward method to isolate and transfect millions of leaf mesophyll protoplasts in maize (Zea mays L.). This streamlined process removes certain common protoplasting steps, such as washing in W5. Additionally, steps such as centrifugation, PEG-mediated transfection, and incubation have been modified to work with a greater number of protoplasts. The ability to express large libraries of plasmid constructs enables genome-scale experiments, such as massively parallel reporter assays in maize.

Here, we present a high-throughput protocol to transiently transfect millions of maize protoplasts for testing large libraries of plasmids in maize mesophyll cells.

Transfecção escalável de protoplastos de mesofilo de milho

The transfection of maize mesophyll cells often involves digesting the plant cell walls to create protoplasts and then inserting DNA via electroporation ...

A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

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Alto Throughput Robotically Isolamento Assistida da temperatura sensível Lethal Mutantes em