Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación de genoma de planta de la National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).

1. crecimiento de las plantas
<ol><li>Sembrar semillas de soja de 5-10 (Williams 82) en una maceta de 13 cm en el invernadero bajo condiciones de día largo (16 h de luz en 1.500 μmol m-2 s-1) a 25 ° C en la mezcla de suelo personalizados para soja (el 1: relación 1:1 de arena de tierra, perlita y torpedo).</li>
</ol>2. preparación de plásmido ADN
<ol><li>Utilizando una pipeta estéril o palillo de dientes, elige una sola Colonia o stock de glicerol congelados de e.coli con el plásmido que contiene el gen de interés e inocular en medio líquido de 20 mL Luria-Bertani (LB) con los antibióticos apropiados en un matraz de 50 mL.</li>
	<li>Incube el frasco a 37 ° C durante la noche en un agitador. Recoger las bacterias por centrifugación de la suspensión a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos y descartar el sobrenadante. Extraer y purificar el plásmido siguiendo el procedimiento del fabricante de un kit de preparación de plásmido.</li>
</ol>3. aislamiento protoplasto
<ol><li>Cortar hojas unifolioladas recientemente ampliadas de plántulas de soja 10 - viejo (figura 1). Nota: Selección de hojas en una etapa de desarrollo apropiada es la clave del éxito para la preparación del protoplasto de soja. Utilice únicamente hojas sólo ampliados en las primeras etapas del desarrollo. Las hojas maduras, paredes celulares convertido en más difícil de digerir.</li>
	<li>Con una cuchilla de afeitar nueva, retire la nervadura central de las hojas unifolioladas y luego corte los restos en 0.5-1 mm tiras. Nota: Dos hojas unifolioladas digeridos en 10 mL de solución de enzima dará suficientes protoplastos para transformaciones más de 10.</li>
	<li>Con un par de pinzas, transferencia de la hoja las tiras inmediatamente y con cuidado en 10 mL de solución recién preparada de la enzima (tabla 1) en un tubo de 15 mL. Vacío infiltra la hoja tiras durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incube las tiras de la hoja en la solución de enzima con agitación suave (40 rpm) bajo condiciones de poca luz para 4-6 h a temperatura ambiente. Asegúrese de que la solución de enzima convierte amarillo-verde protoplastos son liberados. Comprobar la solución de enzima/protoplastos bajo el microscopio (X10). Nota: El lanzado protoplastos son esféricos formado, mientras que las células sin digerir tienen forma oval o irregular.</li>
	<li>Transferir 10 mL de solución en un tubo de 50 mL de enzima/protoplasto vertiendo suavemente y añadir 10 mL de solución de W5 (tabla 1) a temperatura ambiente para detener la digestión. Invierta suavemente el tubo varias veces. Vierta suavemente la solución de enzima/protoplastos en una malla de nylon limpio 75 μm colocada encima de un tubo de 50 mL para remover los tejidos de la hoja sin digerir.</li>
	<li>Centrifugue la solución a través de flujo de enzima/protoplastos a 100 x g en el tubo de 50 mL durante 1-2 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta serológica de 10 mL sin perturbar el pellet de protoplasto.</li>
	<li>Suspender los protoplastos y diluir a una concentración de 2 x 105 mL-1 en la solución de W5 refrigerada a 4 ° C por conteo de protoplasto en un hemacitómetro bajo el microscopio (x10). Mantenga los protoplastos en el hielo durante 30 minutos.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión a 100 x g durante 1-2 min a temperatura ambiente y suavemente Retire la solución de W5 con una pipeta de 1 mL sin perturbar el pellet de protoplasto. Resuspender los protoplastos en la solución MMG (tabla 1) en una concentración de 2 x 105 mL-1 a temperatura ambiente.</li>
</ol>4. transformación de protoplasto
<ol><li>Hacer 100 alícuotas de μl de protoplastos (2 x 104 protoplastos en 2 x 105 mL-1) en tubos de microcentrífuga de adherencia baja 1,5 mL utilizando sin cortar puntas de la pipeta de 200 μl. Poner una alícuota a un lado para servir como control negativo. Añadir 10 μl del plásmido (10-20 μg) en cada uno de la alícuota del resto de protoplastos.</li>
	<li>Lentamente agregar 110 μl de solución recién preparada de PEG (tabla 1) en la pared interna del tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y luego invierta suavemente y gire el tubo hasta que la solución sea homogénea.</li>
	<li>Incubar la mezcla de transformación a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
	<li>Para detener la transformación, poco a poco añadir 400 μL de solución de W5 con el tubo de 1,5 mL a temperatura ambiente e invierta suavemente el tubo hasta que la solución sea homogénea. Centrifugar el tubo a 100 g durante 1-2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Añadir 1 mL de solución de WI (tabla 1) en el tubo y resuspender mediante pipeteo suave 1 - 2 veces. Añadir 1 mL de suero de ternera estéril (vol/vol) de 5% en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos bien 6 a capa de la superficie y evitar que los protoplastos se adhiera a la placa.</li>
	<li>Después de unos segundos, desechar el suero con una pipeta. Transferencia de los protoplastos resuspendidos en un pocillo de la placa de cultivo. Cubra la placa con una tapa.</li>
</ol>5. protoplasto incubación y cosecha
<ol><li>Incubar los protoplastos a temperatura ambiente durante 1-2 días en la oscuridad. Nota: Hemos encontrado que dos días de incubación produce una señal más fuerte de la proteína fluorescente en general comparada con un día incubación, y que la señal de la proteína fluorescente puede durar hasta 3-4 días.</li>
	<li>Transferir la solución del protoplasto a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL baja de la adherencia. Centrifugar el tubo a 100 x g por 1-2 min a temperatura ambiente para cosechar protoplastos. Quite el sobrenadante con una pipeta y transferir 10 protoplastos μl sobre un portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Observar la señal fluorescente bajo fluorescencia o microscopía confocal. Uso no transforman protoplastos como control negativo (no hay señal debe observarse).</li>
</ol>

<ol>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Este protocolo para el aislamiento de protoplastos de soja y la aplicación a los estudios de expresión transitoria ha sido completamente probado y funciona muy bien en nuestro laboratorio. Los procedimientos son simples y fáciles y requieren equipo ordinario y mínimo coste. Nuestro protocolo produce grandes cantidades de protoplastos de uniforme y de alta calidad en comparación con métodos previamente divulgados34,35,36,37,38. Sin embargo, puesto que hay muchos factores que afectan rendimiento de protoplasto y las tasas de transformación, se recomienda encarecidamente a los investigadores optimizar las condiciones según sus condiciones experimentales, los resultados deseables y los materiales utilizados. Mientras que este sistema es muy útil para el examen de inmediato eventos regulatorios y bioquímicos en las células vegetales, no es conveniente para la observación de los procesos celulares a largo plazo y eventos que se producen a nivel de organismo o tejido.
Encontramos que la selección de vigoroso crecimiento materiales de planta en una etapa ideal del desarrollo era el factor más crucial en la preparación del protoplasto de soja. Determina no sólo los rendimientos de protoplastos, pero la calidad que afecta a la posterior transformación de ADN. Es importante siempre crecen plantas de soja en un ambiente constante de estrés, como sequía, inundaciones, temperaturas extremas o plagas. Se logra la mayor eficiencia de producción y transformación de protoplasto empleando hojas unifolioladas sólo ampliadas de plántulas jóvenes. Para los principiantes, se recomienda utilizar hojas unifolioladas en diferentes etapas de desarrollo y hacer una comparación para obtener los mejores resultados.
Relación ADN protoplasto es un factor importante para la eficacia de la transformación óptima. Es generalmente mejor comenzar con la proporción de 2 x 104 protoplastos/10-20 μg ADN, pero la optimización de la relación para construcciones individuales se recomienda25. Se recomienda encarecidamente el uso de ADN obtenido por un kit de purificación de ADN de alta calidad.
Para la elección de vectores de expresión transitoria en protoplastos, número de copia de alta y vectores de pequeño tamaño son generalmente preferidas. Aunque vectores binarios para la tumefaciens de la agrobacteria-transformación mediada de plantas puede ser utilizado para la transformación de protoplasto, el gran tamaño de estos vectores puede resultar en menos eficacia de la transformación óptima. Para la expresión de la proteína GFP-fusion, generalmente utilizamos vectores que no poseen un marcador de selección para las plantas y son así relativamente pequeños (6-7kb), como p2GWF7 y p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
Múltiples vectores pueden usarse para transformar protoplastos simultáneamente. Hemos tenido éxito en expresar vectores centro para probar las interacciones proteína-proteína, así como múltiples proteínas fluorescentes de organelas y etiquetado subcelular en protoplastos de soja. Además, la sencillez y grandes rendimientos de nuestro método ofrece un sistema ideal para el examen de eventos regulatorios y bioquímicos, gene targeting vector diseño, aislamiento de proteínas expresadas transitoriamente y complejo de la proteína y purificación de específicos Acerca de organelas como el núcleo, lo que permite otras aplicaciones emergentes genómico y proteómico.

Protoplastos son células vegetales que han quitado las paredes celulares. Como sostienen la mayoría de características y actividades de las células vegetales, protoplastos son un buen modelo de sistema para observar y evaluar diversos eventos celulares y son herramientas valiosas para el estudio de hibridación somática1 y2de la regeneración de la planta. Protoplastos han sido también ampliamente utilizados para planta transformación3,4,5, ya que las paredes celulares lo contrario bloquearía el paso de DNA en la célula. Protoplastos poseen algunas de las respuestas fisiológicas y los procesos celulares de las plantas intactas, ofreciendo por lo tanto, valor fundamental en la investigación básica para el estudio de proteína subcelular localización6,7,8, de9,de las interacciones proteína-proteína10y promotor actividad11,12,13 en viven las células.
El aislamiento de protoplastos de plantas primero fue divulgado en 196014 y los protocolos de aislamiento y transformación de protoplastos se han desarrollado y optimizado. Un procedimiento estándar de aislamiento protoplasto implica el corte de hojas y digestión enzimática de las paredes celulares, seguido por separación de protoplastos liberados de restos de tejido no-digerido. Estrategias de transformación incluye electroporación15,16, microinyección17,18y polietilenglicol (PEG)4,5,19 métodos basados. Una amplia gama de especies se han divulgado éxito para el aislamiento del protoplasto, incluyendo cítricos20, Brassica21, Solanaceae22 y otras plantas ornamentales familias23,24. Tipos de tejidos diversos se utilizan en varias especies, un sistema de expresión transitoria en el protoplasto de mesófilo de Arabidopsis (TEAMP) aislado de hojas de la planta modelo Arabidopsis thaliana ha sido bien establecida25 y ampliamente adoptado para diversas aplicaciones.
Soja (Glycine max (L.) Merr.) es una de las más importantes proteínas y aceite de cultivos de26. A diferencia de Arabidopsis y arroz, obtención de plantas transgénicas de soja se sabe para ser algo difícil y baja eficiencia. Tumefaciens de la agrobacteria-mediada por la infiltración ha sido popularmente utilizada para estudios de expresión transitoria del gen en las células epidérmicas en tabaco27 y plántulas de Arabidopsis28,29, mientras que Agrobacterium rhizogenes ha sido utilizado para la transformación de las raíces pilosas en soja30. Enfoques de silenciamiento génico inducido por virus han sido utilizados para la desregulación de los genes del blanco31,expresión32 y transitorio33 de manera sistémica. Protoplastos proporcionan una alternativa versátil y valiosa a estos enfoques. Protoplastos pueden obtenerse materiales sobre tierra de soja y permiten la expresión del transgen rápida y sincronizada. Sin embargo, desde el éxito inicial aislamiento de protoplastos de soja en el 198334, ha habido informes limitados en el uso de protoplastos en soja35,36,37, 38, principalmente debido a la relativamente baja producción de protoplastos de soja.
Aquí, describimos un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento de protoplastos de soja y su aplicación para estudios de expresión génica transitoria. Utilizando hojas unifolioladas jóvenes de plántulas de soja, hemos sido capaces de obtener grandes cantidades de protoplastos vitales dentro de unas horas. Además, hemos optimizado un método de transformación mediada por PEG-calcio que es simple y de bajo costo para entregar ADN en protoplastos de soja con alta eficiencia.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELLULASE &quot;ONOZUKA&quot; R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>ICN Biomedicals</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plates</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EZNA plasmid miniprep kit</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>eppendorf</td><td>5811000827</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Pipet Controller</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Ingram&#039;s Nursery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perlite</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Sand</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox (Powder)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method for isolation of soybean protoplasts and application to transient gene expression analyses

Soja (Glycine max (L.) Merr.) es una especie de cultivo importante y se ha convertido en un modelo de leguminosas para los estudios de vías genéticas y bioquímicas. Por lo tanto, es importante establecer un sistema de expresión eficaz de genes transitorios en soja. Aquí, Divulgamos un protocolo simple para la preparación de protoplastos de soja y su aplicación para el análisis funcionales transitorios. Hemos encontrado que jóvenes unifolioladas hojas de plántulas de soja resultaron en grandes cantidades de protoplastos de alta calidad. Mediante la optimización de un método de transformación mediada por PEG-calcio, logramos eficiencia alta transformación mediante protoplastos unifolioladas soja. Este sistema proporciona un modelo eficiente y versátil para el examen de mecanismos complejos de regulación y señalización en células de soya vivo y puede ayudar a mejor entender diversos procesos celulares, fisiológicos y de desarrollo de las leguminosas.

Diferentes órganos de soja 10 - viejo fueron probados para la preparación del protoplasto (figura 1) y rendimientos fueron observados bajo el microscopio (figura 2). Las paredes celulares de hipocótilo y epicotyl apenas fueron digeridas, y algunas células se quedaron conectadas entre sí (figura 2B, 2C). En el cotiledón (Figura 2D) y raíz (figura 2A), paredes celulares fueron quitadas solamente en una pequeña porción de las células. En cambio, un gran número de protoplastos fueron observado cuando unifolioladas fue utilizado (Figura 2E-G). Hojas unifolioladas en diferentes etapas de desarrollo fueron más examinados (figura 2 H). Mientras que las hojas unifolioladas sin dilatar y ampliadas sólo resultaron en altos rendimientos de protoplastos, el tamaño de protoplastos de sólo ampliado unifoliolado eran más uniforme (figura 2F) que no expandidos unifolioladas (Figura 2E). Para completamente ampliado unifolioladas, las paredes celulares eran todavía intactas en la mayoría de las células (figura 2). Probamos las enzimas de la digestión de la pared celular de tres fabricantes diferentes y obtiene resultados comparables, como se describe anteriormente. Basado en estas observaciones, se concluye que la selección de materiales de planta era un factor crucial y que sólo ampliadas hojas unifolioladas de plantas jóvenes de soja el mejor material para la preparación del protoplasto.
Una gama de diferentes cantidades de ADN (μg 0,1 y 1 μg, 5 μg 20 μg) plásmido fue probada para la eficacia óptima transformación de protoplastos unifolioladas soja (Figura 3A-D). 20 μg plásmido ADN demostrada la mayor eficiencia de transformación con más tasa de transformación de 50% (figura 3D), mientras que 0.1 μg demostró la más baja (menos del 1%) (Figura 3A). Obtuvimos la eficiencia de transformación comparables utilizando kits de purificación de ADN diferentes de tres fabricantes. Este resultado sugiere que grandes cantidades de ADN plásmido serían de gran ayuda para aumentar la eficiencia de transformación.
Figura 4 es imágenes confocales de protoplastos de soja transformados con la construcción p2GWF7-E1, que expresa la GFP fusionada al gen de la leguminosa específica E1 (Glyma.06G207800), conducido por el promotor CaMV 35S en el vector p2GWF7 39. la proteína de la fusión de GFP E1 muestra localización nuclear en protoplastos de soja, que es consistente con un estudio anterior usando la Arabidopsis protoplasto sistema40. Dado que E1 es un gen de la leguminosa específica, nuestro resultado con el sistema del protoplasto de soja proporciona una visión concluyente en la localización subcelular de la proteína E1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig1.jpg"> Figura 1. Ilustración que muestra los órganos de una planta de semillero de soja que se prueban para la preparación de protoplasto en este estudio, incluyendo la raíz, hipocótilo, cotiledón, epicotyl y unifolioladas. Después de un par de hojas unifolioladas, plántulas de soja desarrollan hojas trifoliadas. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57258/57258fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig2.jpg"> Figura 2. Células de protoplasto, preparadas a partir de diferentes órganos y etapas de desarrollo de las plántulas de soja. (A-D) Las células prepararon a partir de diferentes órganos de 10 - viejo plántulas de soja: raíz (A), hipocótilo (B), epicotyl (C), cotiledón (D). (C-E-G) Células de protoplasto preparadas de hojas unifolioladas en diferentes etapas de desarrollo: no expandido (E), sólo ampliado (F) y (G) se expande completamente unifolioladas, correspondientes a las plántulas de soja en (H) a la izquierda, centro y derecha, respectivamente. La barra de escala es de 25 μm (A-G) o 25 mm (H). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57258/57258fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig3.jpg"> Figura 3. Confocales imágenes que muestran la eficiencia de transformación de soja unifolioladas protoplastos con diferentes cantidades de ADN plásmido. Imágenes de GFP (representado en verde) y brillantes se combinan el campo (gris). Se transformaron protoplastos con diferentes cantidades del plásmido p2GWF7-E1: 0,1 μg (A), (B) de 1 μg, 5 μg (C) y (D) de 20 μg. Señal de la fluorescencia de GFP era vigilado las 24 horas después de la transformación bajo microscopia. Es la barra negra de escala 50 μm. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57258/57258fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57258/57258fig4.jpg"> Figura 4. Imágenes confocales mostrando la localización subcelular de E1-GFP en el núcleo de soja protoplastos unifolioladas. El plásmido p2GWF7-E1 fue utilizado para la transformación. Imágenes de GFP (representado en verde) y brillantes se combinan el campo (gris). Señal de la fluorescencia de GFP era vigilado las 24 horas después de la transformación. La barra de la escala negra es 5 μm. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57258/57258fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Solución de enzima (recién preparado)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5.7</td>
			<td>20mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Celulasa CELF</td>
			<td>2% (w/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pectolyase Y-23</td>
			<td>0.1% (p/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Manitol</td>
			<td>0.75 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1% (p/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>TDT</td>
			<td>0,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Solución de W5</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>154 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>125 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5.7</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Solución de MMg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5.7</td>
			<td>4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Manitol</td>
			<td>400 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>15 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Solución de PEG (recién preparado)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEG4000</td>
			<td>20% (w/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Manitol</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Solución WI</td>
		</tr>
<tr>
<td>MES, pH 5.7</td>
			<td>4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Manitol</td>
			<td>0.5 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Soluciones utilizadas para la transformación y soja protoplasto aislamiento.

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A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Hemos desarrollado un protocolo sencillo y eficaz para la preparación de grandes cantidades de protoplastos de soja para el estudio de complejos mecanismos de regulación y señalización en células vivas.

Un método Simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K vistas.  California State University, Northridge. Hemos desarrollado un protocolo sencillo y eficaz para la preparación de grandes cantidades de protoplastos de soja para el estudio de complejos mecanismos de regulación y señalización en células vivas.

Video: A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Investigación

Genética

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Medio ambiente

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Bioquímica

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

El aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de 14 días de edad de las plántulas Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Biología

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robótica y Análisis de Imagen Dinámica de Estudios de la expresión génica en los tejidos vegetales

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Producción de alta eficiencia de raíces pilosas de soja transgénica

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with soil-borne microbes that form symbiosis to fix nitrogen and pathogens, which makes research involving soybean root genetics of prime importance to improve its agricultural production. The genetic transformation of soybean hairy roots (HRs) is mediated by the Agrobacterium rhizogenes strain NCPPB2659 (K599) and is an efficient tool for studying gene function in soybean roots, taking only 2 months from start to finish. Here, we provide a detailed protocol that outlines the method for overexpressing and silencing a gene of interest in soybean HRs. This methodology includes soybean seed sterilization, infection of cotyledons with K599, and the selection and harvesting of genetically transformed HRs for RNA isolation and, if warranted, metabolite analyses. The throughput of the approach is sufficient to simultaneously study several genes or networks and could determine the optimal engineering strategies prior to committing to long-term stable transformation approaches.

Autor destacado: Transformación de la raíz peluda de la soja para el análisis de la función de los genes  

Here, we present a protocol for the high-efficiency production of transgenic soybean hairy roots.

Transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

Bioingeniería

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

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