Name: a method for the measurement of salivary gland function in mice
Uploaded: 2018-01-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice at JoVE.com

O estudo foi suportado por um fundo do National Institutes of Health, Instituto Nacional de dentária e Craniofacial Research (DE025030).

O protocolo descrito abaixo foi aprovado pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal e segue as diretrizes éticas estabelecidas pelos institutos nacionais de saúde. Todos os dados apresentados neste relatório foram gerados usando ratos fêmeas que eram 10-12 semanas de idade. Foram utilizadas as seguintes cepas de ratos: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S e F1 (B6XA/J). Todos os ratos foram alojados em gaiolas de barreira (5 animais por gaiola) em condições específicas isentos de organismos patogénicos e fornecidos a ração e água ad libitum.
1. preparação
<ol><li>Para preparar uma solução de cloridrato de pilocarpina, pesa 10 mg do composto e dissolvê-lo em 1,776 mL de solução salina isotônica estéril vortexing, para dar uma solução stock de 5,63 mg/mL. Não há nenhuma necessidade para esterilizar esta solução. Mas, se desejado, filtrá-la através de um filtro de 0,2 µM. Loja desta solução em alíquotas múltiplas em um freezer-80 oC por até 3 meses. Cada estoque congelado é para uso individual. Uma vez descongelado, não volte a congelar a solução pilocarpina.</li>
	<li>Levar a 0,6 mL tubos de microcentrífuga e cuidadosamente um buraco pequeno na parte inferior de cada tubo com uma agulha de calibre 18 aquecida. Defina esses tubos para tubos de 2 mL. Os tubos não precisam ser estéril.</li>
	<li>Usando uma lâmina de barbear afiada, estéril, corte cilíndricos cotonetes absorventes em cerca de 2 cm de comprimento. Corte cada pedaço de 2 cm na diagonal para dar 2 cotonetes em forma cônicas. Coloque um cotonete em cada um dos tubos de microcentrífuga de 0,6 mL.</li>
	<li>Pese o tubo de microcentrífuga de 0,6 mL contendo o swab seco.</li>
	<li>Transferi os ratos para ser estudado em uma nova gaiola limpa com garrafas de água. Manter os ratos sem comida pelo menos 2 h antes do início da coleta de saliva para impedir que partículas de comida que está contaminando a saliva coletada. Nota: Não é necessário manter o 1 rato por gaiola para este procedimento. No entanto, o número de ratos colocados em cada gaiola depende da instituição específica de regras e regulamentos para uso de animais.</li>
	<li>Pouco antes do fim de 2h, prepare a solução de trabalho de pilocarpina (0,0563 mg/mL) diluindo a solução-mãe de 100x em soro fisiológico estéril. Não é necessário mais filtro esterilizar esta solução. Mantenha sempre a solução pilocarpina no gelo. Nota: A tabela 1 dá a quantidade de pilocarpina deve ser injetado para uma gama de pesos de corpo do mouse para dar uma dose final de 0,375 mg/kg de peso corporal.</li>
</ol>2. o procedimento
<ol><li>Pesar cada rato e determinar a dose da mistura anestésica para cada mouse usando a tabela 1. Injete o primeiro rato com o volume adequado da mistura anestésica por via intraperitoneal. Defina o temporizador para 2 min (maioria das cepas de rato testado neste protocolo ir para dormir por 2 min). Certifique-se de que o mouse é devidamente anestesiado pela falta de andar quando colocado sobre uma superfície plana. Se o mouse ainda está andando, espere 2min adicional antes de prosseguir para a próxima etapa. Aplique uma gota de lubrificante pomada oftálmica de ambos os olhos para impedir a secagem. Nota: Na tabela 1, a dose da mistura anestésica é 0,007 mL/g de massa corporal. O intervalo ideal para este procedimento é 0,006 a 0,008 mL/g de massa corporal. No entanto, após 4 min, se o mouse ainda é andar ou exibindo movimentos espasmódicos, consulta com o veterinário institucional para adequadamente, aumentando a dose de anestésico.</li>
	<li>Determinar a dose de pilocarpina para o mouse usando a tabela 1 e injetar a quantidade adequada por via intraperitoneal. Definir o timer por 2 min e colocar o mouse no tubo de retenção de 50 mL até a cabeça e orelhas fica fora do corte final. Coloque o tubo em um ângulo de 45 graus, com a cabeça para baixo e a superfície ventral virada para cima. Fita do tubo para a placa de procedimento para mantê-lo de se mover. Nota: A tabela 1 fornece dosagem para ratos, mais de 17 g, como este procedimento não tem sido tentado em ratos com peso abaixo de 17 g.</li>
	<li>No final de 2 min, gentilmente Insira um par fechado de micro pinça de dissecação na boca e levantar a mandíbula inferior para cima para abrir a boca. Empurre a pinça 1-2 milímetros mais dentro da boca, certificando-se de que a língua é vista descansando no braço superior da pinça. Com outro par de pinças bem, segure o cotonete seco pré-pesados perto de sua ponta cônica.</li>
	<li>Deslize suavemente a ponta cónica do cotonete na boca. Retire a pinça, deixando a ponta do swab na cavidade oral.</li>
	<li>Segure a ponta mais larga da zaragatoa estendendo-se fora da boca e girá-lo para permitir a máxima área de contato com a boca. Fique com o cotonete nesta posição por 15 min. Nota: Isso garante que o swab permanece na boca para a duração da coleção. Note que a ponta cónica do cotonete atua como um pavio, e a maior parte do swab permanece fora da boca.</li>
	<li>No final de 15 min, delicadamente gire o swab para coletar qualquer saliva que não foi absorvido e coloque o cotonete molhado no tubo de microcentrífuga de 0,6 mL. Fechar o tubo e configurá-lo no tubo 2 mL colocado no gelo. Nota: Neste momento, a mucosa oral aparecerá completamente seca. O mouse pode agora ser voltou para sua gaiola para a recuperação da anestesia.</li>
	<li>Transferi o rato na gaiola. Coloque o alimento umedecido pelotas na gaiola após a coleta de saliva para ajudar a reidratação mais rápida. Nota: Os ratos acordar dentro de 10 min após o final da coleção. Injeção subcutânea de salina isotônica pré-aquecido de 0,2 mL também pode ser dada para acelerar a recuperação.</li>
	<li>Prossiga para o próxima do mouse. Todos os ratos devem ser monitorizados até que tenham completamente recuperados e são ambulatoriais.</li>
</ol>3. as medições
<ol><li>No final de todas as coleções, pese os tubos de 0,6 mL com o cotonete molhado. Calcule a diferença entre o peso molhado e seco para obter o peso da saliva produzida. Coloca o tubo de 0,6 mL saliva de volta no tubo de 2 mL.</li>
	<li>Corte as tampas dos tubos de 2 ml. Em seguida, centrifuga os tubos de 2 mL por 2 min a 7500 x g, em 4oC em uma centrífuga micro para recuperar a saliva. Medir o volume de saliva obtido utilizando uma micropipeta.</li>
	<li>Expressar os resultados como saliva peso (mg)10 a mais de 15 min, ou como uma relação do peso de saliva (mg) / peso corporal (g) de rato. Nota: Se o volume de saliva extraído fora o swab foi medido, expressar os resultados como o volume de saliva recuperado (mL) ou a proporção do volume de saliva (mL) / peso corporal (g) de rato.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proctor, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+salivary+secretion.">The physiology of salivary secretion.</a> Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).</li><li>Fox, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sj&#246;gren's+syndrome.">Sj&#246;gren's syndrome.</a> Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).</li><li>Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xerostomia+and+its+predictors+following+parotid-sparing+irradiation+of+head-and-neck+cancer.">Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).</li><li>Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+secretion+rates+from+mouse+and+rat+parotid+glands+are+markedly+different+following+pilocarpine+stimulation.">Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation.</a> Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).</li><li>Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+short-term+gamma-irradiation+effects+on+mouse+salivary+gland+function+using+a+new+saliva+collection+device.">Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device.</a> Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).</li><li>Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+short+peptides+from+the+60-kDa+Ro+antigen+recapitulates+the+serological+and+pathological+findings+as+well+as+the+salivary+gland+dysfunction+of+Sjogren's+syndrome.">Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome.</a> J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).</li><li>Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+innate+immune+responses+through+Toll-like+receptor+3+causes+a+rapid+loss+of+salivary+gland+function.">Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function.</a> J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).</li><li>Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+accelerate+Sj&#246;gren's+syndrome-like+disease+in+(NZB+x+NZW)F1+mice.">Inflammatory stimuli accelerate Sj&#246;gren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice.</a> Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+innate+immunity+and+Ro52-induced+antibody+causes+Sj&#246;gren's+syndrome-like+disorder+in+mice.">Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sj&#246;gren's syndrome-like disorder in mice.</a> Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).</li><li>Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca J&#250;nior, L., Renzi, A., Menani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+muscarinic+receptors+signal+pilocarpine-induced+salivation.">Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation.</a> J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).</li><li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+elevation+and+secretion+of+interleukin-1beta+in+the+submandibular+gland+of+male+mice.">Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice.</a> Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).</li><li>Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+isoflurane+anesthesia+and+pilocarpine+on+rat+parotid+saliva+flow.">Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow.</a> Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).</li><li>Kohrs, R., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine:+teaching+an+old+drug+new+tricks.">Ketamine: teaching an old drug new tricks.</a> Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).</li><li>Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+saliva+collection+using+cotton+swab+on+cortisol+enzyme+immunoassay.">Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay.</a> Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).</li></ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Produção de saliva é um processo complexo e é influenciada por muitos fatores. Portanto, medir a função da glândula salivar em animais de laboratório pode ser um desafio. Um desafio adicional é que medidas repetidas da função das glândulas salivares no mesmo animal são necessárias para estabelecer o início da doença ou para demonstrar a recuperação após o tratamento.
O método da zaragatoa descrito neste relatório é tecnicamente simples para realizar com várias opções para representar os dados. Os resultados obtidos são reprodutíveis, com pouca variação inter operador. O método pode detectar uma redução na produção de saliva em diferentes modelos de disfunção das glândulas salivares. Uma vantagem significativa é o uso de polímeros inertes, altamente absorventes e recuperação eficiente da saliva coletada, permitindo a medição de biomoléculas salivares. Outra vantagem deste método é que é possível realizar este procedimento simultaneamente em até 2 ratos cada vez por um único operador. Isto é significativamente mais eficiente do que alguns dos outros métodos, onde ela é realizada em um único rato por vez.
A variabilidade nas medidas de produção de saliva têm sido a ruína de todas as técnicas de medição de saliva. Para minimizar a variabilidade, é importante respeitar estritamente o protocolo. Passos críticos incluem: selecionando o mesmo tempo do dia para os ratos de jejum e coleta de saliva, adequado a dosagem do anestésico e pilocarpina (tabela 1) e registros de peso exato de cotonetes secos e molhados. Gestão do tempo cuidado é necessário para definir até 2 ratos por vez para coleta de saliva.
Como mostrado na Figura 3, a quantidade de saliva produzida por ratos é dependente de tensão. Assim, adequado a estirpe, idade e sexo ratos combinados devem ser utilizados como controles. Titulação de dosagem a pilocarpina, para a estirpe específica e a condição experimental a ser investigado, é altamente recomendada. Apesar de uma dose maior de pilocarpina além de 0,5 mg/kg induz o aumento da produção de saliva, para avaliar a hipofunção glandular, é recomendável usar uma dose mais baixa. Isto permite a identificação de até mesmo pequenas diferenças na produção de saliva, entre o doente e controlar ratos. Doses de 0,5 mg/kg de peso corporal e 0,375 mg/kg de peso corporal têm sido utilizados com sucesso para demonstrar a hipofunção das glândulas salivares. No entanto, deve notar-se que certos sistemas de modelo experimental podem exigir períodos mais curtos ou mais longos da coleção do que o descrito neste protocolo. Isso deve ser testado por cada laboratório.
Uma limitação desse método, e a maioria dos métodos de medição da saliva é a necessidade de anestesia. O relatório com o método de vácuo não inclui o uso de anestésico5. No entanto, a ausência de anestesia induz níveis variados de ansiedade nos ratos. Eles tendem a lutar e morder o tubo, e que por sua vez, pode influenciar a eficiência de produção e coleta de saliva. Anestesia de isoflurano em ratos induz uma de produção de saliva12drop-in pilocarpina induzida. Em contraste, cetamina aumenta a secreção salivar e brônquica através da estimulação simpática13. Nós e os outros usaram com sucesso a quetamina e xilazina mistura como anestésico para medir pilocarpina induzido saliva produção4,7,8,9. O intervalo recomendado para anestesia cirúrgica é 100-200 mg/kg de ketamina e 5-16 mg/kg de xilazina14. A dose de 0,006-0,008 mL/g de massa corporal usado neste método (corresponde a 60-80 mg/kg de ketamina e 6-8 mg/kg de xilazina) cai na extremidade inferior do intervalo recomendado e é suficiente para fornecer um nível consistente de imobilização sem anestesia profunda .
O método da zaragatoa estabeleceu-se como uma alternativa para o método de micropipetas rotineiramente utilizados. A grande desvantagem do método pipeta foi a alta variabilidade inter operador e a necessidade de coletar a saliva de um rato de cada vez. O método da zaragatoa resolve ambos os problemas. Os benefícios incluem a limitação do número de animais necessários para alcançar o poder em análises estatísticas e aumento de eficiência. Substituindo cotonetes com cotonetes de polímero inerte para oferecer uma opção melhor desde cotonetes são conhecidos para quantificação de moléculas biologicamente ativas15de impacto.
Dada a simplicidade do método cotonete e sua grande reprodutibilidade entre diferentes indivíduos, espera-se que o método da zaragatoa facilitará melhores comparações dos modelos do rato entre instituições e pesquisadores em diferentes laboratórios.

As glândulas salivares produzem saliva em resposta a uma variedade de estímulos neurológicos e mecânica1. Os estímulos são transportados através do sistema nervoso simpático e parassimpático aos receptores adrenérgicos e colinérgicos na glândula. Pilocarpina é um agente colinérgico, Pará-simpaticomimética que atua predominantemente sobre os receptores muscarínicos. Na glândula salivar, que induz a produção de saliva, agindo sobre os receptores de acetilcolina muscarínicos M31. Produção de saliva, após a administração de pilocarpina é um indicador da capacidade de responder à estimulação das glândulas salivares e é comumente usada como uma medida da função da glândula salivar.
Medição da produção de saliva é fundamental no estudo de doenças das glândulas salivares, incluindo Síndrome de Sjögren2 e lesão de radiação de tratamento de câncer cabeça e pescoço3a seguir. Diversos métodos foram desenvolvidos para medir a produção de saliva em roedores. Estes incluem canulação direta do Ducto excretor salivar4, coleta de saliva da cavidade oral sob vácuo5e coleção usando de capilares de vidro6 ou7,uma micropipeta,8, 9. direto a canulação do ducto salivar fornece saliva mais preciso e puro. No entanto, este é um procedimento tecnicamente desafiador, e o potencial para causar lesão ductal impede a coleções de saliva repetitiva do mesmo animal. Coleta de saliva sob vácuo pode levar a resultados variáveis devido à secagem da saliva do tubo. Esta perda é mais exagerada em camundongos com salivação reduzida. Capilares de vidro permitem a coleta de saliva para análises subsequentes, no entanto, as alterações na viscosidade da saliva secretada no estado doente impede enchimento eficiente do capilar. Além disso, as tentativas de varrer a cavidade oral para coletar saliva residual podem causar ferimentos. O método de pipeta permite a coleção completa, e para o mesmo operador, é notavelmente consistente entre as experiências. No entanto, por razões desconhecidas, esse método mostra uma variação significativa entre os diferentes operadores. Portanto, para permitir comparações apropriadas, torna-se imperativo que o mesmo operador realiza todas as experiências relacionadas a um projeto específico. Claramente, isto representa uma grande desvantagem para um laboratório.
Para superar esses problemas, um procedimento foi desenvolvido que combina métodos de recolha de saliva usada para seres humanos e roedores. O método da zaragatoa, descrito abaixo para medir o volume de saliva induzidas pela pilocarpina é simples, reprodutível, não influenciada pelo operador e pode ser executado repetidamente no mesmo animal. Além disso, permite a coleta de saliva para posteriores análises de proteínas, imunoglobulinas ou outras biomoléculas.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals for saliva collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pilocarpine hydrochloride</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td><td>B21410</td><td>Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anesthesia Mix solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.</td></tr><tr><td>Zetamine (Ketamine hydrochloride)</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>C3N VT1</td><td>Stock is 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Anased (Xylazine)</td><td>Med-Vet International, Mettawa, IL, USA</td><td>RXANASED-20</td><td>Stock is 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Isotonic sterile saline</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>501032</td><td>Used as diluent</td></tr><tr><td>Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment)</td><td>Henry Schien, Dublin, OH, USA</td><td>48272</td><td>Used to prevent eyes from drying during the procedure</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for saliva collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalivaBio Children&#039;s swab</td><td>Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA</td><td>N/A</td><td>Individually wrapped swabs</td></tr><tr><td>50 mL polypropylene tubes</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89004-364</td><td>Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 0.6 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-290</td><td>Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringes with permanently attached needles</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge regular bevel needles</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Sterile scalpel blade #11</td><td>Integra York Inc PA, USA</td><td>4-311</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting forceps</td><td>Roboz, Gaithersburg, MD, USA</td><td>RS-5139</td><td>Serrated angular 0.8 mm tip, 4&quot; length</td></tr><tr><td>Label tape</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA</td><td>sc-224487</td><td></td></tr><tr><td>3 channel timer</td><td>Amazon.com, Seattle, WA, USA</td><td>B06W2KCYVN</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo, Columbus OH, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Invivogen, San Deigo, CA, USA</td><td>tlrl-b5lps</td><td>Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip</td></tr><tr><td>Imject Alum adjuvant</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td>Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Ro52 antiserum</td><td>Generated in lab</td><td></td><td>Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals/ Kits for saliva analyses&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary lysozyme estimation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnzChek Lysozyme Assay Kit</td><td>Molecular Probes, Eugene, OR, USA</td><td>E-22013</td><td>Used as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary IgA estimation by sandwich ELISA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgA</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>0106-01</td><td>Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL</td></tr><tr><td>Goat anti- mouse IgA unlabeled</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-01</td><td>Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer</td></tr><tr><td>Goat anti- mouse IgA HRP</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-05</td><td>Detection antibody used at 1:4000 dilution</td></tr><tr><td>TMB substrate</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>555214</td><td>Used as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates</td><td>Thermo Scientific, Rochester, NY, USA</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary protein estimation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>BioRad, Hercules, CA, USA</td><td>5000006</td><td>For protein estimation as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr></tbody></table>

a method for the measurement of salivary gland function in mice

Pacientes com síndrome de Sjögren, uma doença auto-imune que afectam as glândulas exócrinas, desenvolvem a inflamação das glândulas salivares e reduziram a produção de saliva. Da mesma forma, a produção de saliva é severamente comprometida em pacientes recebendo tratamento com radiação para câncer de cabeça e pescoço. Modelos de roedores, desenvolvidos para imitar essas condições clínicas, facilitam uma compreensão da patogênese da doença e permitam o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Portanto, a capacidade de precisão reproducibly e repetidamente medir a função da glândula salivar em modelos animais é crítica. Base em procedimentos previamente descritos na literatura, um método foi desenvolvido que atende a esses critérios e foi utilizado para avaliar a função da glândula salivar em camundongos. Uma vantagem adicional deste novo método é que ele é facilmente dominado e tem pouca variação inter operador. Função da glândula salivar é avaliada como a quantidade (volume ou peso) ou taxa (mL/min) de saliva produzida em resposta à estimulação de pilocarpina. A saliva coletada é uma boa fonte para as análises do teor de proteínas, as concentrações de imunoglobulinas e outras biomoléculas.

Nos sistemas de modelo experimental do mouse, a capacidade de produzir saliva em resposta à estimulação de pilocarpina é usada como um indicador da função das glândulas salivares. Produção de saliva era medida em ratos fêmeas de C57BL/6 de 11 semanas de idade pelo método cotonete. Na figura 1A, os resultados são expressos como a quantidade de saliva (mg) coletado após doses crescentes de pilocarpina. Com a dose de 1 mg/kg de peso corporal, alguns dos ratos começaram a ter angústia (involuntário a tremer e tremer). Portanto, doses mais elevadas de pilocarpina, além de 1 mg/kg de peso corporal não foram testadas neste estudo. Na figura 1B, os resultados são representados como a proporção de peso de saliva (mg) para o peso do corpo do mouse (g). Coletivamente, estes dados mostram uma relação de resposta boa dose entre produção de quantidade e saliva de pilocarpina. O volume da saliva recuperada o swab também foi medido. Como mostrado na Figura 1, há uma concordância significativa entre o peso de saliva e volume onde 1 mg de saliva é igual a 0,001 mL.
Os resultados obtidos com o método da zaragatoa são semelhantes aos obtidos com o método de coleta de pipeta. Figura 2A mostra que a quantidade média de saliva coletada pelo método da zaragatoa e o método de pipeta é muito semelhante, e as diferenças são estatisticamente não significativas. Figura 2B 2C e 2D mostram que o método da zaragatoa não teve impacto estimativa de biomoléculas na saliva. Na verdade, em comparação com o método de pipeta, o método da zaragatoa mostrou uma tendência global superior nos níveis médios de proteína salivar total (Figura 2), atividade de lisozima salivar (Figura 2D) e IgA salivar (Figura 2E). No entanto, estas diferenças foram estatisticamente não significativas.
O método de coleta de saliva descrito aqui é capaz de detectar diferenças na quantidade de saliva produzida por cepas de mouse diferente (Figura 3) e hipofunção das glândulas salivares induzida por condições diferentes da doença (Figura 4). Figura 3A mostra resultados de produção de saliva de pilocarpina induzida de camundongos C57BL/6 e BALB/c, DBA1/J 129S6 fêmeas 10 12-week-old. Os ratos 129S6 produziram a menor quantidade de saliva em comparação com as outras estirpes. Deve notar-se que as diferenças entre os pesos de corpo destes ratos não foram significativamente diferentes (Figura 3B). Em seguida, foi utilizado o método de swab para detectar hipofunção das glândulas salivares, e dois exemplos são mostrados na Figura 4. A figura 4A mostra um resultado representativo da hipofunção das glândulas salivares induzida pela ativação da imunidade inata, após injeção de lipopolissacarídeo (LPS) (10 µ g/rato, intraperitonealmente). Controle de ratos foram injetados com salina11. Ratos tratados com LPS mostram uma queda significativa na saliva comparado aos controles. Transferência passiva de anticorpos reativos com antígeno de síndrome de Sjögren A/Ro52 induz a hipofunção das glândulas salivares, e este modelo imita certos aspectos da síndrome de Sjögren9. Como mostrado na Figura 4B, ratos injetaram com alum adjuvante mais anticorpos anti-Ro52, juntos, tiveram significativamente menor produção de saliva, em comparação com ratos não tratados ou ratos tratadocom apenas com alum.
O método da zaragatoa é simples de implementar e operador independente. A Figura 5 mostra a produção de saliva de ratos fêmeas 10 13-week-old C57BL/6, em experimentos realizados em 6 pontos diferentes de tempo por 2 operadores diferentes. Operador, que eu comecei com apenas 2 meses de mouse tratamento experiência enquanto operador II tinha 6 meses de prévio mouse manipulando a experiência, mas só foi introduzida para o método de coleta de saliva durante uma semana. Esses dados foram gerados em experiências realizadas por quase um ano separados, usando 0,375 mg/kg dose de pilocarpina. Os rácios de saliva obtidos por ambos os operadores mostram uma gama de leituras (1.84 para 5,87). Operador do que experimentos atravessava um período de 10 semanas enquanto experimentos do operador II foram realizados ao longo de 3 dias consecutivos quase um ano mais tarde (Figura 5A). Notavelmente, os rácios de saliva obtidos ao longo do tempo não foram significativamente diferentes (p = 0,064; Teste de Kruskal-Wallis). Para comparar mais variações inter operador, os rácios de peso de saliva por g de massa corporal de 3 experimentos para cada operador foram agrupados e são mostrados na Figura 5B. Rácios de saliva obtida pelo operador I (média + SEM; 4.45 + 0.152, n = 38) não são significativamente diferentes do operador 2 (média + SEM; 4.21 + 0,169; n = 25; p = 0,296 pelo teste de Mann-Whitney).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig1.jpg"> Figura 1: produção de Saliva é dependente da dose de pilocarpina. Camundongos C57BL6/J (11 semanas de idade fêmeas, 5 por grupo) foram injetados com diferentes doses de pilocarpina (0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg e 1,0 mg/kg peso corporal) e a produção de saliva era medida durante 15 min. (A) os resultados são representados como a quantidade de saliva de mg (média ± SEM). (B) os dados são representados como proporção média de saliva (saliva de mg por peso do corpo do mouse g). (C) Saliva de camundongos C57BL/6 fêmeas de 11 semanas de idade (n = 5) foi coletado pelo método de cotonete. Pilocarpina foi usada na dose de 0,375 mg/kg de peso corporal. Os cotonetes molhados foram pesados para medir a quantidade de saliva produzida em mg. A saliva nas zaragatoas então foi recuperada por centrifugação, e os volumes de saliva recuperado foram medidos. O acordo significativo é visto entre o saliva de peso em mg e saliva volume em µ l. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig1large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig2.jpg"> Figura 2: O método da zaragatoa não afeta a análise de biomoléculas em saliva. Saliva de 2 grupos de camundongos C57BL/6 fêmeas de 11 semanas, (n = 5 ratos por grupo), foi coletado pelo método cotonete ou pelo método de micropipetas. As diferenças nos volumes médios de saliva (A), a média de quantidades de proteína (B), quer dizer a quantidade de atividade de lisozima (C) e quantidades de IgA entre os 2 grupos são estatisticamente não significativas. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig3.jpg"> Figura 3: O método da zaragatoa de coleta de saliva detecta diferenças na produção de saliva de linha de base por diferentes cepas de ratos. (A) Saliva de ratos fêmeas (10-12-semanas) foram coletados por 15 min, usando uma dose de pilocarpina de 0,375 mg/kg de peso corporal. (B) os pesos de corpo médio entre os grupos de ratos não foram significativamente diferentes. Significância estatística foi analisada pelo teste de Kruskal-Wallis, teste, seguido de Dunn do teste de comparações múltiplas. Um p < 0,05 foi considerado significativo. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig4.jpg"> Figura 4: método de Swab detecta hipofunção das glândulas salivares. (A) (A B6 X / J) ratos fêmeas F1 foram injetados com qualquer solução de LPS (0,1 mg/mL, 0,1 mL por rato, intraperitonealmente) ou solução salina e saliva foi medido 26 h mais tarde. Uma experiência representativa mostra uma significativa (p = 0.0079) gota (60%) na produção de saliva em ratos tratados com LPS. (B) hipofunção da glândula salivar foi medida em um sistema de modelo experimental do mouse para a síndrome de Sjögren. O modelo publicado anteriormente transferência passiva para indução de disfunção glandular foi utilizado4 com poucas modificações. Camundongos C57BL/6 fêmeas (10-12 semanas de idade) foram injetados com adjuvante de alum. Nos dias 14 e 20 ratos foram injetados com 0,05 mL de soro de coelho anti-Ro52 e a produção de saliva era medida após 24 h. Observe uma significativa (p = 0.0003) queda (50%) na produção de saliva em camundongos tratados com soro alúmen e anti-Ro52. Significância estatística foi analisada pelo teste de Kruskal-Wallis, teste, seguido de Dunn do teste de comparações múltiplas. Um p < 0,05 foi considerado significativo. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig5.jpg"> Figura 5: O método da zaragatoa produz resultados reprodutíveis, ao longo do tempo (A) e entre operadores (B). O método do esfregaço mostra resultados comparáveis entre os dois operadores com diferentes comprimentos de mouse experiência em experiências realizadas em mais de um ano de tratamento. Produção de saliva de base em ratos fêmeas C57BL/6 (10-13 semanas de idade) foi medida por cada operador. Resultados são expressos em peso de saliva produzida (mg/g de massa corporal). Datas de coleta de saliva estão no eixo x e os resultados dos dados recolhidos ao longo do tempo são mostrados (A). Cada ponto de dados representa um rato, e o número de ratos analisados em cada tempo é mostrado entre parênteses. Rácios de saliva do linha de base (média + SEM), pool de 3 experimentos são mostrados (B)e não são significativamente diferentes entre os operadores. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice at JoVE.com

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Hipofunção das glândulas salivares é uma consequência frequente da terapia de radiação e doença auto-imune. Reprodutível avaliação da função da glândula salivar em modelos do rato destas doenças é um desafio técnico. Aqui, um método simples para a medição exata e reproduzível da produção de saliva em camundongos é descrito.

Um método para a medição da função da glândula salivar em ratos

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

a-method-for-the-measurement-of-salivary-gland-function-in-mice

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.4K visualizações.  Oklahoma Medical Research Foundation. Hipofunção das glândulas salivares é uma consequência frequente da terapia de radiação e doença auto-imune. Reprodutível avaliação da função da glândula salivar em modelos do rato destas doenças é um desafio técnico. Aqui, um método simples para a medição exata e reproduzível da produção de saliva em camundongos é descrito.

Vídeo: A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their head and neck regions for cancer treatment. Both groups of patients experience symptoms such as xerostomia (dry mouth), dysphagia 
(impaired chewing and swallowing), severe dental caries, altered taste, oro-pharyngeal infections (candidiasis), mucositis, pain and discomfort.
One innovative approach of regenerative medicine for the treatment of salivary gland hypo-function is speculated in RS Redman, E Mezey 
et al. 2009: stem cells can be directly deposited by cannulation into the gland as a potent method in reviving the functions of the impaired organ. Presumably, 
the migrated foreign stem cells will differentiate into glandular cells to function as part of the host salivary gland. Also, this cannulation technique is an 
expedient and effective delivery method for clinical gene transfer application.
Here we illustrate the steps involved in performing the cannulation procedure on the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct 
(Fig 1). C3H mice (Charles River, Montreal, QC, Canada) are used for this experiment, which have been kept under clean conventional conditions at 
the McGill University animal resource center. All experiments have been approved by the University Animal Care Committee and were in accordance with the 
guidelines of the Canadian Council on Animal Care.
For this experiment, a trypan blue solution is infused into the gland through the opening of the Wharton's duct using a 
insulin syringe with a 29-gauge needle encased inside a polyethylene tube. Subsequently, the mouse is dissected to show that the infusions migrated 
into the gland successfully.

A protocol for the cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct is described. For this experiment, the trypan blue solution is used as a dyer to demonstrate how this technique effectively delivers infusions into the targeted gland, and to suggest the reliability of this new approach as a potential clinical drug/cell therapy for the regeneration of salivary glands.

Canulação da glândula submandibular do rato através do duto salivar de Wharton

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

Medicina

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Biologia

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Preparação de murino das glândulas salivares Submandibular para microscopia Intravital vertical

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

Isolação de pilhas epithelial salivares das glândulas salivares humanas para o crescimento in vitro como Salispheres ou monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In these cases, questions remain regarding disease pathogenesis and effective interventions. An optimized technique that allows functional assessment of the salivary glands is invaluable for investigating exocrine gland biology, dysfunction, and therapeutics. Here, we present a step by step approach to performing pilocarpine stimulated saliva secretion, including tracheostomy and the dissection of the three major murine salivary glands. We also detail the appropriate murine head and neck anatomy accessed during these techniques. This approach is scalable, allowing for multiple mice to be processed simultaneously, thus improving the efficiency of the work flow. We aim to improve the reproducibility of these methods, each of which has further applications within the field. In addition to saliva collection, we discuss metrics for quantifying and normalizing functional capacity of these tissues. Representative data are included from submandibular glands with depressed salivary gland function 2 weeks following fractionated radiation (4 doses of 6.85 Gy).

We present a detailed approach to performing saliva collection, including murine tracheostomy and the isolation of three major salivary glands.

Murino salivar avaliação funcional através de pilocarpina estimulação seguinte fracionada de radiação

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imagens ao vivo em tempo real da regeneração da glândula submandibular do camundongo

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

Autor em destaque: Estudando as interações entre macrófagos e células epiteliais na regeneração da glândula salivar após lesão 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Interrogando interações célula-célula na glândula salivar via imagem de células vivas ex vivo

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...

Um método para a medição da função da glândula salivar em ratos

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Canulação da glândula submandibular do rato através do duto salivar de Wharton

Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

Preparação de murino das glândulas salivares Submandibular para microscopia Intravital vertical

Isolação de pilhas epithelial salivares das glândulas salivares humanas para o crescimento in vitro como Salispheres ou monolayers

Murino salivar avaliação funcional através de pilocarpina estimulação seguinte fracionada de radiação

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Interrogando interações célula-célula na glândula salivar via imagem de células vivas ex vivo

Interrogando interações célula-célula na glândula salivar via imagem de células vivas ex vivo

Interrogando interações célula-célula na glândula salivar via imagem de células vivas ex vivo