Name: a method for the measurement of salivary gland function in mice
Uploaded: 2018-01-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice at JoVE.com

המחקר נתמך על ידי מענק של מכוני הבריאות הלאומיים, הלאומית המכון של שיניים ומחקר ואסטתיים (DE025030).

הפרוטוקול המתואר להלן אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ועוקבת אחרי ההנחיות מוסרית נוסדה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים. כל הנתונים שהובאו בדו ח זה נוצר על ידי שימוש בעכברים הנשי שהיו בגיל 10-12 שבועות. זני עכברים הבאים שימשו: C57BL/6, BALB/ג, DBA1, 129S ו- F1 (B6XA/J). כל העכברים היו שוכנו בכלובים מכשול (5 חיות לכל כלוב) בתנאים מסוימים ללא הפתוגן וסיפק מזון ומים ad libitum.
1. הכנה
<ol><li>כדי להכין פתרון מניות של פילוקרפין הידרוכלוריד, שוקלת 10 מ ג של המתחם, להמיס ב 1.776 מ ל תמיסת סטרילית מול מאת vortexing, בכדי לתת מענה מניות של 5.63 מ"ג/מ"ל. יש צורך לעקר את הפתרון הזה. אבל, אם תסנן את זה דרך מסנן 0.2 µM. לאחסן פתרון מניות זה aliquots מרובים במקפיא-80 oC עד 3 חודשים. כל מניה קפוא הוא לשימוש יחיד. ברגע הקרת, לא להקפיא את הפתרון פילוקרפין מחדש..</li>
	<li>קח 0.6 מ"ל microfuge צינורות, בזהירות אגרוף חור קטן בתחתית של כל שפופרת עם מחט אל תדאגי מחוממת. הגדר הצינורות האלה לתוך צינורות 2 מ"ל. הצינורות לא צריך להיות סטרילי.</li>
	<li>בעזרת סכין גילוח חד, סטרילי, לחתוך גליל מטליות סופג לחתיכות בערך 2 ס מ אורך. חותכים כל חלק 2 ס מ באלכסון כדי לתת 2 מטליות בצורת חרוט. הצב ספוגית אחת בכל אחד הצינורות microfuge 0.6 מ"ל.</li>
	<li>שוקלים את הצינור microfuge 0.6 מ"ל המכיל הקיסם יבש.</li>
	<li>העברת העכברים שילמדו לתוך כלוב נקי חדש עם בקבוקי מים. לשמור על העכברים ללא מזון במשך לפחות שעתיים לפני תחילת אוסף רוק כדי למנוע חלקיקי מזון שמזהם את הרוק שנאספו. הערה: אין צורך לשמור על העכבר 1 לכל כלוב עבור הליך זה. עם זאת, מספר עכברים להציב בכלוב כל תלוי של המוסד הספציפי החוקים והתקנות לשימוש בבעלי חיים.</li>
	<li>קצת לפני סוף 2 h, הכן הפתרון פילוקרפין לעבוד (0.0563 mg/mL) על ידי דילול מניות פתרון x 100 בתוך תמיסת מלח סטרילית. זה לא הכרחי כדי מסנן נוסף לעקר את הפתרון הזה. שמור תמיד את הפתרון פילוקרפין עובד על קרח. הערה: טבלה 1 נותן כמות פילוקרפין כדי להיות מוזרק למגוון רחב של משקולות גוף העכבר כדי לתת מנה הסופי של 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף.</li>
</ol>2. הליך
<ol><li>שוקל כל עכבר, לקבוע את המינון של המיקס הרדמה עבור כל העכבר באמצעות טבלה 1. להזריק את העכבר הראשון עם נפח מתאים של המיקס הרדמה על ידי תוואי בקרום הבטן. לכוון את הטיימר למשך 2 דקות (רוב זני העכבר במקצועות פרוטוקול זה ללכת לישון על ידי 2 דקות). ודא כי העכבר הוא כראוי ומורדמת באמצעות חוסר הליכה כאשר מניחים על משטח שטוח. אם העכבר עדיין ללכת, לחכות 2 דקות נוספות לפני שתמשיך לשלב הבא. טיפה של משחה אופטלמולוגיות סיכה חלות על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות. הערה: טבלה 1, המינון של המיקס הרדמה היא 0.007 mL/גרם משקל. הטווח האופטימלי עבור הליך זה הוא במשקל הגוף כדי 0.006 0.008 מ ל/g. עם זאת, לאחר 4 דקות, אם העכבר עדיין הליכה או מציג תנועות קופצניות, התייעץ עם הוטרינר מוסדי עבור כראוי להגדיל את המינון של ההרדמה.</li>
	<li>לקבוע את המינון של פילוקרפין אחר העכבר באמצעות טבלה 1 ולהזריק את הכמות המתאימה דרך בקרום הבטן. את הטיימר למשך 2 דקות ולהוסיף את העכבר לתוך הצינור restrainer 50 מ ל עד בראש ובאוזניים להישאר מחוץ הסוף לחתוך. הניחו את השפופרת בזווית של 45 מעלות, עם הראש למטה, ואת (גחוני) פונה כלפי מעלה. קלטת את הצינור ללוח הליך כדי למנוע את העברת. הערה: טבלה 1 מספק המינון עבור עכברים יותר מ- 17 גרם, כמו בהליך זה ניסה לא על עכברים שקילה מתחת 17 גרם.</li>
	<li>בסוף 2 דקות, בעדינות להוסיף זוג מיקרו לנתח מלקחיים לתוך הפה סגור והרם את הלסת התחתונה כלפי מעלה כדי לפתוח את הפה. לדחוף את המלקחיים 1-2 מ מ נוספים לתוך הפה, מוודא כי הלשון נתפסת נח על הזרוע העליונה של המלקחיים. עם עוד זוג מלקחיים בסדר, להחזיק הקיסם יבש מראש שנשקל קרוב את קצהו חרוט.</li>
	<li>החלק בעדינות את קצה הדגימה חרוט לתוך הפה. תיסוג המלקחיים ולהשאיר את קצה הדגימה בחלל הפה.</li>
	<li>לאחוז בקצה רחב יותר של הדגימה הארכת מחוץ הפה וסובב אותו כדי לאפשר מקסימום שטח המגע עם הפה. שמור את הספוגית בתנוחה זו למשך 15 דקות. הערה: פעולה זו מבטיחה כי הדגימה נשאר בפה למשך כל האוסף. שימו לב כי קצה הדגימה חרוט משמש הפתיל, החלק הרחב של הדגימה, נותר מחוץ לפה.</li>
	<li>בסוף 15 דקות, בעדינות לסובב הדגימה כדי לאסוף את כל רוק זה לא נספג ולמקם את הספוגית לחה בצינור microfuge 0.6 מ"ל. לסגור את הצינור ולהגדיר אותו בצינור 2 מ"ל על קרח. הערה: בשלב זה, הרירית האוראלית יופיעו יבש לחלוטין. העכבר עכשיו ניתן להעביר בחזרה לכלוב שלו ההתאוששות מן ההרדמה.</li>
	<li>להעביר את העכבר בתוך הכלוב. המקום לחלח באוכל שלהן בכלוב אחרי אוסף רוק כדי לסייע מהיר התייבשות. הערה: העכברים להתעורר בתוך 10 דקות לאחר הסיום של האוסף. הזרקה תת עורית של 0.2 מ"ל תמיסת מלח מול ומחוממת מראש יכול להינתן גם כדי להאיץ את ההחלמה.</li>
	<li>להמשיך העכבר הבאה. כל העכברים צריכים להיות במעקב עד הם התאוששו לגמרי, הן פעולות כירורגיות.</li>
</ol>3. מדידות
<ol><li>בסוף כל האוספים, לשקול את צינורות 0.6 מ"ל עם הדגימה רטוב. חישוב ההפרש בין משקל רטוב משקל יבש כדי לקבל את המשקל של הרוק מיוצר. מקם את הצינור 0.6 מ"ל עם הרוק בחזרה לתוך הצינור 2-mL.</li>
	<li>חתוך את הפקקים של הצינורות 2 מ"ל. לאחר מכן, centrifuge את צינורות 2 מ"ל למשך 2 דקות ב g 7500 x, ב 4oC ומפרידה מיקרו לשחזר את הרוק. למדוד את עוצמת הקול של הרוק תוך שימוש micropipette.</li>
	<li>לבטא את התוצאות כמו רוק משקל (מ ג)10 מעל 15 דקות או כיחס של רוק משקל (מ ג) / עכבר משקל הגוף (g). הערה: אם יש כבר למדוד הנפח של רוק חולצו מתוך הדגימה, לבטא את התוצאות כמות הרוק התאושש (mL) או היחס בין נפח רוק (mL) / עכבר משקל הגוף (g).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proctor, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+salivary+secretion.">The physiology of salivary secretion.</a> Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).</li><li>Fox, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sj&#246;gren's+syndrome.">Sj&#246;gren's syndrome.</a> Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).</li><li>Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xerostomia+and+its+predictors+following+parotid-sparing+irradiation+of+head-and-neck+cancer.">Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).</li><li>Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+secretion+rates+from+mouse+and+rat+parotid+glands+are+markedly+different+following+pilocarpine+stimulation.">Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation.</a> Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).</li><li>Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+short-term+gamma-irradiation+effects+on+mouse+salivary+gland+function+using+a+new+saliva+collection+device.">Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device.</a> Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).</li><li>Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+short+peptides+from+the+60-kDa+Ro+antigen+recapitulates+the+serological+and+pathological+findings+as+well+as+the+salivary+gland+dysfunction+of+Sjogren's+syndrome.">Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome.</a> J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).</li><li>Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+innate+immune+responses+through+Toll-like+receptor+3+causes+a+rapid+loss+of+salivary+gland+function.">Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function.</a> J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).</li><li>Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+accelerate+Sj&#246;gren's+syndrome-like+disease+in+(NZB+x+NZW)F1+mice.">Inflammatory stimuli accelerate Sj&#246;gren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice.</a> Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+innate+immunity+and+Ro52-induced+antibody+causes+Sj&#246;gren's+syndrome-like+disorder+in+mice.">Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sj&#246;gren's syndrome-like disorder in mice.</a> Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).</li><li>Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca J&#250;nior, L., Renzi, A., Menani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+muscarinic+receptors+signal+pilocarpine-induced+salivation.">Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation.</a> J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).</li><li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+elevation+and+secretion+of+interleukin-1beta+in+the+submandibular+gland+of+male+mice.">Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice.</a> Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).</li><li>Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+isoflurane+anesthesia+and+pilocarpine+on+rat+parotid+saliva+flow.">Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow.</a> Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).</li><li>Kohrs, R., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine:+teaching+an+old+drug+new+tricks.">Ketamine: teaching an old drug new tricks.</a> Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).</li><li>Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+saliva+collection+using+cotton+swab+on+cortisol+enzyme+immunoassay.">Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay.</a> Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

ייצור רוק הוא תהליך מורכב, מושפע מגורמים רבים. לכן, מדידת תפקוד בלוטת הרוק בחיות מעבדה עשויה להיות אתגר. אתגר נוסף הוא כי מדידות חוזרות של תפקוד בלוטת הרוק אצל אותה חיה נדרשים להקים תחילתה של מחלה או להפגין התאוששות לאחר הטיפול.
השיטה ספוגית שתוארו בדו ח זה פשוטה מבחינה טכנית לבצע עם אפשרויות מרובות כדי לייצג את הנתונים. התוצאות המתקבלות הן לשחזור, עם הבין-מפעיל גרסא חדשה. השיטה יכול לזהות ירידה בייצור הרוק מודלים שונים של תפקוד לקוי של בלוטת הרוק. יתרון משמעותי הוא השימוש של פולימרים אינרטי, סופג מאוד שחזור יעיל של רוק שנאספו, המאפשר מדידה של מולקולות הרוק. יתרון נוסף של שיטה זו הוא שניתן לבצע את הליך בו זמנית בעכברים עד 2 בכל פעם על-ידי מפעיל יחיד. זה באופן משמעותי יעיל יותר חלק מהשיטות האחרות, איפה זה מתבצע בעכבר אחת בכל פעם.
ההשתנות במדידות ייצור רוק היה שונא את כל טכניקות מדידה של הרוק. כדי למזער את השתנות, חשוב לדבוק בקפדנות הפרוטוקול. שלבים קריטיים כוללים: בחירה זמנית של היום צום העכברים ואיסוף רוק, המתאים מינון תרופות להרדמה פילוקרפין (טבלה 1), ואת משקל מדויק הרשומות של דגימות רטובה ויבשה. ניהול זמן זהירות נדרשת כדי להגדיר עד שני עברים בכל פעם עבור אוסף רוק.
כפי שמוצג באיור3, הסכום של הרוק מיוצר על ידי עכברים הוא זן התלויים. לכן, מתאים למתח, גיל ומין עכברים תואמים אמור לשמש כפקדי. טיטור של המינון פילוקרפין, המתח ספציפיים, התנאי ניסיוני בחקירה, מומלץ בחום. למרות מינון גבוה יותר של פילוקרפין מעבר 0.5 מ"ג/ק"ג גורם ייצור מוגבר של רוק, כדי להעריך את הבלוטות hypofunction, מומלץ להשתמש במינון נמוך. דבר זה מאפשר זיהוי הבדלים משניים אפילו בייצור רוק בין חולה ולשלוט עכברים. מינונים של 0.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף, 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף שימשו בהצלחה להפגין בלוטת הרוק hypofunction. עם זאת, יצוין כי מערכות דגם ניסיוני מסוימים עשויים לדרוש תקופות ארוכה או קצרה יותר של אוסף מזה המתואר פרוטוקול זה. זה צריך להיבדק על ידי כל מעבדה.
מגבלה של שיטה זו, רוב שיטות מדידה רוק הוא בצורך בהרדמה. הדו ח באמצעות שיטת ואקום אינו כולל את השימוש הרדמה5. עם זאת, היעדר הרדמה גורם רמות משתנות של חרדה בעכברים. הם נוטים המאבק ולנשוך את הצנרור, זה בתורו, יכול להשפיע על יעילות פלט ואוסף רוק. איזופלוריין הרדמה אצל חולדות גורם הייצור12רוק פילוקרפין המושרה פתע. לעומת זאת, קטמין מגביר הפרשות הסמפונות, הרוק באמצעות גירוי אוהד13. אנחנו ואחרים השתמשו בהצלחה של קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים תערובת כחומר הרדמה למדידת פילוקרפין המושרה רוק ייצור4,7,8,9. הטווח המומלץ עבור ניתוח בהרדמה הוא 100-200 מ"ג/ק"ג של קטמין ו- 5-16 מ"ג/ק"ג של חריגות השירותים הווטרינריים14. המינון של 0.006-0.008 מ ל/גרם משקל בשימוש בשיטה זו (מקביל 60-80 מ"ג/ק"ג של קטמין ו- 6-8 מ"ג/ק"ג של חריגות השירותים הווטרינריים) נופל על הקצה התחתון של הטווח המומלץ, מספיקה למתן רמה אחידה של קיבעון ללא הרדמה עמוקה .
השיטה ספוגית הוקמה כחלופה לשיטה micropipet בשימוש שגרתי. החיסרון העיקרי של שיטת pipet היה ההשתנות הגבוהה בין המפעיל לבין הצורך לאסוף רוק עכבר אחד בכל פעם. השיטה ספוגית מטפל בשתי בעיות אלה. היתרונות כוללים הגבלה של מספר בעלי חיים הדרושים כדי להשיג כוח ניתוחים סטטיסטיים, התייעלות. ספוגיות כותנה בהחלפה עם פולימר אינרטי מטליות מציעים אפשרות טובה יותר מאז ספוגיות כותנה ידועים לפגיעה כימות של מולקולות פעילים ביולוגית-15.
לאור הפשטות של השיטה ספוגית, שלה הפארמצבטית גבוהה בין אנשים שונים, יש לקוות כי השיטה ספוגית יקל יותר השוואות של דגמי העכבר בין חוקרים במעבדות שונות ומוסדות.

בלוטות הרוק לייצר רוק בתגובה למגוון גירויים נוירולוגית ועל מכניים1. הגירויים מתבצעות דרך מערכת העצבים הסימפתטית, הפארא-סימפתטי לקולטנים adrenergic, שימוש ב בלוטת. פילוקרפין הוא סוכן שימוש, פארא-sympathomimetic, אשר פועלת בעיקר על קולטנים מוסקריניים. בבלוטת הרוק, זה גורם הייצור של רוק על ידי משחק על קולטן מוסקריני M31. ייצור רוק בעקבות פילוקרפין המינהל הוא מחוון ליכולת של בלוטות הרוק להגיב לגירוי, הוא נפוץ כאמצעי של תפקוד בלוטת הרוק.
מדידה מדויקת של ייצור רוק הוא קריטי במחקר של מחלות בלוטת הרוק כולל תסמונת סיוגרן2 ופציעה קרינה בעקבות הראש והצוואר סרטן טיפול3. פותחו מספר שיטות שונות למדידת ייצור רוק בחולדות. אלה כוללות תעלות ישירה של צינור הרוק excretory4, אוסף של רוק בין חלל הפה תחת ואקום5, וכן אוסף באמצעות נימי זכוכית6 או7,micropipette8, 9. ישיר תעלות התעלה הרוק מספק ביותר רוק טהור ומדויקים. עם זאת, זהו תהליך מאתגר מבחינה טכנית, פוטנציאל גרימת חבלה ductal מונע אוספים רוק חוזרות של אותה חיה. איסוף הרוק תחת ואקום יכול להוביל לתוצאות משתנה עקב ייבוש של רוק מהצינור. אובדן זה היא מוגזמת נוספת אצל עכברים עם ריור מופחת. נימים זכוכית לאפשר את האוסף של רוק עבור ניתוחים שלאחר מכן, אולם, שינויי צמיגות של רוק מופרש במדינה נגועים מונע מילוי יעיל נים. יתרה מזאת, הניסיונות לטאטא את חלל הפה כדי לאסוף שאריות הרוק יכול להוביל לפציעה. שיטת pipet מאפשר איסוף מלאה, המפעיל אותו, זה עקביות במידה ניכרת בין ניסויים. עם זאת, מסיבות לא ידועות, שיטה זו מציגה וריאציה משמעותי בין מפעילי שונים. לכן, כדי לאפשר השוואות המתאים, הוא הופך להיות הכרחי שבו המפעיל אותו מבצע את כל הניסויים הקשורים לפרוייקט ספציפי. ברור, זה מייצג חיסרון מרכזי עבור מעבדה.
כדי להתגבר על בעיות אלה, הליך פותחה כי משלב רוק אוסף שיטות להשתמש עבור בני אדם ומכרסמים. שיטת ספוגית, המתוארים להלן למדידת נפח פילוקרפין-induced רוק פשוטה, לשחזור, לא השפיעו על ידי המפעיל, ניתן לבצע שוב ושוב על אותה חיה. בנוסף, היא מאפשרת איסוף הרוק עבור ניתוחים עוקבות של חלבונים, immunoglobulins או מולקולות אחרות.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals for saliva collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pilocarpine hydrochloride</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td><td>B21410</td><td>Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anesthesia Mix solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.</td></tr><tr><td>Zetamine (Ketamine hydrochloride)</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>C3N VT1</td><td>Stock is 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Anased (Xylazine)</td><td>Med-Vet International, Mettawa, IL, USA</td><td>RXANASED-20</td><td>Stock is 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Isotonic sterile saline</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>501032</td><td>Used as diluent</td></tr><tr><td>Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment)</td><td>Henry Schien, Dublin, OH, USA</td><td>48272</td><td>Used to prevent eyes from drying during the procedure</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for saliva collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalivaBio Children&#039;s swab</td><td>Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA</td><td>N/A</td><td>Individually wrapped swabs</td></tr><tr><td>50 mL polypropylene tubes</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89004-364</td><td>Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 0.6 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-290</td><td>Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringes with permanently attached needles</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge regular bevel needles</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Sterile scalpel blade #11</td><td>Integra York Inc PA, USA</td><td>4-311</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting forceps</td><td>Roboz, Gaithersburg, MD, USA</td><td>RS-5139</td><td>Serrated angular 0.8 mm tip, 4&quot; length</td></tr><tr><td>Label tape</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA</td><td>sc-224487</td><td></td></tr><tr><td>3 channel timer</td><td>Amazon.com, Seattle, WA, USA</td><td>B06W2KCYVN</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo, Columbus OH, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Invivogen, San Deigo, CA, USA</td><td>tlrl-b5lps</td><td>Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip</td></tr><tr><td>Imject Alum adjuvant</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td>Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Ro52 antiserum</td><td>Generated in lab</td><td></td><td>Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals/ Kits for saliva analyses&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary lysozyme estimation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnzChek Lysozyme Assay Kit</td><td>Molecular Probes, Eugene, OR, USA</td><td>E-22013</td><td>Used as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary IgA estimation by sandwich ELISA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgA</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>0106-01</td><td>Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL</td></tr><tr><td>Goat anti- mouse IgA unlabeled</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-01</td><td>Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer</td></tr><tr><td>Goat anti- mouse IgA HRP</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-05</td><td>Detection antibody used at 1:4000 dilution</td></tr><tr><td>TMB substrate</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>555214</td><td>Used as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates</td><td>Thermo Scientific, Rochester, NY, USA</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary protein estimation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>BioRad, Hercules, CA, USA</td><td>5000006</td><td>For protein estimation as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr></tbody></table>

a method for the measurement of salivary gland function in mice

חולים עם תסמונת סיוגרן, מחלה אוטואימונית משפיע על בלוטות אקסוקרינית, לפתח דלקת בלוטת הרוק, הפחיתו ייצור רוק. באופן דומה, ייצור רוק נפגעו קשות בחולים שקיבלו טיפול קרינה עבור סרטן הראש והצוואר. מודלים מכרסמים, שפותחה כדי לחקות תנאים קליניים אלה, להקל על הבנת הפתוגנזה המחלה ולאפשר הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשות. לכן, היכולת למדוד באופן מדויק, reproducibly ו שוב ושוב תפקוד בלוטת הרוק במודלים של בעלי חיים הוא קריטי. בונים על הליכים שתואר קודם לכן בספרות, שיטה פותחה עונה על קריטריונים אלה, שימש להערכת תפקוד בלוטת הרוק בעכברים. יתרון נוסף של שיטה חדשה היא כי זה הוא שולט בקלות, יש גרסא חדשה בין המפעיל. תפקוד בלוטת הרוק מוערך את הסכום (משקל או נפח) או קצב (mL/min) של הרוק מיוצר בתגובה לגירוי פילוקרפין. הרוק שנאספו הוא מקור טוב עבור הניתוחים של תכולת החלבון, ריכוזים בנוגדנים מולקולות אחרות.

במערכות דגם ניסיוני העכבר, היכולת לייצר רוק בתגובה לגירוי פילוקרפין משמש כמחוון של תפקוד בלוטת הרוק. ייצור רוק נמדדה בעכברים נקבה בת 11 בשבוע C57BL/6 בשיטת ספוגית. ב- איור 1A, התוצאות מבוטא את כמות הרוק (מ ג) שנאספו בעקבות הגדלת מינון של פילוקרפין. במינון של 1 מ"ג/ק"ג משקל גוף, חלק העכברים התחיל מפגין מצוקה (באופן לא רצוני רועד רועד). ומכאן מינונים גבוהים יותר של פילוקרפין, מעבר 1 מ"ג/ק"ג משקל גוף לא נבדקו במחקר זה. ב- איור 1B, התוצאות מיוצגים כיחס בין רוק משקל (מ ג) למשקל הגוף העכבר (g). באופן קולקטיבי, נתונים אלה מראים קשר תגובה מינון גבוה בין ייצור כמות ורוק פילוקרפין. הנפח של רוק התאוששה הדגימה נמדדה גם. כפי שמוצג באיור 1C, יש הקונקורדנציה משמעותי בין רוק ונפח איפה 1 מ ג של רוק שווה ל- 0.001 mL.
התוצאות המתקבלות באמצעות שיטת ספוגית דומים לאלו שהושגו באמצעות שיטת איסוף פיפטה. איור 2A מראה כמות הרוק שנאספו על ידי שיטת ספוגית ושיטת pipet רשע דומה מאוד ההבדלים אינם סטטיסטית משמעותית. איור 2B 2 ג ו- 2D מראים כי השיטה ספוגית לא משפיעים שערוך של מולקולות ברוק. למעשה, לעומת שיטת pipet, השיטה ספוגית הראה על המגמה הכללית גבוהה יותר של רמות אכזרי של חלבון הרוק הכולל (איור 2C), פעילות ליזוזים הרוק (איור דו-ממדי) איגה הרוק (איור 2E). עם זאת, הבדלים אלה מבחינה סטטיסטית לא היו משמעותיים.
אוסף רוק השיטה המתוארת כאן הוא יכול לזהות את ההבדלים בין הרוק מיוצר על ידי העכבר שונים זנים (איור 3), בלוטת הרוק hypofunction המושרה על ידי תנאים מחלות שונות (איור 4). איור 3A מציג תוצאות של ייצור רוק פילוקרפין המושרה עכברים C57BL/6, BALB/ג, DBA1/J ו- 129S6 נשים 10-12-בת שבוע. העכברים 129S6 המיוצר הסכום הנמוך ביותר של הרוק לעומת זנים אחרים. יצוין, כי ההבדלים משקלי גוף אלו עכברים היו לא שונה באופן משמעותי (איור 3B). בשלב הבא, השיטה ספוגית שימש כדי לזהות בלוטת הרוק hypofunction, שתי דוגמאות מוצגות באיור4. איור 4A מראה תוצאה נציג של בלוטת הרוק hypofunction המושרה על ידי הפעלת מולדת חסינות לאחר ההזרקה של ליפופוליסכריד (LPS) (µg 10/עכבר, intraperitoneally). בקרת עכברים הוזרקו מלוחים11. עכברים שטופלו LPS מראים ירידה משמעותית רוק לעומת שולט. העברה פסיבית של נוגדנים תגובתי עם תסמונת אנטיגן סיוגרן A/Ro52 גורם בלוטת הרוק hypofunction, מודל זה מחקה היבטים מסוימים של תסמונת סיוגרן9. כפי שמוצג באיור 4B, עכברים הזריק אדג'וונט אלום פלוס נוגדנים anti-Ro52 ביחד היה ייצור רוק נמוך באופן משמעותי בהשוואה לעכברים שלא טופלו או עכברים שטופלו רק אלום.
השיטה ספוגית היא פשוט ליישם מפעיל עצמאי. איור 5 מציג ייצור הרוק הנשי 10-13-בת שבוע עכברים C57BL/6, בנסויים שנערכו בנקודות זמן שונות 6 באמצעות אופרטורים שונים 2. אופרטור התחלתי עם רק 2 חודשים של העכבר טיפול ניסיון בעוד המפעיל השני היה 6 חודשים של העכבר מוקדמת טיפול ניסיון, אבל הוצג רק לשיטת אוסף רוק למשך שבוע. נתונים אלה נוצרו בניסויים ביצעו כמעט שנה בנפרד, שימוש במינון פילוקרפין 0.375 מ"ג/ק"ג. היחס רוק מתקבל על ידי שני אופרטורים להציג טווח של קריאות (1.84 כדי 5.87). אופרטור של הניסויים המורחב תקופה של 10 שבועות בזמן הניסויים של המפעיל השני בוצעו מעל 3 ימים רצופים כמעט שנה לאחר מכן (איור 5A). ראוי לציין, היחס רוק שהושג לאורך זמן לא היו שונים באופן משמעותי (p = 0.064; מבחן Kruskal-Wallis). כדי עוד יותר להשוות בין המפעיל הספציפיים, היחס של רוק משקל לכל גרם משקל של ניסויים 3 עבור כל אופרטור היו איחדו, מוצגות באיור איור 5B. רוק יחסי שהושג על-ידי המפעיל (ממוצע + SEM; 4.45 + 0.152, n = 38) אינם שונים באופן משמעותי מפעיל 2 (ממוצע + SEM; 4.21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 על ידי מבחן מאן ויטני).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig1.jpg"> איור 1: ייצור רוק תלויה במינון פילוקרפין. C57BL6/J עכברים (נקבות בת 11 בשבוע, 5 לכל קבוצה) הוזרקו מינונים שונים של פילוקרפין (משקל 0.25 מ"ג/ק"ג, 0.5 מ"ג/ק"ג, 1.0 מ"ג/ק"ג גוף), ייצור רוק נמדדה במשך 15 דקות (א) תוצאות מיוצגים כסכום רוק מ ג (זאת אומרת ± SEM). (B) הנתונים מיוצגים כמו רוק רשע יחס (רוק מ"ג לכל גרם משקל העכבר). (ג) רוק של עכברים C57BL/6 נקבה בת 11 בשבוע (n = 5) נאסף ע י שיטת ספוגית. פילוקרפין נעשה שימוש במינון של 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף. הושארו רטוב נשקלו כדי למדוד את כמות הרוק מיוצר מ ג. הרוק בהושארו נמצאה לאחר מכן על ידי צנטריפוגה ולאחר הכרכים של הרוק התאושש נמדדו. ההסכם משמעותי נתפסת בין המשקל רוק בכרך מ"ג ו רוק µL. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig2.jpg"> איור 2: שיטת ספוגית לא משפיע על הניתוח של מולקולות ברוק. רוק של 2 קבוצות של עכברים C57BL/6 נקבה בת 11 בשבוע, (n = 5 עכברים לכל קבוצה), נאספה בשיטת ספוגית או באמצעות פעולת השירות micropipet. ההבדלים רשע כרכים של רוק (א), כלומר בכמות החלבון (B), מתכוון כמויות של פעילות ליזוזים (C), ואני מתכוון כמויות האיגה בין 2 הקבוצות אינן סטטיסטית משמעותית. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig3.jpg"> איור 3: שיטת ספוגית של אוסף רוק מזהה הבדלים בייצור הרוק קו הבסיס על ידי זנים שונים של עכברים. (א) רוק של עכברים (10-12-בת שבוע) נקבה שנאספו במשך 15 דקות באמצעות מנה פילוקרפין של 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף. (B) משקולות הגוף אומר בין הקבוצות של עכברים לא היו שונים באופן משמעותי. מובהקות סטטיסטית נותחו על ידי Kruskal-איי ווליס מבחן, ואחריו דאן של מבחן השוואות מרובות. P < 0.05 נחשב משמעותי. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig4.jpg"> איור 4: שיטת ספוגית מזהה בלוטת הרוק hypofunction. (א) (B6 X A / J) עכברים הנשי F1 הוזרק גם פתרון LPS (0.1 mg/mL, mL 0.1 לכל עכבר, intraperitoneally) או תמיסת מלח, ורוק נמדדה 26 h מאוחר יותר. ניסוי נציג מראה משמעותי (p = 0.0079) ירידה (60%) בייצור הרוק עכברים שטופלו LPS. (B) בלוטת הרוק hypofunction נמדדה במערכת מודל ניסיוני העכבר לתסמונת סיוגרן. המודל העברה פסיבית שפורסמו קודם לכן עבור אינדוקציה של תפקוד הבלוטות היה בשימוש4 עם כמה שינויים. C57BL/6 נקבות עכברים (בן 10-12 שבועות) הוזרקו אדג'וונט אלום. בימים 14 ו- 20 עכברים הוזרקו 0.05 מ של הארנב סרום אנטי-Ro52, ייצור רוק נמדדה אחרי ה 24 הערה משמעותי (p = 0.0003) טיפה (50%) בייצור הרוק עכברים שטופלו סרום אלום ו anti-Ro52. מובהקות סטטיסטית נותחו על ידי Kruskal-איי ווליס מבחן, ואחריו דאן של מבחן השוואות מרובות. P < 0.05 נחשב משמעותי. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig5.jpg"> איור 5: השיטה ספוגית מניבה תוצאות לשחזור לאורך זמן (א) ובין מפעילי (B). השיטה ספוגית מראה תוצאות דומות בין שני אופרטורים בעלי אורכים שונים של העכבר טיפול ניסיון בניסויים שבוצעו על שנה אחת. ייצור רוק בסיסית בעכברים הנשי C57BL/6 (מגיל 10-13 שבועות) נמדדה על ידי כל אופרטור. תוצאות מבוטא משקל של הרוק מיוצר (מ ג/גרם משקל). תאריכים של אוסף רוק בציר ה-x, מוצגות התוצאות של הנתונים שנאספו לאורך זמן (א). כל נקודת נתונים מייצג עכבר אחד, מספר עכברים ניתח כל הזמן מוצג בסוגריים. בסיסית רוק יחסי (ממוצע + SEM) איחדו בין 3 ניסויים מוצגים (B), והם אינם שונים באופן משמעותי בין מפעילי. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice at JoVE.com

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

בלוטת הרוק hypofunction הוא תוצאה תכופים של מחלות אוטואימוניות והקרנות. לשחזור הערכה של תפקוד בלוטת הרוק במודלים של העכבר המחלות האלה היא אתגר טכני. . הנה, מתוארת שיטה פשוטה למדידה מדויקת, לשחזור של ייצור רוק בעכברים.

שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

a-method-for-the-measurement-of-salivary-gland-function-in-mice

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.4K Views.  Oklahoma Medical Research Foundation. בלוטת הרוק hypofunction הוא תוצאה תכופים של מחלות אוטואימוניות והקרנות. לשחזור הערכה של תפקוד בלוטת הרוק במודלים של העכבר המחלות האלה היא אתגר טכני. . הנה, מתוארת שיטה פשוטה למדידה מדויקת, לשחזור של ייצור רוק בעכברים.

Video: A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their head and neck regions for cancer treatment. Both groups of patients experience symptoms such as xerostomia (dry mouth), dysphagia 
(impaired chewing and swallowing), severe dental caries, altered taste, oro-pharyngeal infections (candidiasis), mucositis, pain and discomfort.
One innovative approach of regenerative medicine for the treatment of salivary gland hypo-function is speculated in RS Redman, E Mezey 
et al. 2009: stem cells can be directly deposited by cannulation into the gland as a potent method in reviving the functions of the impaired organ. Presumably, 
the migrated foreign stem cells will differentiate into glandular cells to function as part of the host salivary gland. Also, this cannulation technique is an 
expedient and effective delivery method for clinical gene transfer application.
Here we illustrate the steps involved in performing the cannulation procedure on the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct 
(Fig 1). C3H mice (Charles River, Montreal, QC, Canada) are used for this experiment, which have been kept under clean conventional conditions at 
the McGill University animal resource center. All experiments have been approved by the University Animal Care Committee and were in accordance with the 
guidelines of the Canadian Council on Animal Care.
For this experiment, a trypan blue solution is infused into the gland through the opening of the Wharton's duct using a 
insulin syringe with a 29-gauge needle encased inside a polyethylene tube. Subsequently, the mouse is dissected to show that the infusions migrated 
into the gland successfully.

A protocol for the cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct is described. For this experiment, the trypan blue solution is used as a dyer to demonstrate how this technique effectively delivers infusions into the targeted gland, and to suggest the reliability of this new approach as a potential clinical drug/cell therapy for the regeneration of salivary glands.

Cannulation של בלוטת הרוק באמצעות עכבר Submandibular Duct של וורטון

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

Medicine

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Biology

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

הכנה של בלוטת הרוק Submandibular מאתר מיקרוסקופ Intravital זקופה

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

בידוד של תאים אפיתל הרוק מן הרוק בלוטות האדם עבור צמיחה מחוץ לתחום כמו סאליספירות או Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In these cases, questions remain regarding disease pathogenesis and effective interventions. An optimized technique that allows functional assessment of the salivary glands is invaluable for investigating exocrine gland biology, dysfunction, and therapeutics. Here, we present a step by step approach to performing pilocarpine stimulated saliva secretion, including tracheostomy and the dissection of the three major murine salivary glands. We also detail the appropriate murine head and neck anatomy accessed during these techniques. This approach is scalable, allowing for multiple mice to be processed simultaneously, thus improving the efficiency of the work flow. We aim to improve the reproducibility of these methods, each of which has further applications within the field. In addition to saliva collection, we discuss metrics for quantifying and normalizing functional capacity of these tissues. Representative data are included from submandibular glands with depressed salivary gland function 2 weeks following fractionated radiation (4 doses of 6.85 Gy).

We present a detailed approach to performing saliva collection, including murine tracheostomy and the isolation of three major salivary glands.

מאתר הערכה תפקודית הרוק באמצעות בעקבות גירוי פילוקרפין Fractionated קרינה

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

הדמיה חיה בזמן אמת של התחדשות בלוטה תת-לסתית של עכבר

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

מחבר זרקור: חקר אינטראקציות מקרופאג'-אפיתל בין תאים בהתחדשות בלוטת הרוק לאחר פציעה 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

חקירת אינטראקציות תאים-תאים בבלוטת הרוק באמצעות Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...

שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Cannulation של בלוטת הרוק באמצעות עכבר Submandibular Duct של וורטון

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

הכנה של בלוטת הרוק Submandibular מאתר מיקרוסקופ Intravital זקופה

בידוד של תאים אפיתל הרוק מן הרוק בלוטות האדם עבור צמיחה מחוץ לתחום כמו סאליספירות או Monolayers

מאתר הערכה תפקודית הרוק באמצעות בעקבות גירוי פילוקרפין Fractionated קרינה

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

חקירת אינטראקציות תאים-תאים בבלוטת הרוק באמצעות Ex Vivo Live Cell Imaging

חקירת אינטראקציות תאים-תאים בבלוטת הרוק באמצעות Ex Vivo Live Cell Imaging

חקירת אינטראקציות תאים-תאים בבלוטת הרוק באמצעות Ex Vivo Live Cell Imaging