Name: a method for the measurement of salivary gland function in mice
Uploaded: 2018-01-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
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Lo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dal National Institutes of Health, National Institute of Dental e Craniofacial Research (DE025030).

Il protocollo descritto di seguito è stato approvato dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale e segue gli orientamenti etici stabiliti dal National Institutes of Health. Tutti i dati presentati in questo rapporto sono stati generati utilizzando topi femminili che erano 10-12 settimane di età. Sono stati utilizzati i seguenti ceppi di topi: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S e F1 (B6XA/J). Tutti i topi sono stati alloggiati in gabbie di barriera (5 animali per gabbia) in condizioni da organismi patogeni specifiche e forniti di mangime e acqua ad libitum.
1. preparazione
<ol><li>Per preparare una soluzione di cloridrato di pilocarpine, pesare 10 mg del composto e dissolverlo in 1,776 mL di soluzione salina isotonica sterile nel Vortex, per dare una soluzione stock di 5,63 mg/mL. Non c'è nessuna necessità di sterilizzare questa soluzione. Ma se lo si desidera, filtrare attraverso un filtro da 0,2 µM. Conservare questa soluzione madre in diverse aliquote in un congelatore-80 oC per fino a 3 mesi. Ogni azione congelate è per uso singolo. Una volta scongelato, non ricongelare la soluzione pilocarpina.</li>
	<li>Prendere 0,6 mL microfuge tubi e attentamente un pugno un piccolo foro nella parte inferiore di ogni tubo con un ago calibro 18 riscaldato. Impostare questi tubi in provette da 2 mL. I tubi non devono essere sterili.</li>
	<li>Utilizzando una lama di rasoio affilata, sterile, taglio cilindrici tamponcini assorbenti in pezzi di circa 2 cm di lunghezza. Tagliare ogni pezzo di 2 cm in diagonale per dare 2 tamponi a forma conici. Inserire un tampone in ciascuna delle provette microfuge 0,6 mL.</li>
	<li>Pesare il tubo di microfuge 0,6 mL contenente il tampone asciutto.</li>
	<li>Trasferire i topi da studiare in una nuova gabbia pulita con bottiglie d'acqua. Tenere i topi senza cibo per almeno 2 h prima dell'inizio della raccolta della saliva per impedire la contaminazione di saliva raccolta le particelle di cibo. Nota: Non è necessario mantenere 1 mouse per gabbia per questa procedura. Tuttavia, il numero dei topi collocati in ogni gabbia dipende dell'istituzione specifiche norme e regolamenti per uso animale.</li>
	<li>Poco prima della fine di 2 h, preparare la soluzione di lavoro pilocarpina (0,0563 mg/mL) diluendo la soluzione di riserva 100 x in soluzione fisiologica sterile. Non è necessario filtrare ulteriormente sterilizzare questa soluzione. Tenere sempre la soluzione di Pilocarpina lavoro sul ghiaccio. Nota: La tabella 1 fornisce la quantità di Pilocarpina deve essere iniettato per una gamma di pesi corporei del mouse per dare una dose finale di 0,375 mg/kg di peso corporeo.</li>
</ol>2. la procedura
<ol><li>Pesare ogni mouse e determinare la dose di anestetico mix per ogni mouse utilizzando la tabella 1. Iniettare il primo mouse con il volume appropriato della miscela anestetica per via intraperitoneale. Impostare il timer per 2 min (la maggior parte dei ceppi murini testati in questo protocollo andare a dormire da 2 min). Assicurarsi che il mouse è adeguatamente anestetizzato dalla mancanza di camminare quando appoggiata su una superficie piana. Se il mouse è ancora a piedi, attendere per ulteriori 2 min prima di procedere al passaggio successivo. Applicare una goccia di lubrificante unguento oftalmico in entrambi gli occhi per evitare l'essiccazione. Nota: Nella tabella 1, la dose della miscela anestetica è peso corporeo 0,007 mL/g. La gamma ottimale per questa procedura è 0,006 a 0,008 mL/g di peso corporeo. Tuttavia, dopo 4 min, se il mouse è ancora a piedi o che esibiscono i movimenti a scatti, consultare il veterinario istituzionale per aumentare opportunamente la dose di anestetico.</li>
	<li>Determinare la dose di Pilocarpina per il mouse utilizzando la tabella 1 e iniettare la giusta quantità per via intraperitoneale. Impostare il timer per 2 min e inserire il tubo di guida 50 mL il mouse fino a quando la testa e le orecchie bastone fuori alla fine taglio. Posizionare il tubo ad un angolo di 45 gradi, con la testa in giù e la superficie ventrale rivolta verso l'alto. Nastro il tubo alla scheda procedura per impediscono di muoversi. Nota: La tabella 1 fornisce il dosaggio per topi più di 17 g, come questa procedura non è stata tentata su topi pesatura sotto 17 g.</li>
	<li>Alla fine di 2 min, delicatamente inserire un paio di micro forcipe di dissezione in bocca chiusi e sollevare la mascella inferiore verso l'alto per aprire la bocca. Spingere il forcipe 1-2mm ulteriormente nella bocca, assicurandosi che la linguetta è visto che riposa sul braccio superiore della pinza. Con un altro paio di una pinzetta, tenere il tampone asciutto pre-pesato vicino alla sua punta conica.</li>
	<li>Far scorrere delicatamente la punta conica del tampone in bocca. Ritirare il forcipe, lasciando la punta del tampone nella cavità orale.</li>
	<li>Afferrare l'estremità più larga del tampone che si estende di fuori della bocca e ruotarlo per consentire la massima superficie di contatto con la bocca. Tenere il tampone in questa posizione per 15 min. Nota: Questo assicura che il tampone rimane in bocca per tutta la durata della raccolta. Nota che la punta conica del tampone funge da uno stoppino e la parte più ampia del tampone rimane fuori della bocca.</li>
	<li>Alla fine di 15 min, delicatamente ruotare il tampone per raccogliere qualsiasi saliva che non è stata assorbita e inserire il tampone bagnato nel tubo microfuge 0,6 mL. Tappare la provetta e impostarlo nel tubo 2ml posizionato su ghiaccio. Nota: In questo momento, la mucosa orale apparirà completamente asciutto. Il mouse può ora essere spostato indietro nella sua gabbia per il recupero dall'anestesia.</li>
	<li>Trasferire il mouse nella gabbia. Posto inumidito pellet cibo nella gabbia dopo il prelievo della saliva per aiutare più veloce reidratazione. Nota: I topi si sveglia entro 10 min dopo la fine della raccolta. L'iniezione sottocutanea di 0,2 mL di soluzione salina isotonica pre-riscaldato può anche essere somministrato per accelerare il recupero.</li>
	<li>Procedere al prossimo mouse. Tutti i topi devono essere monitorati fino a quando completamente hanno recuperato e sono ambulatoria.</li>
</ol>3. misurazioni
<ol><li>Alla fine di tutte le collezioni, pesare i tubi di 0,6 mL con il tampone bagnato. Calcolare la differenza tra il peso bagnato e il peso a secco per ottenere il peso della saliva prodotta. Posizionare il tubo di 0,6 mL con la saliva nuovamente dentro il tubo di 2 mL.</li>
	<li>Tagliare i tappi delle provette 2 ml. Quindi, centrifugare le provette 2 mL per 2 min a 7500 x g, a 4oC in una centrifuga micro per recuperare la saliva. Misurare il volume di saliva ottenuto utilizzando una micropipetta.</li>
	<li>Esprimere i risultati come saliva peso (mg)10 oltre 15 min o come un rapporto tra peso saliva (mg) / mouse peso corporeo (g). Nota: Se il volume di saliva estratta fuori il tampone è stato misurato, esprimere i risultati come il volume di saliva recuperato (mL) o il rapporto di saliva volume (mL) / mouse peso corporeo (g).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proctor, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+salivary+secretion.">The physiology of salivary secretion.</a> Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).</li><li>Fox, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sj&#246;gren's+syndrome.">Sj&#246;gren's syndrome.</a> Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).</li><li>Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+innate+immunity+and+Ro52-induced+antibody+causes+Sj&#246;gren's+syndrome-like+disorder+in+mice.">Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sj&#246;gren's syndrome-like disorder in mice.</a> Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).</li><li>Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca J&#250;nior, L., Renzi, A., Menani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+muscarinic+receptors+signal+pilocarpine-induced+salivation.">Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation.</a> J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).</li><li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+elevation+and+secretion+of+interleukin-1beta+in+the+submandibular+gland+of+male+mice.">Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice.</a> Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).</li><li>Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+isoflurane+anesthesia+and+pilocarpine+on+rat+parotid+saliva+flow.">Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow.</a> Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).</li><li>Kohrs, R., Durieux, M. 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Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

La produzione di saliva è un processo complesso ed è influenzata da molti fattori. Di conseguenza, la funzione della ghiandola salivaria in animali da laboratorio di misura può essere una sfida. Un'ulteriore sfida è che le misurazioni ripetute della funzione della ghiandola salivaria nello stesso animale sono necessari per stabilire l'inizio della malattia o per dimostrare il recupero dopo il trattamento.
Il metodo tampone descritto in questo rapporto è tecnicamente semplice da eseguire con diverse opzioni per rappresentare i dati. I risultati ottenuti sono riproducibili, con poca variazione inter-operatore. Il metodo in grado di rilevare una riduzione nella produzione di saliva nei modelli differenti di disfunzione della ghiandola salivaria. Un vantaggio significativo è l'uso di polimeri inerti, altamente assorbente e recupero efficiente della saliva raccolta, consentendo la misurazione di biomolecole salivare. Un altro vantaggio di questo metodo è che è possibile eseguire questa procedura simultaneamente nei topi fino a 2 alla volta da un singolo operatore. Questo è significativamente più efficace rispetto ad alcuni degli altri metodi, dove viene eseguita in un singolo mouse alla volta.
La variabilità nelle misurazioni di produzione di saliva sono stati la rovina di tutte le tecniche di misurazione di saliva. Per ridurre al minimo la variabilità, è importante seguire scrupolosamente il protocollo. Fasi critiche includono: selezionando la stessa ora del giorno per digiuno i topi e la raccolta della saliva, del caso di dosaggio di anestetico e pilocarpina (tabella 1) e accuratamente il peso record di tamponi di asciutti e bagnati. Gestione del tempo attenta è necessaria per impostare fino a 2 topi in un momento per la raccolta della saliva.
Come mostrato nella Figura 3, la quantità di saliva prodotta da topi è ceppo dipendente. Così, del caso ceppo, età e sesso abbinati topi dovrebbero essere utilizzati come controlli. Titolazione del dosaggio pilocarpina, per il ceppo specifico e la condizione sperimentale indagato, è altamente raccomandato. Sebbene una dose maggiore di Pilocarpina oltre 0,5 mg/kg induce aumento della produzione di saliva, di valutare ipofunzione ghiandolare, si consiglia di utilizzare una dose più bassa. Questo permette l'identificazione anche lievi differenze nella produzione di saliva tra il malato e topi di controllo. Dosi di 0,5 mg/kg di peso corporeo e 0,375 mg/kg di peso corporeo sono state utilizzate con successo per dimostrare ipofunzione della ghiandola salivaria. Tuttavia, dovrebbe essere notato che alcuni sistemi di modello sperimentale possono richiedere più o meno lunghi periodi di raccolta rispetto a quanto descritto in questo protocollo. Questo dovrebbe essere testato da ciascun laboratorio.
Una limitazione di questo metodo e la maggior parte dei metodi di misurazione di saliva è la necessità di anestesia. La relazione con il metodo sottovuoto non include l'uso di anestetico5. Tuttavia, l'assenza di anestesia induce diversi livelli di ansia nei topi. Essi tendono a lottare e mordere il tubo, e che a sua volta, può influenzare l'efficienza di produzione e raccolta di saliva. Isoflurano anestesia in ratti induce un drop-in Pilocarpina indotto saliva produzione12. Al contrario, la ketamina aumenta le secrezioni bronchiali e salivari attraverso stimolazione simpatica13. Noi ed altri abbiamo utilizzato con successo la chetamina e xilazina miscela come anestetico per la misurazione di Pilocarpina indotto saliva produzione4,7,8,9. L'intervallo consigliato per l'anestesia chirurgica è 100-200 mg/kg di ketamina e 5-16 mg/kg di xilazina14. La dose di 0,008 0,006 mL/peso corporeo di g utilizzato in questo metodo (corrisponde a 60-80 mg/kg di ketamina e 6-8 mg/kg di xilazina) cade nell'estremità inferiore dell'intervallo consigliato ed è sufficiente per fornire un livello coerente di immobilizzazione senza anestesia profonda .
Il metodo tampone nasce come un'alternativa al metodo micropipetta ordinariamente usato. Lo svantaggio principale del metodo pipetta è stata l'elevata variabilità inter-operatore e la necessità di raccogliere saliva da uno mouse alla volta. Il metodo tampone risolve entrambi questi problemi. I vantaggi includono la limitazione del numero di animali necessari per raggiungere il potere in analisi statistiche e maggiore efficienza. Sostituzione tamponi di cotone con tamponi di polimero inerte offrono un'opzione migliore poiché tamponi di cotone sono conosciuti per urtare la quantificazione di molecole biologicamente attive15.
Data la semplicità del metodo tampone e la sua elevata riproducibilità tra diversi individui, si spera che il metodo tampone faciliterà meglio comparazioni di modelli murini tra istituzioni e ricercatori in diversi laboratori.

Le ghiandole salivari producono la saliva in risposta ad una varietà di stimoli neurologici e meccaniche1. Gli stimoli sono trasportati attraverso il sistema nervoso simpatico e parasimpatico ai recettori adrenergici e colinergici nella ghiandola. Pilocarpina è un agente colinergico, para-simpaticomimetici che agisce prevalentemente sui recettori muscarinici. Nella ghiandola salivaria, induce la produzione di saliva, agendo sui recettori muscarinici M31. Produzione di saliva dopo somministrazione di Pilocarpina è un indicatore della capacità di rispondere alla stimolazione delle ghiandole salivarie ed è comunemente usata come misura della funzione della ghiandola salivaria.
Misurazione precisa della produzione di saliva è fondamentale nello studio delle malattie della ghiandola salivare, tra cui la sindrome di Sjögren2 e ferita di radiazione che segue la testa e del collo cancro trattamento3. Diversi metodi sono stati sviluppati per misurare la produzione di saliva nei roditori. Questi includono diretto inserimento di una canula del dotto escretore salivario4, la raccolta di saliva dalla cavità orale sotto vuoto5e insieme utilizzando vetro capillari6 o una micropipetta7,8, 9. dirigere l'incannulamento del dotto salivare fornisce saliva più accurata e pura. Tuttavia, questa è una procedura tecnicamente impegnativa e il potenziale per causare lesioni ductal preclude collezioni ripetitivo saliva dall'animale stesso. Raccolta della saliva sotto vuoto può portare a risultati variabili dovuto essiccamento della saliva dal tubo. Questa perdita è esagerata ulteriormente in topi con ridotta salivazione. Tubi capillari in vetro permettono la raccolta di saliva per analisi successive, tuttavia, cambiamenti nella viscosità della saliva secreta nello stato malato previene efficiente riempimento del capillare. Inoltre, tentativi di spazzare la cavità orale per raccogliere i residui della saliva possono provocare lesioni. Il metodo di dispensare consente per la collezione completa, e per lo stesso operatore, è notevolmente coerente tra esperimenti. Tuttavia, per ragioni sconosciute, questo metodo Mostra una variazione significativa tra operatori diversi. Pertanto, per consentire paragoni adeguati, diventa imperativo che l'operatore stesso esegue tutti gli esperimenti relazionati a un progetto specifico. Chiaramente, questo rappresenta un grande svantaggio per un laboratorio.
Per superare questi problemi, è stata sviluppata una procedura che combina saliva raccolta metodi usati per gli esseri umani e roditori. Il metodo tampone, descritto di seguito per misurare il volume di saliva indotti da pilocarpina è semplice, riproducibile, non influenzato da parte dell'operatore e può essere eseguito più volte nello stesso animale. Inoltre, permette la raccolta di saliva per successive analisi di proteine, immunoglobuline o altre biomolecole.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals for saliva collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pilocarpine hydrochloride</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td><td>B21410</td><td>Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anesthesia Mix solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.</td></tr><tr><td>Zetamine (Ketamine hydrochloride)</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>C3N VT1</td><td>Stock is 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Anased (Xylazine)</td><td>Med-Vet International, Mettawa, IL, USA</td><td>RXANASED-20</td><td>Stock is 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Isotonic sterile saline</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>501032</td><td>Used as diluent</td></tr><tr><td>Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment)</td><td>Henry Schien, Dublin, OH, USA</td><td>48272</td><td>Used to prevent eyes from drying during the procedure</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials for saliva collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalivaBio Children&#039;s swab</td><td>Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA</td><td>N/A</td><td>Individually wrapped swabs</td></tr><tr><td>50 mL polypropylene tubes</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89004-364</td><td>Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 0.6 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-290</td><td>Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringes with permanently attached needles</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge regular bevel needles</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Sterile scalpel blade #11</td><td>Integra York Inc PA, USA</td><td>4-311</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting forceps</td><td>Roboz, Gaithersburg, MD, USA</td><td>RS-5139</td><td>Serrated angular 0.8 mm tip, 4&quot; length</td></tr><tr><td>Label tape</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA</td><td>sc-224487</td><td></td></tr><tr><td>3 channel timer</td><td>Amazon.com, Seattle, WA, USA</td><td>B06W2KCYVN</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo, Columbus OH, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Invivogen, San Deigo, CA, USA</td><td>tlrl-b5lps</td><td>Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip</td></tr><tr><td>Imject Alum adjuvant</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td>Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Ro52 antiserum</td><td>Generated in lab</td><td></td><td>Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals/ Kits for saliva analyses&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary lysozyme estimation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnzChek Lysozyme Assay Kit</td><td>Molecular Probes, Eugene, OR, USA</td><td>E-22013</td><td>Used as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary IgA estimation by sandwich ELISA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgA</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>0106-01</td><td>Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL</td></tr><tr><td>Goat anti- mouse IgA unlabeled</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-01</td><td>Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer</td></tr><tr><td>Goat anti- mouse IgA HRP</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-05</td><td>Detection antibody used at 1:4000 dilution</td></tr><tr><td>TMB substrate</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>555214</td><td>Used as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates</td><td>Thermo Scientific, Rochester, NY, USA</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Salivary protein estimation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>BioRad, Hercules, CA, USA</td><td>5000006</td><td>For protein estimation as per manufacturer&#039;s instructions</td></tr></tbody></table>

a method for the measurement of salivary gland function in mice

I pazienti con la sindrome di Sjögren, una malattia autoimmune che interessa le ghiandole esocrine, sviluppano l'infiammazione della ghiandola salivaria e hanno ridotto la produzione di saliva. Analogamente, la produzione di saliva è gravemente compromesso in pazienti che ricevono radioterapia per i tumori testa e collo. Modelli del roditore, sviluppati per simulare queste condizioni cliniche, facilitano la comprensione della patogenesi della malattia e consentono lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Pertanto, la capacità di accurata, riproducibile e ripetutamente misurare la funzione della ghiandola salivaria in modelli animali è fondamentale. Sulla base di procedure precedentemente descritte in letteratura, è stato sviluppato un metodo che soddisfa questi criteri ed è stato usato per valutare la funzione della ghiandola salivaria in topi. Un ulteriore vantaggio di questo nuovo metodo è che è facilmente imparato e ha poca variazione inter-operatore. Funzione della ghiandola salivaria è valutata come la quantità (peso o volume) o velocità (mL/min) di saliva prodotta in risposta alla stimolazione di pilocarpina. La saliva raccolta è una buona fonte per le analisi del contenuto proteico, le concentrazioni nell'immunoglobulina e altre biomolecole.

Nei sistemi modello sperimentale del topo, la capacità di produrre saliva in risposta alla stimolazione di Pilocarpina è usata come un indicatore della funzione della ghiandola salivaria. La produzione di saliva è stata misurata in 11-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6 il metodo tampone. In Figura 1A, i risultati sono espressi come la quantità di saliva (mg) raccolta seguendo le dosi aumentanti di pilocarpina. Alla dose di 1 mg/kg di peso corporeo, alcuni dei topi iniziato a esporre afflizione (agitazione e brividi involontari). Quindi le dosi elevate di pilocarpina, oltre 1 mg/kg di peso corporeo non sono state testate in questo studio. In Figura 1B, i risultati vengono rappresentati come il rapporto tra peso saliva (mg) per il peso del corpo del mouse (g). Collettivamente, questi dati mostrano una relazione di risposta buona dose tra la produzione di quantità e saliva di pilocarpina. Inoltre è stato misurato il volume di recuperato dal tampone di saliva. Come illustrato nella Figura 1, c'è una notevole concordanza tra saliva peso e volume cui 1mg di saliva è uguale a 0,001 mL.
I risultati ottenuti con il metodo tampone sono simili a quelli ottenuti con il metodo di raccolta di pipetta. La Figura 2A Mostra che la quantità media di saliva raccolta dal metodo tampone e il metodo di dispensare è molto simile e le differenze sono statisticamente non significative. Figura 2B 2C e 2D mostrano che il metodo tampone non ha impatto stima di biomolecole nella saliva. Infatti, in confronto con il metodo della pipetta, il metodo tampone ha evidenziato un andamento totale superiore nei livelli medi di proteine salivari totali (Figura 2), attività del lisozima salivare (Figura 2D) e IgA salivario (Figura 2E). Tuttavia, queste differenze erano statisticamente non significative.
Il metodo di raccolta della saliva qui descritto è in grado di rilevare le differenze nella quantità di saliva prodotta da ceppi di topi diversi (Figura 3) e ipofunzione della ghiandola salivaria indotto da condizioni differenti di malattia (Figura 4). Figura 3A Mostra risultati di produzione di saliva di Pilocarpina indotta da 10-12-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6, BALB/c, DBA1/J e 129S6. I topi di 129S6 prodotto la quantità minima di saliva rispetto agli altri ceppi. Si deve osservare che le differenze nei pesi corpo di questi topi non erano significativamente differenti (Figura 3B). Successivamente, il metodo tampone è stato utilizzato per rilevare ipofunzione della ghiandola salivaria e due esempi sono mostrati in Figura 4. Figura 4A Mostra un risultato rappresentativo di ipofunzione della ghiandola salivaria indotta dall'attivazione dell'immunità innata che segue l'iniezione del lipopolysaccharide (LPS) (10 µ g/mouse, intraperitonealmente). Topi di controllo sono stati iniettati con salino11. LPS-trattati topi mostrano un calo significativo nella saliva rispetto ai controlli. Il trasferimento passivo di anticorpi che reagiscono con l'antigene di sindrome di Sjögren A/Ro52 induce ipofunzione della ghiandola salivaria, e questo modello simula alcuni aspetti della sindrome di Sjögren9. Come mostrato in Figura 4B, topi iniettati con l'allume adiuvante più anticorpi anti-Ro52 insieme erano significativamente più bassa produzione di saliva, rispetto ai topi non trattati o di topi trattati solo con l'allume.
Il metodo tampone è semplice da implementare e operatore indipendente. La figura 5 Mostra la produzione di saliva da topi C57BL/6 femmina 10-13-settimana-vecchio, in esperimenti effettuati in 6 diversi momenti da 2 operatori diversi. Operatore ho iniziato con solo 2 mesi di esperienza di gestione mentre operatore II aveva 6 mesi di esperienza di gestione preventiva del mouse, ma è stata introdotta soltanto per il metodo di raccolta della saliva per una settimana del mouse. Questi dati sono stati generati in esperimenti condotti da quasi un anno di distanza, utilizzando la dose di Pilocarpina 0,375 mg/kg. I rapporti di saliva ottenuti da entrambi gli operatori mostrano una gamma di letture (1,84 a 5,87). Operatore esperimenti di ho attraversato un periodo di 10 settimane mentre esperimenti di operatore II sono stati effettuati oltre 3 giorni consecutivi quasi un anno più successivamente (Figura 5A). In particolare, i rapporti di saliva ottenuti nel corso del tempo non erano significativamente differenti (p = 0.064; Test di Kruskal-Wallis). Per confrontare ulteriori variazioni inter-operatore, i rapporti di peso saliva al peso corporeo di g da 3 esperimenti per ogni operatore sono stati riuniti e sono mostrati in figura 5B. Rapporti di saliva ottenuti dall'operatore ho (media + SEM; 4,45 + 0,152, n = 38) non siano significativamente diverse da operatore 2 (media + SEM; 4,21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 test Mann Whitney).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig1.jpg"> Figura 1: la produzione di Saliva è dipendente dalla dose di pilocarpina. Topi C57BL6/J (11-settimana-vecchio femmine, 5 per gruppo) sono stati iniettati con differenti dosi di pilocarpina (0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg e 1,0 mg/kg di peso corporeo) e la produzione di saliva è stata misurata per 15 min (A) risultati sono rappresentati come quantità di saliva di mg (media ± SEM). (B) i dati sono rappresentati come rapporto medio della saliva (saliva mg per peso corporeo di g del mouse). (C) Saliva da 11-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6 (n = 5) è stato raccolto dal metodo tampone. Pilocarpina è stata utilizzata ad una dose di 0,375 mg/kg di peso corporeo. I tamponi bagnati sono stati pesati per misurare la quantità di saliva prodotta in mg. La saliva nei tamponi quindi è stata recuperata per centrifugazione, e i volumi della saliva recuperato sono stati misurati. L'accordo significativo è visto tra il peso saliva nel volume mg e saliva in µ l. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig2.jpg"> Figura 2: il metodo tampone non riguarda l'analisi di biomolecole nella saliva. Saliva da 2 gruppi di 11-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6, (n = 5 topi per gruppo), è stato raccolto il metodo tampone oppure dal metodo micropipetta. Le differenze nei volumi di saliva (A), media quantità di proteine (B), significano quantità di attività del lisozima (C) e significano quantità di IgA fra i 2 gruppi sono statisticamente non significativi. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig3.jpg"> Figura 3: il metodo tampone della saliva raccolta rileva differenze nella linea di base della produzione di saliva da diversi ceppi di topi. (A) Saliva da topi femmine (10-12-week-old) sono stati raccolti per 15 min usando una dose di pilocarpina di 0,375 mg/kg di peso corporeo. (B) i pesi corporeo medio tra i gruppi di topi non erano significativamente differenti. Significatività statistica è stata analizzata da Kruskal-Wallis test, seguito da Dunn di test comparazioni multiple. Una p < 0.05 è stato considerato significativo. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig4.jpg"> Figura 4: metodo tampone rileva ipofunzione della ghiandola salivaria. (A) (X B6 A / J) topi femminili F1 sono stati iniettati con entrambe le soluzioni LPS (0,1 mg/mL, 0,1 mL per topo, intraperitonealmente) o soluzione fisiologica e la saliva è stata misurata 26 ore più tardi. Un esperimento rappresentanza Mostra un significativo (p = 0.0079) goccia (60%) nella produzione di saliva nei topi trattati con LPS. (B) ipofunzione della ghiandola salivaria è stata misurata in un sistema di modello sperimentale del topo per la sindrome di Sjögren. Il modello di trasferimento passivo precedentemente pubblicati per induzione di disfunzione ghiandolare è stato usato4 con alcune modifiche. Topi femminili C57BL/6 (10-12 settimane) sono stati iniettati con adiuvante di allume. Nei giorni 14 e 20 topi sono stati iniettati con 0,05 mL di siero di coniglio anti-Ro52 e la produzione di saliva è stata misurata dopo 24 h. notare un significativo (p = 0,0003) goccia (50%) nella produzione di saliva nei topi trattati con allume e anti-Ro52 siero. Significatività statistica è stata analizzata da Kruskal-Wallis test, seguito da Dunn di test comparazioni multiple. Una p < 0.05 è stato considerato significativo. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig5.jpg"> Figura 5: il metodo tampone produce risultati riproducibili nel tempo (A) e tra gli operatori (B). Il metodo tampone Mostra risultati comparabili tra due operatori con diverse lunghezze di esperienza negli esperimenti effettuati in un anno di gestione del mouse. La produzione della saliva basale in topi femminili C57BL/6 (10-13 settimane di età) è stata misurata da ogni operatore. Risultati sono espressi come peso di saliva prodotta (peso corporeo di mg/g). Le date di raccolta della saliva sono sull'asse x e i risultati dai dati raccolti nel corso del tempo sono riportati (A). Ogni punto dati rappresenta un mouse, e il numero di topi analizzati in ogni momento è indicato tra parentesi. Rapporti di saliva basale (media + SEM) riuniti da 3 esperimenti sono mostrati (B)e non siano significativamente diversi tra gli operatori. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57203/57203fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Ipofunzione della ghiandola salivaria è una frequente conseguenza di autoimmune malattia e radioterapia. Riproducibile valutazione della funzione della ghiandola salivaria in modelli murini di queste malattie è una sfida tecnica. Qui, è descritto un metodo semplice per la misurazione accurata e riproducibile della produzione di saliva nei topi.

Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.4K Views.  Oklahoma Medical Research Foundation. Ipofunzione della ghiandola salivaria è una frequente conseguenza di autoimmune malattia e radioterapia. Riproducibile valutazione della funzione della ghiandola salivaria in modelli murini di queste malattie è una sfida tecnica. Qui, è descritto un metodo semplice per la misurazione accurata e riproducibile della produzione di saliva nei topi.

Video: A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their head and neck regions for cancer treatment. Both groups of patients experience symptoms such as xerostomia (dry mouth), dysphagia 
(impaired chewing and swallowing), severe dental caries, altered taste, oro-pharyngeal infections (candidiasis), mucositis, pain and discomfort.
One innovative approach of regenerative medicine for the treatment of salivary gland hypo-function is speculated in RS Redman, E Mezey 
et al. 2009: stem cells can be directly deposited by cannulation into the gland as a potent method in reviving the functions of the impaired organ. Presumably, 
the migrated foreign stem cells will differentiate into glandular cells to function as part of the host salivary gland. Also, this cannulation technique is an 
expedient and effective delivery method for clinical gene transfer application.
Here we illustrate the steps involved in performing the cannulation procedure on the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct 
(Fig 1). C3H mice (Charles River, Montreal, QC, Canada) are used for this experiment, which have been kept under clean conventional conditions at 
the McGill University animal resource center. All experiments have been approved by the University Animal Care Committee and were in accordance with the 
guidelines of the Canadian Council on Animal Care.
For this experiment, a trypan blue solution is infused into the gland through the opening of the Wharton's duct using a 
insulin syringe with a 29-gauge needle encased inside a polyethylene tube. Subsequently, the mouse is dissected to show that the infusions migrated 
into the gland successfully.

A protocol for the cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct is described. For this experiment, the trypan blue solution is used as a dyer to demonstrate how this technique effectively delivers infusions into the targeted gland, and to suggest the reliability of this new approach as a potential clinical drug/cell therapy for the regeneration of salivary glands.

Incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il Duct Wharton

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

Ricerca

Medicina

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Biologia

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Valutazione dello Sviluppo ghiandola mammaria e funzione in modelli murini

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Preparazione della ghiandola salivare sottomandibolare murino per microscopia Intravital verticale

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Immunologia e infezioni

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

Isolamento delle cellule epiteliali salivari dalle ghiandole salivari umane per la crescita in vitro come Salispheres o Monostrati

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In these cases, questions remain regarding disease pathogenesis and effective interventions. An optimized technique that allows functional assessment of the salivary glands is invaluable for investigating exocrine gland biology, dysfunction, and therapeutics. Here, we present a step by step approach to performing pilocarpine stimulated saliva secretion, including tracheostomy and the dissection of the three major murine salivary glands. We also detail the appropriate murine head and neck anatomy accessed during these techniques. This approach is scalable, allowing for multiple mice to be processed simultaneously, thus improving the efficiency of the work flow. We aim to improve the reproducibility of these methods, each of which has further applications within the field. In addition to saliva collection, we discuss metrics for quantifying and normalizing functional capacity of these tissues. Representative data are included from submandibular glands with depressed salivary gland function 2 weeks following fractionated radiation (4 doses of 6.85 Gy).

We present a detailed approach to performing saliva collection, including murine tracheostomy and the isolation of three major salivary glands.

Valutazione funzionale salivare murina attraverso dopo stimolazione Pilocarpina frazionato radiazione

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging in tempo reale della rigenerazione della ghiandola sottomandibolare del topo

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

Autore in primo piano: Studio delle interazioni tra macrofagi e cellule epiteliali nella rigenerazione delle ghiandole salivari dopo un infortunio 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...

Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il Duct Wharton

Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Valutazione dello Sviluppo ghiandola mammaria e funzione in modelli murini

Preparazione della ghiandola salivare sottomandibolare murino per microscopia Intravital verticale

Isolamento delle cellule epiteliali salivari dalle ghiandole salivari umane per la crescita in vitro come Salispheres o Monostrati

Valutazione funzionale salivare murina attraverso dopo stimolazione Pilocarpina frazionato radiazione

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine fluorescenti

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

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Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

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Preparazione della ghiandola salivare sottomandibolare murino per microscopia Intravital verticale

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Valutazione funzionale salivare murina attraverso dopo stimolazione Pilocarpina frazionato radiazione

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

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