Name: visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices
Uploaded: 2018-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Humboldt-Universität zu Berlin, o centro de Bernstein para Berlim de neurociência computacional, o centro alemão para doenças neurodegenerativas (DZNE), o Ministério Federal alemão de educação e pesquisa (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure e a Gottfried Wilhelm Leibniz prêmio da DFG. Agradecemos Shimpei Ishiyama para design gráfico excelente e Juliane Diederichs para assistência técnica excelente.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes alemãs sobre o bem-estar animal, sob a supervisão das comissões de ética locais (LaGeSo). Humano e morcego cérebro dados foram derivados de Naumann et al 5 o procedimento a seguir é realizado em um rato de Wistar adulto macho (estirpe: RJHan:WI).
1. perfusão e extração do cérebro
Nota: A fim de obter um cérebro homogênea fixo e livre de sangue, transcardial perfusão do animal é altamente incentivado, como sangue residual aumenta o sinal de fundo inespecíficos durante coloração. No entanto, também é possível obter seções achatadas do espécime un-perfundido e manchá-las. A facilidade de manipulação da amostra varia com a concentração de fixador usado. Fixação muito pouco aumenta o risco de manipulação danos ao cérebro durante o nivelamento e corte, enquanto também altas concentrações menor a flexibilidade para o achatamento e a qualidade do sinal de coloração.
<ol><li>Transcardially perfundir o animal, usando uma agulha 23G. Para um guia mais detalhado, ver Gage et al 9<ol>
<li>Use fosfato reserva o da salina10 (PBS, 0,02 M, pH 7,4) para retirar o sangue do cérebro e do corpo do animal. Continue até o líquido de infusão aparece claro, pelo menos 150 mL de PBS sendo infundido através do sistema vascular. Nota: Os melhores resultados são obtidos com uma pressão semelhante à faixa da pressão arterial fisiológica do animal sendo perfundido (por exemplo, rato: 120-130 mmHg). Opcionalmente, adicione a solução para evitar a coagulação de sangue11heparina (10 U/mL).</li>
		<li>Para corrigir o cérebro, transcardially infundir um mínimo de 100 mL paraformaldeído12 (PFA, 4%; em fosfato 0,1 M de buffer (PB)13) até o pescoço do animal é duro. Cuidado: PFA é um potencial cancerígeno. Nota: Melhor para a atividade histoquímicas de coloração, tais como para citocromo oxidase, resultado, quando usando 2% PFA. Para outras manchas, tais como a imuno-histoquímica, 4% PFA é preferencial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraia o cérebro do crânio. Nota: Ver Gage et al 9 para mais detalhes.<ol>
<li>Isole a cabeça usando tesouras grandes ou tesouras do osso.</li>
		<li>Com uma boa tesoura, cortar a pele ao longo da linha mediana do pescoço ao nariz. Separe a pele para expor a caveira. Remova o pescoço e os músculos temporais usando tesouras bem.</li>
		<li>Faça uma linha média cortar através do osso interparietal a partir do forame magno até o osso parietal.</li>
		<li>Use ruginas para descascar o osso interparietal. Deslize a tesoura bem ao longo da sutura sagital e corte da extremidade posterior do parietal à extremidade anterior dos ossos frontal.</li>
		<li>Use ruginas para descascar o parietal e ossos frontais. Alternativamente, levante os ossos usando fórceps. Use uma colher para cortar cordas ventral do nervo e remover o cérebro. Transferi o cérebro para PB (0,1 M, pH 7,4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Consertar o cérebro un-perfundido por imersão em 4% PFA para 1-3 h a 4 ° C (dependendo do tamanho do cérebro e da sonda: musaranho: ~ 1h, humanos: ~ 3 h). Nota: Para grandes e gyrencephalic cérebros como os humanos, isolar e cortar a área de interesse para reduzir o tempo de fixação.</li>
	<li>Para obter maiores áreas corticais em uma seção, achatar o cérebro antes da pós-fixação mais; Prossiga para a etapa 2. No entanto, para obter as seções da mais difícil de alcançar áreas como o córtex entorhinal medial, fixar o cérebro em 4% PFA para 24h antes de prosseguir para a etapa 2.</li>
</ol>2. dissecção e achatamento do cérebro
<ol><li>Separe os hemisférios do cérebro usando uma lâmina de barbear (lissencephalic brains) ou bisturi (gyrencephalic brains). Nota: O cérebro não foi pós-fixado, se suscetíveis a danos por manipulação.</li>
	<li>Passo opcional para ajudar seção subsequente registo e encolhimento da estimativa:<ol>
<li>Perfure o córtex em uma área de juros, com uma agulha de 35G normal à superfície cortical. Repita a etapa duas vezes em distâncias definidas ao longo da folha cortical. Para determinar a distância ao longo da folha cortical, usar um segmento pré-cortado em um comprimento fixo (por exemplo, 5 mm) e coloque-o ao longo da superfície cortical para determinar pontos de punção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cérebros Lissencephalic: remover estruturas subcorticais, usando uma espátula de dissecação. Crítica: Manter o cérebro húmido com PB (0,1 M, pH 7,4) durante todo o processo.<ol>
<li>Segure o cérebro, pelo cerebelo e insira cuidadosamente a espátula para abrir um avião de dissecação no corpo caloso. A ponta redonda da espátula deve apontar longe do córtex.</li>
		<li>Deslize a espátula ainda mais e puxe suavemente até a espátula é entre o tálamo e o córtex. Estruturas subcorticais separadas com movimentos de coçar.</li>
		<li>Inspecione o hemisfério para a espessura do mesmo. Nota: Quaisquer regiões desiguais podem resultar em um gradiente de trans-camada durante o corte. Para o corte tangencial, use um bisturi para fazer um corte limpo através do cérebro, paralela à superfície pial da região da qual tangenciais seções são desejadas.</li>
		<li>Etapas opcionais para melhorar a qualidade do nivelamento:<ol>
<li>Faça um corte limpo através do corpo estriado, núcleo accumbens e córtex orbitofrontal, uma vez que eles aumentam a espessura do córtex na região lateral. Além disso, adicione um alívio corte na base da região interna do córtex pré-frontal, que permite o desdobramento das porções medial do córtex.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque o hemisfério (córtex virado para baixo) sobre uma lâmina de vidro. Prossiga para a etapa 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cérebros Gyrencephalic: remover matéria branca para desdobrar corticais (para protocolos detalhados, consulte: Sincich et al 14. o; Tootell e Silverman15). Crítica: Uso PB (0,1 M, pH 7,4) para manter o cérebro húmida em todos os tempos.<ol>
<li>Colocar a área de interesse em um papel de filtro úmido em um grande prato de Petri, com o córtex virada para cima.</li>
		<li>Remova a membrana aracnoide e da pia, usando duas pinças.</li>
		<li>Utilize um cotonete úmido e inserir suavemente em cada sulco para desanexar aderências entre corticais.</li>
		<li>Vire o cérebro usando outro papel de filtro úmido.</li>
		<li>Use duas espátulas micro curvas para desdobrar o único corticais. Use o lado convexo das espátulas para arreliar pedaços de matéria branca até chegar perto do lado côncavo de giro do. Utilize um cotonete úmido e proceder com turbilhão moções para alcançar o lado côncavo do giro do.</li>
		<li>Tease separados único corticais. Se necessário, adicione aliviando pequenos cortes se a tensão é muito alta.</li>
		<li>Achate o cérebro desdobrado na prato de Petri ou um recipiente similar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opcionalmente, coloque uma esponja coberta de papel de filtro, para garantir que as regiões não secar cérebros maiores.</li>
	<li>Coloque dois pedaços de laminados de barro em ambos os lados. Crítica: Como a espessura da argila define quanto o hemisfério pode ser achatado, certifique-se de que a argila é 10-20% mais fino que o córtex un-achatado.</li>
	<li>Pressione suavemente um segundo slide de vidro/pequeno prato de Petri no córtex até o hemisfério é totalmente plano. Para obter os melhores resultados para a região desejada, coloque a lâmina de vidro, primeiro, na área respectiva. Para obter os melhores resultados para cérebros lissencephalic, coloque a lâmina de vidro tangencialmente na porção lateral primeiro e aplicar pressão concentrada nesta região.</li>
	<li>Coloque um peso (por exemplo, um vidro de relógio de cerâmico) sobre a corrediças de vidro/Petri e achatar o hemisfério para 3-5 h a 4 ° C em PB.</li>
	<li>Para fixação de pós, liberar a pressão e retire as lâminas de vidro. Colocar o hemisfério achatado em PFA (livre flutuante) por 24 h num agitador a 4 ° C. Nota: Os melhores resultados para colorações histoquímicas atividade são alcançados quando usando 1% PFA. Para outras colorações, tais como a imuno-histoquímica, un-perfundidos oca, 2% PFA pode ser usado.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> Figura 1: representação esquemática do fluxo de trabalho para o achatamento de um hemisfério cortical de rato e visualização de módulos no córtex somatossensorial. Após a perfusão de transcardial, o cérebro de um rato foi dissecado (A). Estruturas subcorticais foram removidas e córtex foi aplainado entre duas lâminas de vidro em tampão fosfato (B). Hemisfério achatado (C) foi pós-fixado, tangencialmente seccionado e manchado para atividade de citocromo oxidase (D). Barras de escala = 1 cm. r: Rostral, Caudal de c:, l: Lateral, Medial m:. Figura adaptada de Lauer et al 23 <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. corte tangencial seções
Nota: Dependendo das exigências dos protocolos de coloração, o processo de corte e a espessura podem ser adaptados. Um vibratome foi usado para cortar os hemisférios para mais histochemical processamento (passo 3.2) em 80-150 µm. No entanto, para o processamento de imuno-histoquímica, seções mais finas são desejadas e um micrótomo de congelação foi usado para corte (passo 3.3), em 10-60 µm. Veja o vídeo 1.
<ol><li>Lave o hemisfério achatado em PB (0.1M; pH 7,4) por 15 min.</li>
	<li>Corte o hemisfério em uma vibratome.<ol>
<li>Lugar do hemisfério tangencialmente no suporte da corte. Opcionalmente, pressione novamente suavemente com uma lâmina de vidro antes de corrigi-lo em posição (por exemplo, com cola). Nota: Minimize a quantidade de cola utilizada, porque artefatos de corte podem resultar devido a pequena espessura dos hemisférios achatadas.</li>
		<li>Corte o hemisfério da extremidade mais grossa e mais estável no final mais fino (posterior para anterior, aqui) a densidade desejada. Prossiga para a etapa 3.4. Nota: Se foram utilizadas concentrações de baixa fixação, corte-o em uma velocidade lenta e uma grande amplitude.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corte o hemisfério em um micrótomo de congelação.<ol>
<li>Crioproteção o cérebro por imersão em uma solução de sacarose a 30% (em PB) até que ele afunda. Nota: Dependendo do tamanho do tecido a ser cryoprotected, afundando na solução pode variar de algumas horas a alguns dias. Para cérebros maiores podem ser considerados métodos alternativos de cryoprotection (ver. Alessandro et al 16).</li>
		<li>Forma um base sobre o micrótomo de congelação para montar o cérebro de gelo. Construa o base de gelo por congelamento PB na face do bloco do micrótomo de congelação. Crítica: Certifique-se que a superfície da base de gelo é paralela à lâmina do micrótomo. Para fazer isso, corte o gelo vazio base usando a lâmina micrótomo para alinhar exactamente a base de gelo paralela à superfície de corte.</li>
		<li>Incorporar o cérebro no meio de congelação e montá-lo no rosto de bloco do micrótomo com a área de interesse paralelo à face do bloco. Enfrenta a superfície pial do cérebro para a face do bloco do micrótomo. Crítica: Ajustar a temperatura de congelamento dependendo do tamanho da amostra; temperaturas mais altas assegurar melhor integridade de seção ao seccionamento, mas seções maiores exigem temperaturas mais baixas para congelar amostra uniformemente.</li>
		<li>Corte o cérebro tangencialmente a densidade desejada (velocidades de corte mais lento e uniforme resultam em melhor qualidade de seção).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave as seções em PB por 15 min em uma coqueteleira.</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> Vídeo 1: vídeo esquemático de corte tangencial de um córtex de rato entorhinal medial e o layout dos módulos parasubicular e entorhinal. O córtex entorhinal medial de um cérebro de roedor situa-se na extremidade posterior do córtex e se inclina para o lado medial e ventral. Tangenciais seções são obtidas por orientar uma faca ao longo deste ângulo. Por conseguinte, apropriado do tipo de célula coloração específica revela estruturas modulares no córtex entorhinal medial e parasubiculum adjacente. Vídeo adaptado do Ray e Brecht8. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>
4. visualização de módulos corticais usando coloração citocromo Oxidase
Nota: Protocolos de coloração diferentes foram desenvolvidos para histochemical deteção da atividade de citocromo oxidase, por exemplo, primeiro por Wong-Riley17 e mais tarde modificados por Divac et al 18 este protocolo é baseado de Divac et al 18, desde que o uso de sulfato de níquel-amónio (NiAS) resulta em um maior contraste e melhor módulos definidos em áreas corticais manchadas.
<ol><li>Preparar o citocromo oxidase coloração solução (ver Divac et al 18). para 10 mL da solução, adicionar: tampão de 10ml HEPES (0,1 M, pH 7,4), sacarose 400 mg, 12,5 mg NiAS, citocromo 2mg C, 6mg diaminobenzidina (DAB). Cuidado: DAB e NiAS são cancerígenos. Nota: Adicione DAB apenas antes da incubação das seções.</li>
	<li>Lave as seções em tampão HEPES (0,1 M, pH 7,4) num agitador por 15 min.</li>
	<li>Incube as seções na solução de coloração, à temperatura ambiente em um shaker. Nota: Observe a velocidade da coloração. Se não houver nenhuma reação visível, alterar a incubação a 37 ° C. Dependendo da quantidade de fixação, coloração pode ser observada após 10 min ou em várias horas.</li>
	<li>Pare a reação adicionando 4% PFA; Isso impede que re-morrendo indesejados e aumento do sinal de fundo.</li>
	<li>Lave as seções três vezes usando tampão HEPES por 10 min.</li>
	<li>Montar e secar as seções sobre lâminas de vidro.</li>
	<li>Desidrata-se as seções com uma linha crescente de álcool:<ol>
<li>Lave as lâminas em etanol a 60% por 1 min. Lave os slides em etanol a 80% por 1 min. lavar as lâminas em etanol a 96% para 2 min. lavar as lâminas em etanol 100% por 3 min. lavar as lâminas em isopropanol por 5 min. Lave os slides em xilol por 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imediatamente adicione um meio de endurecimento-montagem rápido e adicione uma lamela. Crítica: Não use meios de montagem à base de água, como NiAS vai ser lavado para fora e degradar a coloração.</li>
	<li>Manter as seções em 4 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
</ol>5. visualização de módulos corticais usando coloração imuno-histoquímica
Nota: Vários protocolos estão disponíveis para imuno-histoquímica, otimizado para a amostra e o tipo de sonda. Adaptações podem ser feitas conforme necessário, por diferentes concentrações de anticorpos, agentes permeabilizing e tempos de incubação. O protocolo seguinte leva a bons resultados para a detecção de uma grande variedade de anticorpos e visualização por sondas fluorescentes.
<ol><li>Lave as seções em PBS (0,1 M, pH 7,4) por 15 min.</li>
	<li>Opcional: Executar a recuperação do antígeno para desmascarar um epítopo usando um banho de água (baseado no Jiao et al 19. o; para métodos alternativos, consulte Pileri et al 20).<ol>
<li>Pré-aqueça o banho de água a 80 ° C. Preparar o tri-sódio citrato reserva19 (pH 8.0) e aqueça-o banho de água a 80 ° C.</li>
		<li>Transferi as seções para tampão de citrato de sódio-tri. Incubar as seções por 30 min a 80 ° C</li>
		<li>Fixe as seções até à temperatura</li>
		<li>Lave as seções em PBS por 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave as seções duas vezes em PBS-X (0,5% Triton-X, em PBS 0,1 M) por 15 min.</li>
	<li>Bloco epitopos inespecíficos incubando-se as seções em uma solução de albumina de soro bovino (BSA; 2,5%) e Triton-X (0,75%) em PBS por 2 h.</li>
	<li>Incubar as secções no anticorpo primário, por exemplo, muscular - D28k (1:5, 000, BSA 1% em PBS-X), por 2-3 dias num agitador a 4 ° C. Nota: A diluição ideal para o anticorpo primário depende o anticorpo específico usado. Consulte informações do fabricante para obter critérios de diluição de um anticorpo específico. Múltiplos anticorpos podem ser usados juntos, mas devem ser disparados contra diferentes espécies.</li>
	<li>Lave as seções três vezes em PBS por 15 min cada.</li>
	<li>Incube as secções pernoite no anticorpo secundário (1: 200, 1% de BSA em PBS) a 4 ° C, um agitador. Nota: Vários anticorpos secundários podem ser usados em diferentes espectros se vários anticorpos primários foram utilizados.</li>
	<li>Lave o anticorpo secundário lavando as seções três vezes em PBS por 10 min cada.</li>
	<li>Montar e secar as seções sobre uma lâmina de vidro para microscopia. Nota: As seções ainda devem estar úmidas antes de montar a lamela.</li>
	<li>Aplique meio de montagem adequado para fluorescência corantes sobre as seções de tecido e uma lamela.</li>
	<li>Seque as seções por 1h.</li>
	<li>Para armazenamento a longo prazo, selar a lamela usando esmaltes e manter no escuro a 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brodmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).</li><li>Naumann, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reptilian+brain.">The reptilian brain.</a> Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).</li><li>Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+columns,+modules,+and+domains+in+the+neocortex+of+primates.">Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).</li><li>Woolsey, T. A., Van der Loos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+layer+IV+in+the+somatosensory+region+(SI)+of+mouse+cerebral+cortex:+the+description+of+a+cortical+field+composed+of+discrete+cytoarchitectonic+units.">The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units.</a> Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).</li><li>Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+size+and+periodicity+of+pyramidal+patches+in+layer+2+of+medial/caudal+entorhinal+cortex.">Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex.</a> J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).</li><li>Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grid-layout+and+theta-modulation+of+layer+2+pyramidal+neurons+in+medial+entorhinal+cortex.">Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex.</a> Science. 343 (6173), 891-896 (2014).</li><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+oxidase:+an+endogenous+metabolic+marker+for+neuronal+activity.">Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity.</a> Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).</li><li>Ray, S., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+development+and+dorsoventral+maturation+of+the+medial+entorhinal+cortex.">Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex.</a> Elife. 5, e13343 (2016).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate-buffered+saline+(PBS).">Phosphate-buffered saline (PBS).</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).</li><li>Olson, S. T., Chuang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+activates+antithrombin+anticoagulant+function+by+generating+new+interaction+sites+(exosites)+for+blood+clotting+proteinases.">Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases.</a> Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+(PFA;+4%).">Paraformaldehyde (PFA; 4%).</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+phosphate+(PB).">Sodium phosphate (PB).</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).</li><li>Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+flatmounting+of+the+macaque+cerebral+cortex.">Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex.</a> Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).</li><li>Tootell, R. B., Silverman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+for+flat-mounting+cortical+tissue.">Two methods for flat-mounting cortical tissue.</a> J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).</li><li>Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryoprotection+method+that+facilitates+cutting+frozen+sections+of+whole+monkey+brains+for+histological+and+histochemical+processing+without+freezing+artifact.">A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact.</a> J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).</li><li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry.">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li><li>Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., L&#243;pez-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., M&#248;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+contrast+in+histochemical+detection+of+cytochrome+oxidase:+metallic+ions+protocol.">Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol.</a> J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+antigen+retrieval+method+for+free-floating+and+slide-mounted+tissue+sections.">A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections.</a> J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).</li><li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry:+comparison+of+different+methods.">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).</li><li>Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomical+studies+of+the+SmL+face+cortex+with+special+reference+to+the+occurrence+of+"barrels"+in+layer+IV.">Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV.</a> J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).</li><li>Krubitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+neocortex+in+mammals:+are+species+differences+really+so+different?.">The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different?.</a> Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).</li><li>Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+selected+size+differences+and+conserved+sexual+monomorphism+of+genital+cortex.">Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex.</a> J Comp Neurol. , (2017).</li><li>Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+bundles+of+dendrites+in+the+neocortex.">Vertical bundles of dendrites in the neocortex.</a> Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).</li><li>Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+trajectories+between+mouse+somatosensory+thalamus+and+cortex.">Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex.</a> J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).</li><li>Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+Modular+Microcircuits+of+the+Rat+Medial+Entorhinal+Cortex.">Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex.</a> Front Syst Neurosci. 11, (2017).</li><li>Livingstone, M. S., Hubel, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+inputs+to+cytochrome+oxidase-rich+regions+in+monkey+visual+cortex.">Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).</li><li>Land, P. W., Simons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+oxidase+staining+in+the+rat+SmI+barrel+cortex.">Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex.</a> J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).</li><li>Welker, C., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+layer+IV+in+the+somatosensory+neocortex+of+the+rat:+description+and+comparison+with+the+mouse.">Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse.</a> J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).</li><li>Retzius, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Cajal'schen+zellen+der+grosshirnrinde+beim+menschen+und+bei+s&#228;ugetieren.">Die Cajal'schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei s&#228;ugetieren.</a> Biol Unters. 5, 1-9 (1893).</li><li>Cajal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des vert&#233;br&#233;s. , (1911).</li><li>Chapin, J. K., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+body+representation+in+the+SI+cortex+of+anesthetized+and+awake+rats.">Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats.</a> J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).</li><li>L&#246;wel, S., Freeman, B., Singer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+the+orientation+column+system+in+large+flat-mounts+of+the+cat+visual+cortex:+A+2-deoxyglucose+study.">Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study.</a> J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+rat+parasubiculum.">Functional architecture of the rat parasubiculum.</a> J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).</li><li>Snyder, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Map projections--A working manual (Vol. 1395). , (1987).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li></ol>

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que poderia ser interpretado como um potencial conflito de interesses.

Modularidade no córtex cerebral foi identificada usando uma variedade de técnicas. Os primeiros estudos normalmente identificados cortical módulos ou visualizando célula regiões densas, ou uma ausência de fibras1. Utilizaram-se métodos subsequentes a presença de feixes dendríticas24, afferents de uma determinada região25, ou enriquecimento de neurotransmissores26. Aqui vamos demonstrar duas técnicas, coloração (ii) imuno-histoquímica e histoquímica de citocromo oxidase (i).
Citocromo oxidase mancha tem sido um dos métodos mais populares para visualizar módulos corticais e tem sido amplamente utilizada nos córtices sensoriais primários27,28. Ele visualiza módulos pela coloração mais escura para as áreas de maior atividade mitocondrial17, assim, agindo como um proxy para módulos anatômicos que eliciam respostas funcionais substanciais. Esse método tem sido usado para visualizar módulos corticais somatossensorial (Figura 2) e módulos corticais no córtex visual27.
Uma das desvantagens das técnicas histoquímicas tradicionais é que a sua visualização típica por microscopia de luz brilhante-campo limita o número de módulos que podem ser visualizadas simultaneamente. No entanto, métodos de imuno-histoquímica, em conjugação com sondas fluorescentes de visualização também podem ser utilizados para exibir as proteínas específicas e identificar módulos corticais. Por exemplo, talâmica afferents ao projeto de forma somatotopic córtices sensoriais. Assim, visualizando estes afferents, usando imunorreatividade VGluT2 pode também ser usado para visualizar os mapas do corpo no córtex somatossensorial primário que podemos ter visualizado usando a atividade de citocromo oxidase (Figura 2). Proteínas seletivas também podem ser usadas como marcadores celulares para identificar grupos de células geneticamente definidos. Usando a imuno-histoquímica, identificamos aglomerados de células piramidais no córtex entorhinal medial, expressando a proteína de ligação do cálcio, muscular6 (Figura 3) e determinou que os clusters de neste particular geneticamente determinado grupo de células são conservadas em toda evolução5, indicando os princípios comuns de microcircuito subjacente a sua função. Usando vários fluorophores, nós também delineados módulos complementares no córtex medial entorhinal26, demonstrando paralelos microcircuitos subjacentes a memória espacial.
Historicamente, o cérebro tem sido seccionado em um avião normal para a posição do corpo, em orientações sagitais, coronais ou horizontais. A identificação dos módulos corticais, como os campos de barril no córtex somatossensorial4 também solicitado a corte ao longo de um tangencial e, posteriormente, em preparações cortical achatadas29, embora fossem casos isolados de tal seccionamento observado muito anteriores30,31. Após a identificação do córtex barril, outros módulos corticais também foram identificados no córtex visual primário27, bem como a presença de um corpo completo mapa32 com uma representação somatotopic do corpo primário córtex somatossensorial. Seções achatadas do córtex visual de gato também revelaram a organização topográfica das colunas de orientação, sem a necessidade de reconstruções adicionais33. Modularidade cortical também tem sido demonstrada em córtices hipocampal, incluindo o presubiculum e parasubiculum26,34 e entorhinal medial córtex6. Achatamento tipicamente um objeto curvo induz distorções na topografia laminar - como pode ser observado pela multidão de projeções da superfície curvada da terra em um mapa plano35. Um método relativamente simplista para compensar parcialmente a essas distorções é com a introdução de pontos de referência em distâncias definidas antes de achatamento e então medir a distância entre eles após achatamento. Então estas marcas não só subserve em estimar quantitativamente distorções introduzidas pelo achatamento, mas também fornecem um ponto de referência fácil para alinhar as seções consecutivas. Mais aspectos cruciais para a preservação da fidelidade laminar incluem garantindo achatamento homogênea em toda a seção, e finalmente corte tangencial exatamente para o layout laminar para obter otimizado seções corticais laminares.
A visualização de módulos corticais nas seções tangenciais achatadas tem desempenhado um papel importante no revelando fascinantes relações estrutura-função no córtex cerebral. A representação topográfica das partes whisker e corpo no córtex somatossensorial primário e a presença de uma grade anatômica nos microcircuitos gerando células grade funcional nas seções corticais tangenciais achatadas revelar a intrincada microcircuitos detalhes que seriam difícil de compreender, de outras orientações. No entanto, nossas técnicas atuais fornecem apenas uma fatia bidimensional destes módulos essencialmente tridimensional. Usando técnicas de imunofluorescência e tecido limpando métodos36,37, seria possível visualizar estes módulos corticais como um todo e talvez revelar mais insights sobre nosso entendimento de mapas corticais e módulos.

Algumas das alterações mais significativas na estrutura do cérebro através de filogenia podem ser observadas no córtex cerebral. Apesar de diferenças significativas, o córtex dos animais segue um padrão comum e pode ser dividido em duas maneiras distintas, por camadas e áreas1. Camadas corticais mentem paralelas à superfície do cérebro e variam em número de 3 camadas em reptiliano córtices2 a 6 camadas em mamíferos córtices1. Áreas corticais, por outro lado, são regiões distintas do córtex, que em grande parte correspondem às funcionalidades distintas, por exemplo, o córtex somatossensorial está envolvido com a sensação de toque ou o córtex visual no processamento visuais entradas. Estas áreas corticais podem muitas vezes ser subdivididas em patches ou módulos3, que são regularmente repetindo estruturas anatômicas, encontradas essencialmente paralelas à superfície pial do cérebro. Módulos corticais podem ser confinados a uma determinada camada4ou estendem através de várias camadas5.
Métodos de corte padrão do cérebro envolvem seções normais à superfície do cérebro, como coronal ou sagital. Enquanto estes métodos podem ser usados para visualizar os módulos corticais, uma multiplicidade de características interessantes pode ser revelada quando os módulos corticais são visualizados tangencialmente, em um plano paralelo à superfície do cérebro. Por exemplo, módulos somatossensorial do cérebro de roedor representando bigodes, aparecem como barris quando visualizado normal à superfície do cérebro, e, portanto, as regiões derivam o córtex de barril de nome. No entanto, na visualização dos barris em uma orientação tangencial, eles revelam whisker-mapa, com os barris sendo colocados para fora em uma orientação topográfica espelhamento o layout dos bigodes na superfície externa do corpo. Em certos casos, o arranjo modular escapou mesmo deteção por períodos consideráveis, quando visualizado de forma não-tangencial. O córtex entorhinal medial, é conhecida pela presença de grade de células, neurônios que dispara em um padrão hexagonal regular quando um animal está atravessando um ambiente. Mesmo que seja uma área fortemente investigada, até recentemente, a presença de manchas ou módulos de células no córtex entorhinal medial, que fisicamente são dispostas em um padrão hexagonal6, tinha escapado a deteção. A presença e a disposição destes módulos, em cérebro de ratos, foi facilitada pela fazendo seções tangenciais do córtex entorhinal medial e investigar a cytoarchitecture de forma layer-wise.
Logo após o corte, o aspecto particular de visualização de módulos corticais também pode ser realizado de várias formas. Classicamente, os estudos foram delineados módulos baseados em célula densidade ou fibra layout1. Outra abordagem popular é o uso da histoquímica de citocromo oxidase, que revela as áreas de maior atividade8. Abordagens mais recentes incluem a olhar para os tipos de células geneticamente determinada, distinguidos-se com base em sua proteína expressão perfis6,8.
Neste estudo, destaca-se métodos para isolar o córtex do cérebro de mamíferos, obter secções tangenciais achatadas e Visualizar corticais módulos baseados em citocromo oxidase histoquímica e imuno-histoquímica das proteínas específicas do tipo de célula.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cytochrome oxidase staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c from equine heart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1827</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antigen retrieval&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td><td>Carl Roth</td><td>4984.3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>TRITON-X 100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunohistochemistry&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000347</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000340</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V, biotin free</td><td>Carl Roth</td><td>0163.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mounting or freezing media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (immunofluorescence)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt (histochemistry)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03989</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0696746</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Alcohol dehydration&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Carl Roth</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Carl Roth</td><td>P075.3</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752.4</td><td></td></tr><tr><td>Xylene substitute</td><td>Fluka</td><td>78475</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Devices/tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 650V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jung RM2035</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps - Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Bone Shears - 24 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>16150-24</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors - Large Loops</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Fine Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices

O córtex do cérebro dos mamíferos é parcellated em subestruturas distintas ou módulos. Módulos corticais normalmente mentem paralelos à folha cortical e podem ser delineados por certos métodos histoquímicos e imuno-histoquímica. Neste estudo, destaca-se um método para isolar o córtex do cérebro de mamíferos e achate-os para obter paralelo de seções para a folha de cortical. Nós ainda mais destaque selecionado histochemical e métodos de imuno-histoquímica para processar estas achatada tangenciais seções para visualizar módulos corticais. No córtex somatossensorial de vários mamíferos, realizamos a citocromo oxidase histoquímica para revelar o corpo mapas ou módulos corticais que representam diferentes partes do corpo do animal. No córtex entorhinal medial, uma área onde as células da grade são geradas, utilizamos métodos de imuno-histoquímica para destacar os módulos de neurônios geneticamente determinados, que estão dispostos em um padrão de grade na planilha de cortical através de várias espécies. No geral, nós fornecemos um quadro para isolar e preparar layer-wise achatado seções corticais e visualize corticais módulos usando histochemical e métodos de imuno-histoquímica em uma ampla variedade de cérebros de mamíferos.

Nós obtidos achatadas seções corticais do córtex somatossensorial em uma variedade de cérebros e processadas para citocromo oxidase histoquímica Visualizar os módulos de somatotopic que representam diferentes partes do corpo. Esta abordagem comparativa permite estudar as forças evolutivas que córtex de forma, por exemplo, mostrando a representação altamente conservada de vibrissae mystacial em roedores e lagomorfos como barris21 (Figura 2). Em contraste, outras partes do corpo como as patas e órgãos genitais mostram variações na sua parente tamanho e refletem a especialização para um nicho ecológico ou a seleção sexual22,23.
Para compreender a arquitetura do córtex entorhinal medial, obtivemos paralelo seções à superfície pial. Isto foi conseguido principalmente pela corte tangencial do córtex entorhinal medial em camundongos, ratos e morcegos egípcios. Em humanos, por causa do tamanho consideravelmente maior e mais ondulações no córtex entorhinal, nós achatada suavemente o córtex posterior fazendo um corte tangencial do córtex entorhinal. Posteriormente, todos os cérebros foram criopreservados e seccionados em um criostato a 60 µm. imuno-histoquímica foi realizada nas seções obtidas com um anticorpo antimuscular, para visualizar os módulos de célula piramidal muscular-positivo no entorhinal medial córtex5 (Figura 3). Os módulos-muscular no córtex entorhinal mostram uma notável periodicidade entre todos estes cérebros e variam em tamanho, por apenas um fator de 10 em ~ 20,000-fold variação no cérebro tamanhos5.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig2.jpg"> Figura 2: disposição topográfica dos módulos de córtex de barril em mamíferos identificados pelo citocromo oxidase histoquímica. Tangenciais seções de IV da camada do córtex somatossensorial do rato (A) gerbil da Mongólia (B), rato (C), Duarte (D), (E) hamster, coelho (F), mostrando barris como um somatotopic altamente conservada representação de vibrissae o mystacial. Escala de barras = 500 µm. m: Medial, Lateral l:, r: Rostral c: Caudal; Orientação na aplica-se também a B-E. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56992/56992fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig3.jpg"> Figura 3: layout periódica dos módulos do córtex entorhinal medial em mamíferos identificados por muscular imunorreatividade. Tangenciais seções da camada II do córtex entorhinal medial do rato (A), (B) rato, morcego egípcio (C) e (D) humana, mostrando um layout conservado periódico dos módulos de célula piramidal muscular-positivo. Escala de barras = 250 µm. m: Medial, Lateral l:, d: dorsais, ventrais v:, r: Rostral, c: Caudal; Orientação em D também se aplica a B, C. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56992/56992fig3large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Este artigo descreve uma metodologia detalhada para obter secções tangenciais achatadas de mamíferos córtices e Visualizar módulos corticais usando histochemical e métodos de imuno-histoquímica.

Visualização de módulos corticais em córtices mamíferos achatadas

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Neuroscience

12.7K visualizações.  Humboldt University of Berlin. Este artigo descreve uma metodologia detalhada para obter secções tangenciais achatadas de mamíferos córtices e Visualizar módulos corticais usando histochemical e métodos de imuno-histoquímica.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

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How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

Como medir o Folding Cortical partir de imagens de MR: um tutorial passo-a-Passo para Calcular Índice Gyrification local

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Medicina

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Comportamento

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Em Imaging vivo do Deep camadas corticais usando um Microprisma

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Biologia

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain

Source: Slater, B. J., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53067">Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2015)
The video demonstrates the preparation of colliculo-thalamocortical brain slices from mouse pup brains. An isolated brain is aligned on a marked slide and cut at an angle to align the auditory midbrain and forebrain in the same plane. The brain is then sliced using a vibratome, and the slices containing the major auditory midbrain and forebrain structures are transferred to a holding chamber for preservation.

Preparação de fatias colículo-talamocorticais de um cérebro de filhote de camundongo

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation for and Removal of ...