Name: visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices
Uploaded: 2018-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da Humboldt Universität zu Berlin, il Bernstein Center for Computational Neuroscience Berlino, il centro tedesco per Malattie Neurodegenerative (DZNE), il Ministero federale tedesco dell'istruzione e ricerca (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure e Gottfried Wilhelm Leibniz premio del DFG. Ringraziamo Shimpei Ishiyama per la progettazione grafica eccellente e Juliane Diederichs per l'eccellente assistenza tecnica.

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo le linee guida tedesche sul benessere degli animali sotto la supervisione dei comitati etici locali (LaGeSo). Umano e pipistrello cervello dati sono stati derivati da Naumann et al. 5 la procedura riportata di seguito viene eseguita su un ratto adulto maschio di Wistar (ceppo: RJHan:WI).
1. aspersione ed estrazione del cervello
Nota: Al fine di ottenere un cervello omogeneamente fisso e privo di sangue, perfusione perfusione dell'animale è fortemente incoraggiata, come residui di sangue aumenta il segnale di fondo non specifico durante la colorazione. Tuttavia, è anche possibile ottenere sezioni appiattite dall'ONU-irrorato esemplare e li macchia. La facilità di movimentazione del campione varia con la concentrazione di fissativo utilizzato. Troppo poco fissazione aumenta il rischio di gestione danni al cervello durante la spianatura e taglio, mentre troppo alte concentrazioni abbassare la flessibilità per l'appiattimento e la qualità del segnale colorazione.
<ol><li>Via irrorare l'animale, utilizzando un ago di 23G. Per una guida più dettagliata, vedere Gage et al. 9<ol>
<li>Utilizzare fosfato tampone salino10 (PBS; 0,02 M; pH 7.4) per scovare il sangue dal cervello e il corpo dell'animale. Continuare fino a quando il liquido di infusione appare chiaro, con almeno 150 mL di PBS viene infusa attraverso il sistema vascolare. Nota: I risultati migliori si ottengono ad una pressione simile all'intervallo della pressione sanguigna fisiologica dell'animale viene irrorato (ad es., ratto: 120-130 mmHg). Facoltativamente, aggiungere alla soluzione per evitare la coagulazione di sangue11eparina (10 U/mL).</li>
		<li>Per correggere il cervello, via infondere un minimo di 100 mL paraformaldeide12 (PFA, 4%; in fosfato 0,1 M di tampone (PB)13) fino a quando il collo dell'animale è rigido. Attenzione: PFA è un potenziale cancerogeno. Nota: Migliori risultati istochimici attività colorazione, ad esempio per la citocromo ossidasi, si ottengono, quando si utilizza 2% PFA. Per altro la macchiatura, come immunohistochemistry, 4% PFA è preferito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrarre il cervello dal cranio. Nota: Vedere Gage et al. 9 per i dettagli.<ol>
<li>Isolare la testa con le grandi forbici o cesoie dell'osso.</li>
		<li>Utilizzando le forbici bene, tagliare la pelle lungo la linea mediana dal collo al naso. Tirare la pelle per esporre il cranio. Rimuovere il collo e dei muscoli temporali utilizzando forbici bene.</li>
		<li>Rendere un midline tagliare attraverso l'osso interparietale a partire dal magnum di orifizio fino all'osso parietale.</li>
		<li>Utilizzare Pinze ossivore per staccare l'osso interparietale. Far scorrere bene forbici lungo la sutura sagittale e tagliare dalla parte posteriore del parietale all'estremità anteriore delle ossa frontali.</li>
		<li>Utilizzare Pinze ossivore per staccare parietali e ossa frontali. In alternativa, sollevare le ossa distanza usando il forcipe. Utilizzare un cucchiaio per tagliare le corde del nervo ventrale e rimuovere il cervello. Trasferire il cervello al PB (0,1 M; pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Difficoltà cervelli ONU-irrorati mediante immersione in 4% PFA per 1-3 h a 4 ° C (a seconda delle dimensioni del cervello e la sonda: toporagno: ~ 1h, umani: ~ 3 h). Nota: Per grandi e girencefalici cervelli come gli esseri umani, isolare e tagliare fuori la zona di interesse per ridurre i tempi di fissazione.</li>
	<li>Per ottenere più grandi aree corticali in una sezione, appiattire il cervello prima della post-fissazione ulteriore; procedere al passaggio 2. Tuttavia, per ottenere sezioni di più difficile da raggiungere aree come la corteccia di entorhinal mediale, post-fissare il cervello nel 4% PFA per 24 h prima di procedere al passaggio 2.</li>
</ol>2. dissezione e appiattimento del cervello
<ol><li>Separare gli emisferi del cervello utilizzando una lama di rasoio (lissencephalic cervelli) o bisturi (girencefalici cervelli). Nota: Se il cervello post-non è stato risolto, è suscettibile ai danni di movimentazione.</li>
	<li>Passaggio facoltativo per favoreggiamento stima di registrazione ed il restringimento di sezione successiva:<ol>
<li>La corteccia in un'area di non-interesse, la puntura con un ago di 35G normale alla superficie corticale. Ripetere il passaggio due volte alle distanze definite lungo il foglio corticale. Per determinare la distanza lungo il foglio corticale, utilizzare un thread pre-tagliato a lunghezza fissa (ad es., 5mm) e posarlo lungo la superficie corticale per determinare i punti di foratura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lissencephalic cervelli: rimuovere le strutture subcortical utilizzando una spatola per dissezione. Critico: Mantenere umido con PB (0,1 M; pH 7.4) durante l'intera procedura il cervello.<ol>
<li>Tenere il cervello dal cervelletto e inserire delicatamente la spatola per aprire un piano di dissezione in callosum del corpus. La punta rotonda di spatola dovrebbe puntare lontano la corteccia.</li>
		<li>Far scorrere la spatola ulteriormente e tirare delicatamente fino a quando la spatola è tra il talamo e la corteccia. Strutture subcortical separate con movimenti di graffiare.</li>
		<li>Ispezionare l'emisfero per anche lo spessore. Nota: Qualsiasi regioni irregolare potrebbero comportare un gradiente trans-strato durante il sezionamento. Per il sezionamento tangenziali, utilizzare un bisturi per fare un taglio pulito attraverso il cervello, parallela alla superficie pial della regione da cui sezioni tangenziali sono desiderati.</li>
		<li>Passaggi facoltativi per migliorare la qualità di conversione della trasparenza:<ol>
<li>Fare un taglio pulito attraverso il corpo striato, nucleo accumbens e nella corteccia orbitofrontal, poiché aumentano lo spessore della corteccia nella regione laterale. Inoltre, aggiungere un alleviamento taglio alla base della regione interna della corteccia prefrontale, che permette il dispiegarsi delle porzioni mediale della corteccia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Posizionare l'emisfero (corteccia rivolto verso il basso) su un vetrino. Procedere al punto 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Girencefalici cervelli: rimuovere la materia bianca a svolgersi i gyri (per protocolli dettagliati, vedere: Sincich et al. 14; Tootell e Silverman15). Critico: Uso PB (0,1 M; pH 7.4) per mantenere il cervello umido in tutti i tempi.<ol>
<li>Mettere l'area di interesse su una carta da filtro umida in un grande piatto di Petri, con la corteccia rivolto verso l'alto.</li>
		<li>Rimuovere la membrana aracnoide e la pia utilizzando due pinze.</li>
		<li>Utilizzare un batuffolo di cotone umido e inserire delicatamente in ogni solco per staccare aderenze tra circonvoluzioni.</li>
		<li>Girare il cervello intorno utilizzando un'altra carta da filtro umido.</li>
		<li>Utilizzare due curve micro spatole per dispiegare i gyri singoli. Utilizzare il lato convesso delle spatole per stuzzicare a pezzi la materia bianca fino ad arrivare vicino l'estremità concava del gyrus. Utilizzare un batuffolo di cotone umido e procedere con movimenti vorticosi di raggiungere l'estremità concava del gyrus.</li>
		<li>Stuzzicare apart gyri singoli. Se necessario, aggiungere alleviare piccoli tagli se la tensione è troppo alta.</li>
		<li>Appiattire il cervello spiegato nella capsula di Petri o un contenitore simile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Facoltativamente, posto di cervelli più grandi su una spugna filtro carta coperta, per garantire che le regioni non asciugarsi.</li>
	<li>Posizionare due pezzi arrotolati di argilla su entrambi i lati. Critico: Come lo spessore dell'argilla definisce quanto l'emisfero può essere appiattito, assicurarsi che l'argilla è 10-20% più sottile di corteccia del ONU-appiattita.</li>
	<li>Premere delicatamente una seconda diapositiva vetro/piccola capsula di Petri sulla corteccia finché l'emisfero è completamente piatto. Per ottenere i migliori risultati per una regione desiderata, posizionare il vetrino prima sulla zona rispettiva. Per ottenere i migliori risultati per i cervelli lissencephalic, posizionare il vetrino tangenzialmente alla parte laterale prima e applicare una pressione concentrata su questa regione.</li>
	<li>Mettere un peso (per esempio, un vetro da orologio in ceramica) sulle diapositive di vetro/Petri e appiattire l'emisfero per 3-5 h a 4 ° C in PB.</li>
	<li>Per post-fissazione, rilasciare la pressione e rimuovere le diapositive di vetro. Mettere l'emisfero appiattito in PFA (mobile) per 24 h in un agitatore a 4 ° C. Nota: Si ottengono migliori risultati per colorazioni istochimiche attività quando si utilizza 1% PFA. Per altre colorazioni, come immunohistochemistry, al posto del cervello non perfusi, 2% PFA può essere utilizzato.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> Figura 1: rappresentazione schematica del flusso di lavoro per l'appiattimento di un emisfero corticali del ratto e la visualizzazione dei moduli nella corteccia somatosensoriale. Successivamente la perfusione di perfusione, il cervello di un topo è stato dissecato (A). Strutture subcortical sono stati rimossi e corteccia è stato appiattito fra due vetrini in tampone fosfato (B). Appiattito emisfero (C) era post-fisso, tangenzialmente sezionato e macchiato per attività dell'ossidasi del citocromo (D). Scala bar = 1 cm. r: rostrale, c: Caudal, l: laterale, m: mediale. Figura adattata da Lauer et al. 23 <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
3. taglio di sezioni tangenziali
Nota: A seconda delle esigenze dei protocolli di colorazione, la procedura di taglio e lo spessore possono essere adattati. Un vibratomo è stato usato per tagliare gli emisferi per un'ulteriore elaborazione istochimica (punto 3.2) a 80-150 µm. Tuttavia, per l'elaborazione di immunohistochemical, sezioni più sottili sono desiderati e un congelamento microtomo è stato usato per sezionamento (punto 3.3) a 10-60 µm. Guarda il Video 1.
<ol><li>Lavare l'emisfero appiattito in PB (0.1 m; pH 7.4) per 15 min.</li>
	<li>Tagliare l'emisfero su un vibratomo.<ol>
<li>Mettete l'emisfero tangenzialmente sul supporto per affettare. Facoltativamente, premere di nuovo delicatamente con un vetrino prima di fissarla in posizione (ad es., con colla a presa rapida). Nota: Ridurre al minimo la quantità di colla utilizzata, perché gli artefatti di taglio potrebbero essere causa il piccolo spessore degli emisferi appiattiti.</li>
		<li>Tagliare l'emisfero dall'estremità più spessa e più stabile verso l'estremità più sottile (posteriore a anteriore, qui) lo spessore desiderato. Procedere al punto 3.4. Nota: Se le concentrazioni basse di fissazione sono state usate, tagliato ad una velocità lenta e un'elevata ampiezza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tagliare l'emisfero su un congelamento microtomo.<ol>
<li>Cryoprotect il cervello immergendolo in una soluzione di saccarosio al 30% (in PB) fino a quando si affonda. Nota: A seconda delle dimensioni del tessuto essere prelevate, affondando nella soluzione può variare da poche ore ad alcuni giorni. Per i più grandi cervelli crioprotezione alternativi metodi potrebbero essere considerati (Vedi Antonella et al. 16).</li>
		<li>Formare un ghiaccio base del congelamento microtomo per montare il cervello. Costruire il base di ghiaccio di congelamento PB sul viso di blocco del congelamento microtomo. Critico: Assicurarsi che la superficie della base del ghiaccio sia parallela alla lama del microtomo. Per effettuare questa operazione, tagliare il ghiaccio vuoto base utilizzando la lama del microtomo per allineare esattamente la base di ghiaccio parallela alla superficie di taglio.</li>
		<li>Incorporare il cervello in mezzo di congelamento e montarlo sul viso di blocco del microtomo con l'area di interesse parallelo alla faccia del blocco. Faccia la superficie pial del cervello verso la faccia di blocco del microtomo. Critica: Regolare la temperatura di congelamento a seconda delle dimensioni del campione; temperature più elevate assicurano migliore sezione integrità durante il sezionamento, ma più grandi sezioni richiedono temperature più basse per congelare il campione in modo uniforme.</li>
		<li>Tagliare il cervello tangenzialmente allo spessore richiesto (velocità di taglio più lento e uniforme risultato nella migliore qualità di sezione).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare le sezioni in PB per 15 minuti su un agitatore.</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> Video 1: video schematico della tangenziale di sezionamento da una corteccia di entorhinal mediale del ratto e il layout dei moduli Parasubiculare ed entorinale. La corteccia di entorhinal mediale di un cervello del roditore è situata all'estremità posteriore della corteccia ed è inclinata verso il lato mediale e ventrale. Sezioni tangenziali sono ottenute con un coltello lungo questo angolo di orientamento. Di conseguenza, colorazione specifica cellula-tipo appropriato rivela strutture modulari nella corteccia di entorhinal mediale e Parasubiculare adiacente. Video tratto da Ray e Brecht8. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
4. visualizzazione dei moduli corticali usando la macchiatura dell'ossidasi del citocromo
Nota: Diversi protocolli di colorazione sono stati sviluppati per il rilevamento di istochimica di attività dell'ossidasi del citocromo, ad es., in primo luogo da Wong-Riley17 e successivamente modificati da Divac et al. 18 il presente protocollo è basato su quello di Divac et al. 18, poiché l'uso di solfato di nichel-ammonio (NiAS) si traduce in un maggiore contrasto e meglio definiti moduli in aree corticali macchiate.
<ol><li>Preparare il citocromo ossidasi soluzioni di colorante (Vedi Divac et al. 18). per 10 mL di soluzione, aggiungere: 10 mL di tampone HEPES (0,1 M, pH 7.4), 400 mg di saccarosio, 12,5 mg NiAS, citocromo C, 6mg diaminobenzidina (DAB) di 2 mg. Attenzione: DAB e NiAS sono cancerogene. Nota: Aggiungere DAB appena prima dell'incubazione delle sezioni.</li>
	<li>Lavare le sezioni nel tampone HEPES (0,1 M, pH 7.4) su un agitatore per 15 min.</li>
	<li>Incubare le sezioni nella soluzione colorante a temperatura ambiente in un agitatore. Nota: Osservare la velocità della colorazione. Se non c'è nessuna reazione visibile, modificare in incubazione a 37 ° C. A seconda della quantità di fissazione, la colorazione può essere osservata dopo 10 min o in diverse ore.</li>
	<li>Fermare la reazione aggiungendo 4% PFA; Questo impedisce indesiderate ri-morire e aumento del segnale di fondo.</li>
	<li>Lavare le sezioni tre volte utilizzando tampone HEPES per 10 min.</li>
	<li>Montare e asciugare le sezioni sulle lastre di vetro.</li>
	<li>Disidratare le sezioni con una riga di alcol crescente:<ol>
<li>Lavare i vetrini in etanolo al 60% per 1 min. lavare i vetrini in etanolo di 80% per 1 min. lavare i vetrini in etanolo al 96% per 2 min. lavare i vetrini in etanolo al 100% per 3 min. lavare i vetrini in isopropanolo per 5 min. lavare i vetrini in xilene per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immediatamente aggiungere un mezzo di montaggio a indurimento rapido e un vetrino coprioggetti. Critica: Non usare mezzi di montaggio a base acqua, come NiAS sarà lavato e degradare la colorazione.</li>
	<li>Mantenere le sezioni a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>5. visualizzazione dei moduli corticali usando la macchiatura Immunohistochemical
Nota: Protocolli multipli sono disponibili per l'immunoistochimica, ottimizzato per il campione e il tipo di sonda. Gli adattamenti possono essere fatto come richiesto, dalla variazione delle concentrazioni di anticorpi, agenti permeabilizing e tempi di incubazione. Il seguente protocollo porta a buoni risultati per la rilevazione di una vasta gamma di anticorpi e la visualizzazione di sonde fluorescenti.
<ol><li>Lavare le sezioni in PBS (0,1 M; pH 7.4) per 15 min.</li>
	<li>Facoltativo: Eseguire ricupero dell'antigene per smascherare un epitopo usando un bagno di acqua (basato su Jiao et al. 19; per metodi alternativi, vedere Pileri et al. 20).<ol>
<li>Preriscaldare un bagno di acqua a 80 ° C. Preparare tri-sodio citrato buffer19 (pH 8.0) e preriscaldarlo nel bagno d'acqua a 80 ° C.</li>
		<li>Trasferire le sezioni in tampone citrato tri-sodio. Incubare le sezioni per 30 min a 80 ° C</li>
		<li>Raffreddare le sezioni fino a temperatura ambiente</li>
		<li>Lavare le sezioni in PBS per 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare le sezioni due volte in PBS-X (0,5% Triton-X, in 0.1 M PBS) per 15 min.</li>
	<li>Bloccare gli epitopi aspecifici incubando le sezioni in una soluzione di albumina di siero bovino (BSA; 2,5%) e Triton-X (0,75%) in PBS per 2 h.</li>
	<li>Incubare le sezioni in anticorpo primario, ad esempio, calbindina - D28k (1:5, 000, 1% BSA in PBS-X), per 2-3 giorni su un agitatore a 4 ° C. Nota: Una diluizione ottimale per l'anticorpo primario dipende l'anticorpo specifico utilizzato. Fare riferimento alle informazioni del fabbricante per ottenere criteri di diluizione per un anticorpo specifico. Anticorpi multipli possono essere utilizzati insieme, ma devono essere sollevati contro diverse specie.</li>
	<li>Lavare le sezioni tre volte in PBS per 15 minuti ciascuno.</li>
	<li>Incubare le sezioni pernottamento in anticorpo secondario (1: 200, 1% BSA in PBS) a 4 ° C in un agitatore. Nota: Più anticorpi secondari possono essere utilizzati a differenti spettri se gli anticorpi primari multipli sono stati usati.</li>
	<li>Lavare l'anticorpo secondario lavando le sezioni tre volte in PBS per 10 minuti ciascuno.</li>
	<li>Montare e asciugare le sezioni su un vetrino per microscopio. Nota: Le sezioni devono ancora essere umide prima di montare il vetrino coprioggetto.</li>
	<li>Applicare liquido di montaggio adatto per fluorescenza coloranti su sezioni di tessuto e applicare un vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Asciugare le sezioni per 1 h.</li>
	<li>Per l'archiviazione a lungo termine, sigillare il coprioggetto con smalto e tenere al buio a 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brodmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).</li><li>Naumann, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reptilian+brain.">The reptilian brain.</a> Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).</li><li>Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+columns,+modules,+and+domains+in+the+neocortex+of+primates.">Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).</li><li>Woolsey, T. 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Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Modularità nella corteccia cerebrale è stato identificato usando una varietà di tecniche. I primi studi in genere identificati corticale moduli o visualizzando delle cellule dense regioni, o un'assenza di fibre1. I metodi successivi hanno utilizzato la presenza di fasci dendritiche24, afferenze da una particolare regione25, o l'arricchimento di neurotrasmettitori26. Qui dimostriamo due tecniche, l'istochimica (i) del citocromo ossidasi e la macchiatura di immunohistochemical (ii).
Macchiatura di citocromo ossidasi è stato uno dei più popolari metodi per visualizzare moduli corticali ed è stato ampiamente usata nelle cortecce sensoriali primarie27,28. Visualizza moduli dalla colorazione più scura per le zone di maggiore attività mitocondriale17, quindi agisce come un proxy per moduli anatomiche che suscitare le risposte funzionali notevoli. Questo metodo è stato utilizzato per visualizzare i moduli corticale nella corteccia visiva27e moduli corticali somatosensoriali (Figura 2).
Uno degli svantaggi delle tecniche istochimiche tradizionali è che loro visualizzazione tipica da microscopia chiara luminoso-campo limita il numero di moduli che possono essere visualizzati contemporaneamente. Tuttavia, metodi di immunohistochemical, nella coniugazione con sonde fluorescenti visualizzazione possono essere utilizzati anche per visualizzare particolari proteine e identificare i moduli corticali. Per esempio, thalamic afferenze al progetto cortecce sensoriali in maniera somatotopica. Quindi, visualizzando tali afferenze, utilizzando VGluT2 immunoreactivity utilizzabile anche per visualizzare le mappe di corpo nella corteccia somatosensoriale primaria che noi abbiamo visualizzato utilizzando attività della citocromo ossidasi (Figura 2). Proteine selettivi utilizzabile anche come markers cellulari per identificare gruppi di cellule geneticamente definite. Usando immunohistochemistry, abbiamo identificato i mazzi delle cellule piramidali della corteccia di entorhinal mediale che esprimono la proteina obbligatoria del calcio, calbindina6 (Figura 3) e determinato che i cluster di questa particolare geneticamente determinato gruppo di celle sono conservati attraverso evolution5, indicando i principi comuni del microcircuito sottostante la loro funzione. Utilizzando più fluorofori, abbiamo delineato anche moduli complementari nella corteccia entorinale mediale26, dimostrando microcircuiti parallele alla base di memoria spaziale.
Storicamente, il cervello è stato sezionato in un piano normale alla sua posizione nel corpo, in orientamenti sagittali, coronali o orizzontali. L'identificazione dei moduli corticale, come i campi di canna in corteccia somatosensoriale4 richiesto anche sezionamento lungo una tangenziale e successivamente in preparazioni corticale appiattito29, anche se sono stati casi isolati di tale sezionamento osservato molto precedenti30,31. Dopo l'identificazione della corteccia barile, altri moduli corticale inoltre sono state identificate nella corteccia visiva primaria27, così come la presenza di un corpo completo mappa32 con una rappresentazione somatotopica del corpo nella primaria corteccia somatosensoriale. Sezioni appiattite della corteccia visiva gatto inoltre ha rivelato l'organizzazione topografica delle colonne di orientamento senza la necessità di ulteriori ricostruzioni33. Modularità corticale è stata dimostrata anche nelle cortecce parahippocampal, tra cui il presubiculum e Parasubiculare26,34 e corteccia di entorhinal mediale6. Appiattimento in genere un oggetto curvo induce distorsioni nella topografia laminare - come si può osservare dalla moltitudine delle proiezioni della superficie terrestre curvo su una mappa piatta35. Un metodo relativamente semplicistico per compensare parzialmente queste distorsioni è dall'introduzione di punti di riferimento a distanze definite prima di appiattimento e poi misurando la distanza tra di loro dopo l'appiattimento. Questi segni quindi non solo subserve nello stimare quantitativamente distorsioni introdotte da appiattimento, ma anche forniscono un agevole punto di riferimento per allineare le sezioni consecutive. Ulteriori aspetti cruciali per preservare la fedeltà laminare comprendono l'assicurazione di appiattimento omogenea in tutta la sezione, e infine taglio tangenziale esattamente il layout laminare per ottenere ottimizzato sezioni corticale laminare.
La visualizzazione dei moduli corticali in sezioni appiattite tangenziale ha svolto un ruolo importante nel rivelare relazioni struttura-funzione affascinante nella corteccia cerebrale. La rappresentazione topografica del baffo e parti del corpo nella corteccia somatosensoriale primaria e la presenza di una griglia anatomica in microcircuiti generazione di celle della griglia funzionale in parti corticali tangenziale appiattite rivelano intricati microcircuiti dettagli che sarebbero difficili da comprendere da altri orientamenti. Tuttavia, i nostri attuali tecniche forniscono solo una fetta bidimensionale di questi moduli essenzialmente tridimensionali. Utilizzando tecniche di immunofluorescenza e tessuto compensazione metodi36,37, sarebbe possibile visualizzare questi moduli corticali nel suo complesso e forse rivelare ulteriori intuizioni nella nostra comprensione delle mappe corticali e moduli.

Alcuni dei più significativi cambiamenti nella struttura del cervello attraverso la filogenesi può essere osservata nella corteccia cerebrale. Nonostante le differenze significative, la corteccia degli animali segue uno schema comune e possa essere suddivisi in due modi distinti, di strati e zone1. Strati corticali siano parallele alla superficie del cervello e variano in numero da 3 strati in cortecce rettile2 a 6 strati in cortecce dei mammiferi1. Aree corticali sono invece distinte regioni della corteccia che corrispondono in gran parte alle funzionalità distinte, ad esempio, la corteccia somatosensoriale è coinvolto nella sensazione di tocco o la corteccia visiva nell'elaborazione di input visivi. Queste aree corticali possono spesso essere suddivisi patch o moduli3, che si ripetono regolarmente strutture anatomiche, essenzialmente trovati parallele alla superficie pial del cervello. Moduli corticale possono essere limitati a un particolare livello4o estendono in diversi strati5.
Metodi standard di sezionamento del cervello coinvolgono sezioni normale alla superficie del cervello, come coronale e sagittale. Mentre questi metodi possono essere utilizzati per visualizzare moduli corticale, una moltitudine di caratteristiche interessanti possa essere rivelata quando i moduli corticali sono visualizzati tangenzialmente, in un piano parallelo alla superficie del cervello. Per esempio, somatosensoriali moduli nel cervello del roditore che rappresenta baffi, appaiono come barili quando visualizzato normale alla superficie del cervello, e così le regioni derivano la corteccia di canna di nome. Sulla visualizzazione le botti in un orientamento tangenziale, esse però rivelano una baffo-mappa, con le canne essendo disposti in un orientamento topografico del mirroring l'esatta disposizione dei baffi sulla superficie esterna del corpo. In alcuni casi, disposizione modulare è sfuggito anche rilevamento per lunghi periodi, quando visualizzati in un modo non tangente. La corteccia di entorhinal mediale, è noto per la presenza di celle della griglia, i neuroni che il fuoco in un reticolo esagonale regolare quando un animale attraversa un ambiente. Anche se è una zona fortemente indagata, fino a poco tempo fa, la presenza di patch o moduli di cellule nella corteccia entorinale mediale, che sono fisicamente disposti in un reticolo esagonale6, era fuggito il rilevamento. La presenza e la disposizione di questi moduli, nel cervello del ratto, è stata facilitata effettuando sezioni tangenziali della corteccia entorinale mediale e indagando la citoarchitettura in maniera strato-saggio.
A seguito di sezionamento, il particolare aspetto della visualizzazione dei moduli corticale può essere realizzato anche in più modi. Classicamente, gli studi hanno delineato moduli basati sul cellulare densità o fibra di formato1. Un altro approccio popolare è l'uso di istochimica di citocromo ossidasi, che rivela le aree di maggiore attività8. Approcci più recenti includono guardando tipi di cellule geneticamente determinata, distinti sulla base della loro espressione di proteina profili6,8.
In questo studio, evidenziamo i metodi per isolare la corteccia dai cervelli dei mammiferi, ottenere sezioni tangenziali appiattite e visualizzare corticale moduli basati sul citocromo ossidasi istochimica e immunoistochimica di proteine specifiche del tipo di cella.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cytochrome oxidase staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c from equine heart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1827</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antigen retrieval&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td><td>Carl Roth</td><td>4984.3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>TRITON-X 100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunohistochemistry&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000347</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000340</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V, biotin free</td><td>Carl Roth</td><td>0163.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mounting or freezing media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (immunofluorescence)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt (histochemistry)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03989</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0696746</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Alcohol dehydration&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Carl Roth</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Carl Roth</td><td>P075.3</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752.4</td><td></td></tr><tr><td>Xylene substitute</td><td>Fluka</td><td>78475</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Devices/tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 650V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jung RM2035</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps - Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Bone Shears - 24 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>16150-24</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors - Large Loops</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Fine Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices

La corteccia del cervello dei mammiferi è parcellated in sottostrutture distinte o moduli. Moduli corticali in genere siano parallele al foglio corticale e possono essere delineate da alcuni metodi istochimici e immunohistochemical. In questo studio, segnaliamo un metodo per isolare la corteccia dai cervelli dei mammiferi e appiattirli per ottenere parallelo di sezioni al foglio corticale. Abbiamo ulteriormente evidenziare selezionato istochimiche e immunohistochemical metodi per elaborare questi appiattito tangenziale sezioni per visualizzare moduli corticale. Nella corteccia somatosensory di vari mammiferi, eseguiamo la citocromo ossidasi istochimica per rivelare il corpo mappe o corticale moduli che rappresenta diverse parti del corpo dell'animale. Nella corteccia entorinale mediale, un'area dove vengono generate le celle della griglia, utilizziamo metodi di immunohistochemical per evidenziare i moduli dei neuroni geneticamente determinati, che sono organizzati in un modello di griglia nel foglio di corticale attraverso le diverse specie. Nel complesso, mettiamo a disposizione un framework per isolare e preparare layer-wise appiattito sezioni corticale e la visualizzazione di corticale moduli utilizzando istochimiche e immunohistochemical metodi in un'ampia varietà dei cervelli dei mammiferi.

Abbiamo ottenuto sezioni appiattite corticali della corteccia somatosensory in una varietà di cervelli ed elaborato li per la citocromo ossidasi istochimica visualizzare i moduli somatotopica che rappresenta diverse parti del corpo. Questo approccio comparativo permette di studiare le forze evolutive che corteccia forma, ad esempio, risultati altamente conservata rappresentazione delle vibrisse baffi in roditori e lagomorpha come botti21 (Figura 2). Al contrario, altre parti del corpo come le zampe e genitali mostrano variazioni nella loro relativa dimensione e riflettono la specializzazione di una nicchia ecologica o di selezione sessuale22,23.
Per comprendere l'architettura della corteccia entorinale mediale, ottenemmo parallelo di sezioni per la superficie pial. Questo è stato principalmente ottenuto sezionando tangenziale della corteccia entorinale mediale in topi, ratti e pipistrelli della frutta egiziani. In esseri umani, a causa delle dimensioni notevolmente più grandi e più ondulazioni nella corteccia entorinale, abbiamo appiattito delicatamente la corteccia a seguito di un taglio tangenziale della corteccia entorinale. Successivamente, tutti i cervelli sono stati crioconservati e sezionati un criostato a 60 µm. Immunohistochemistry è stato effettuato sulle sezioni ottenute con un anticorpo anti-calbindina, per visualizzare i moduli delle cellule piramidali calbindin-positive nell'entorinale mediale corteccia5 (Figura 3). Il calbindina-moduli nella corteccia entorinale mostrano una notevole periodicità attraverso tutti questi cervelli e variano nel formato da solo un fattore di 10 ~ 20.000 variazione nel cervello taglie5.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig2.jpg"> Figura 2: layout topografico dei moduli corteccia barile attraverso mammiferi identificati dal citocromo ossidasi istochimica. Sezioni tangenziali di livello IV dalla corteccia somatosensory del mouse (A), (B) Meriones unguiculatus, ratto (C), (D) degu, criceto (E), coniglio (F), mostrando botti come un somatotopica altamente conservato rappresentazione delle vibrisse baffi. Scala bar = 500 µm. m: l: laterale, mediale, r: rostrale, Caudal c:; Orientamento nella A si applica anche a B-E. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56992/56992fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig3.jpg"> Figura 3: layout di periodica dei moduli di corteccia di entorhinal mediale attraverso mammiferi identificati dal immunoreactivity calbindina. Sezioni tangenziali da strato II della corteccia entorinale mediale del mouse (A), (B) ratto, pipistrelli della frutta egiziano (C) e (D) umana, mostrando una conservato disposizione periodica di moduli delle cellule piramidali calbindin-positive. Scala bar = 250 µm. m: mediale, laterale l:, d: dorsale, v: ventrale, r: rostrale, Caudal c:; Orientamento in D vale anche per B, C. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56992/56992fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per ottenere sezioni appiattite tangenziale da cortecce dei mammiferi e visualizzare moduli corticali usando istochimiche e immunohistochemical metodi.

Visualizzazione dei moduli corticali nelle cortecce dei mammiferi appiattite

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K Views.  Humboldt University of Berlin. Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per ottenere sezioni appiattite tangenziale da cortecce dei mammiferi e visualizzare moduli corticali usando istochimiche e immunohistochemical metodi.

Video: Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

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Neuroscienze

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

Come misurare Folding corticale dalle immagini MR: uno step-by-step tutorial per calcolare indice locale Gyrification

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Medicina

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Corticale multistrato Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging nei mouse con movimento libero con sonde a prisma e microscopia a fluorescenza miniaturizzata

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Comportamento

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Imaging in vivo di Deep strati corticali usando un microprismi

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Biologia

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualizzazione di Thalamocortical Axon ramificazione e Synapse formazione in Cocultures organotipiche

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain

Source: Slater, B. J., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53067">Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2015)
The video demonstrates the preparation of colliculo-thalamocortical brain slices from mouse pup brains. An isolated brain is aligned on a marked slide and cut at an angle to align the auditory midbrain and forebrain in the same plane. The brain is then sliced using a vibratome, and the slices containing the major auditory midbrain and forebrain structures are transferred to a holding chamber for preservation.

Preparazione di fette collicolo-talamocorticali da un cervello di cucciolo di topo

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation for and Removal of ...