Name: visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices
Uploaded: 2018-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices at JoVE.com

이 작품은 신경 퇴행 성 질병 (DZNE), 독일 연방 교육부 (BMBF, Förderkennzeichen 연구에 대 한 훔볼트 대학 촉 산 베를린, 계산 신경 과학 베를린의 번스타인 센터, 독일 센터에 의해 지원 되었다 01GQ1001A), NeuroCure, 그리고 고트프리트 빌헬름 라이프니츠 DFG의 상. 우리 Shimpei 이시야마 우수한 그래픽 디자인 및 우수한 기술 지원 Juliane Diederichs 감사합니다.

모든 실험 절차는 로컬 윤리 위원회 (LaGeSo)의 감독 하에 동물 복지에 독일 지침에 따라 수행 했다. 인간 박쥐 뇌 데이터 노이만 외 에서 파생 했다 5 다음 절차는 성인 남성 Wistar 쥐에 수행 (스트레인: RJHan:WI).
1. 관류 및 뇌 추출
참고: homogenously 고정 하 고 혈액-무료 두뇌를 얻기 위해 동물의 transcardial 관류는 매우 권장 하 고, 잔여 혈액 얼룩 동안 불특정 배경 신호를 증가. 그럼에도 불구 하 고, 유엔 perfused 견본에서 평평된 섹션을 가져오고 얼룩 수 이기도 합니다. 시료 처리의 편리한 사용 정착 액의 농도 따라 다릅니다. 너무 작은 고정 병합 및 절단, 너무 높은 농도 병합에 대 한 유연성과 착 색 신호의 품질 낮은 하는 동안 하는 동안 두뇌에 손상을 처리의 위험을 증가 시킵니다.
<ol><li>Transcardially perfuse는 동물 23 G 바늘을 사용 하 여. 더 자세한 안내 참조 게이지 외. 9<ol>
<li>인산 염 버퍼 식 염 수10 (PBS, 0.02 M, pH 7.4) 동물의 몸과 뇌에서 피를 사용 하 여. 주입 액체 명확, 적어도 150 mL PBS 혈관 시스템을 통해 주입 되 고 표시 될 때까지 계속 합니다. 참고: 최상의 결과 얻으려면 끼얹는다 되 동물의 생리 적인 혈압의 범위와 유사한 압력에 달성 된다 (예를들면, 쥐: 120-130 mmHg). 필요에 따라 솔루션을 피하기 위해 혈액 응고11헤 파 린 (10 U/mL)를 추가 합니다.</li>
		<li>뇌를 해결 하려면 transcardially 최소 100 mL paraformaldehyde12 달 이다 (PFA, 4%; 0.1 M 인산 버퍼 (PB)13) 동물의 목은 뻣 뻣 한 때까지. 주의: PFA는 잠재적인 발암 물질 이다. 참고: 얼룩, 같은 시 토 크롬 산화 효소 조직화 학적인 활동에 대 한 가장 좋은 결과 달성, 2%를 사용 하는 경우 PFA. 다른 얼룩, immunohistochemistry, 등 4 %PFA 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두개골에서 뇌를 추출 합니다. 참고: 게이지 외. 자세한 내용은 9 .<ol>
<li>머리 큰가 위 또는 뼈가 위를 사용 하 여 격리 합니다.</li>
		<li>좋은 위를 사용 하 여 코 목에서 중간에 따라 피부를 잘라. 두개골을 노출 피부 떨어져 당겨. 목과 일시적인 근육 좋은 위를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
		<li>정수 리 뼈까지 구멍 매그넘에서 출발 interparietal 뼈 통해 잘라 중간을 확인 합니다.</li>
		<li>벗기다 interparietal 뼈 Rongeurs를 사용 합니다. 화살 봉합을 따라 잘가 위를 정면 뼈의 앞쪽 끝에는 정수 리의 후부 끝에서 잘라.</li>
		<li>Rongeurs를 사용 하 여 정수 리와 정면 뼈 껍질. 또는, 멀리 집게를 사용 하 여 뼈를 들어 올립니다. 숟가락을 사용 하 여 복 부 신경 코드를 잘라내어 뇌를 제거. PB (0.1 m M, pH 7.4)에 뇌를 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4%에 침수에 의해 유엔 perfused 두뇌 수정 4 ° C에서 1-3 h PFA (두뇌 크기 및 프로브에 따라: 말괄량이: ~ 1 h, 인간: ~ 3 h). : 참고 대형 및 gyrencephalic 두뇌 인간 같이, 분리 하 고 고정 시간을 줄이기 위해 관심 영역 밖으로 잘라.</li>
	<li>섹션에 더 큰 피 질 영역을 얻기 위해 병합 더 후 고정; 이전 뇌 2 단계로 진행 합니다. 그러나, 부분의 중간 entorhinal 외피 같은 영역에 도달 더를, 후 4%에서 뇌 수정 PFA 2 단계를 진행 하기 전에 24 h에 대 한.</li>
</ol>2. 뇌의 해 부와 병합
<ol><li>면도날 (lissencephalic 두뇌) 또는 메스 (gyrencephalic 두뇌)를 사용 하 여 두뇌 반구를 분리 합니다. 참고: 경우에 뇌 후 고정 되지이 처리에 의해 손상 될입니다.</li>
	<li>후속 섹션 등록 및 수축 추정을 방 조에 대 한 선택적 단계:<ol>
<li>비-관심의 영역에서 피 질 대뇌 피 질의 표면에 정상 35 G 바늘으로 찔린 합니다. 대뇌 피 질의 시트 따라 정의 된 거리에서 두 번 단계를 반복 합니다. 대뇌 피 질의 시트 따라 거리를 결정 하려면 미리 잘라 스레드를 사용 하 여 고정된 길이 (예를 들어, 5 m m)에 하 고 펑크의 포인트를 결정 하는 대뇌 피 질의 표면에 따라 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lissencephalic 두뇌: subcortical 구조 해 주걱을 사용 하 여 제거. 중요: 모든 절차에 걸쳐 PB (0.1 m M, pH 7.4)와 습 한 뇌를 유지.<ol>
<li>소 뇌에 의해 뇌를 누른 부드럽게 신체 callosum에서 해 부 비행기 여 주걱을 삽입 합니다. 라운드 팁 주걱의 피 질에서 가리켜야 합니다.</li>
		<li>추가 주걱을 주걱 시상과 피 질 사이 때까지 부드럽게 당겨. 별도 동작을 긁어와 subcortical 구조입니다.</li>
		<li>반구도 두께 대 한 검사 합니다. 참고: 모든 고르지 못한 영역이 단면 중 트랜스 레이어 그라데이션에 발생할 수 있습니다. 접선 단면 메스는 뇌를 통해 접선 섹션은 원하는 지역의 pial 표면에 평행 하 게 깨끗 한 컷을 만들기 위해 사용 합니다.</li>
		<li>병합 품질 향상을 위한 선택적 단계를 수행:<ol>
<li>그들은 측면에 피 층의 두께 증가 이후가, 핵 accumbens, orbitofrontal 외피를 통해 깨끗 한 컷을 확인 합니다. 또한, 외피의 중간 부분에의 전개를 수 있는 전 두 엽 피 질의 내부 지역에 구호 컷을 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>유리 슬라이드에 반구 (피 질 아래로)를 놓습니다. 2.6 단계로 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gyrencephalic 두뇌: gyri 펼쳐 백색 질 제거 (자세한 프로토콜에 대 한 참조: Sincich 외. 14; Tootell 및 실버15)입니다. 중요: 사용 PB (0.1 m M, pH 7.4) 촉촉한 유지 하는 두뇌에서 모든 시간<ol>
<li>관심 영역을 향하도록 피와 큰 페 트리 접시에 젖은 필터 종이 입었다.</li>
		<li>거미 집 모양의 막과 두 개의 집게를 사용 하 여 pia를 제거 합니다.</li>
		<li>젖은 면봉을 사용 하 고 gyri 사이의 유착을 분리 하려면 각 고 랑에 부드럽게 삽입.</li>
		<li>다른 젖은 필터 종이 사용 하 여 두뇌를 돌아서.</li>
		<li>2 개의 곡선된 마이크로 주걱을 사용 하 여 단일 gyri 전개. 이랑의 오목 끝 가까이 도달까지 떨어져 백색 질을 애타게 하는 주걱의 볼록한 쪽을 사용 합니다. 젖은 면봉을 사용 하 고는 이랑의 오목 끝에 도달 소용돌이 움직임 진행.</li>
		<li>떨어져 단일 gyri 애타게. 필요한 경우 작은 구호 상처 긴장 너무 높은 경우 추가 합니다.</li>
		<li>페 트리 접시 또는 이와 유사한 용기에서 펼친된 두뇌 평평.</li>
	</ol>
</li>
	<li>필요에 따라 지역 밖으로 건조 하지 않습니다 보장 하기 위해 적용 하는 필터 종이 스폰지에 더 큰 두뇌를 배치 합니다.</li>
	<li>양쪽에 찰 흙의 2 개의 연된 조각을 놓으십시오. 중요: 흙의 두께 정의 얼마나 많은 북반구를 결합 수, 점토 10-20% 인지 확인 취소 병합 된 피 질 보다 얇은.</li>
	<li>북반구는 완전히 평평 때까지 부드럽게 피 질에 두 번째 유리 슬라이드/작은 페 트리 접시 누릅니다. 원하는 지역에 대 한 최상의 결과 얻으려면 해당 지역에 유리 슬라이드를 먼저 놓습니다. Lissencephalic 두뇌에 대 한 최상의 결과 얻으려면, 유리 슬라이드 tangentially 측면 부분에 먼저 놓고이 지역에 집중 된 압력을 적용 합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드/페 트리 접시 (예, 세라믹 시계 유리) 무게를 넣어 샌드위치에 4 ° C에서 3-5 h에 대 한 반구를 평평 하 게.</li>
	<li>후 고정을 위한 압력을 해제 하 고 유리 슬라이드를 제거 합니다. 4 ° c.에 통에 24 h 평평된 반구 PFA (무료 부동)에 넣어 참고: 조직화 학적인 활동 stainings에 대 한 최상의 결과 달성 1%를 사용 하는 경우 PFA. Immunohistochemistry, 유엔 perfused 두뇌, 2 %PFA 사용할 수 등 다른 stainings에 대 한.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig1.jpg"> 그림 1: 쥐 대뇌 반구 및 시각화 somatosensory 피 질에 모듈의 병합에 대 한 워크플로의 도식 대표. 쥐의 뇌 해 부 transcardial 관류 후 (A). 바꾸어 구조 제거 하 고 피 질 인산 버퍼 (B)에서 두 개의 유리 슬라이드 사이 평평 했다. 병합 된 반구 (C) 후 고정, 접선 sectioned, 고 시 토 크롬 산화 효소 활동 (D)에 대 한 스테인드. 스케일 바 = 1 cm. r: Rostral, c: 꼬리, l: 측면, m: 중간. 라우 어 외. 에서 적응 하는 그림 23 <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56992/56992fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
3. 절단 접선 섹션
참고: 얼룩 프로토콜의 요구에 따라 절단 절차 및 두께 적용할 수 있습니다. Vibratome는 80-150 µ m에서 더 조직화 학적인 처리 (3.2 단계) 반구를 잘라 사용 되었다. 그러나, immunohistochemical 처리, 얇은 단면도 원하는 및 냉동 톰 단계에 대 한 단면 (3.3) 10-60 µ m에 사용 되었다. 동영상 1을참조 하십시오.
<ol><li>샌드위치에 평평된 반구를 세척 (0.1M, pH 7.4) 15 분.</li>
	<li>vibratome에 있는 반구를 잘라.<ol>
<li>접선 조각화 홀더는 반구를 놓습니다. 필요에 따라 다시 눌러 부드럽게 위치 (예를 들어, superglue 함께) 그것을 고정 하기 전에 유리 슬라이드와 함께. 참고: 절단 아티팩트 평평된 반구의 작은 간격으로 발생할 수 있기 때문에 사용 하는 접착제의 양을 최소화 합니다.</li>
		<li>필요한 두께에 얇은 끝 (앞쪽, 하 후부 여기) 두꺼운 하 고 더 안정적인 끝에서 반구를 잘라. 3.4 단계로 진행 합니다. 참고: 고정은 낮은 농도 사용 하는 경우 그것을 잘라 느린 속도 높은 진폭에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>냉동 톰에 반구를 잘라.<ol>
<li>Cryoprotect 때까지 (PB)에 30% 자당 해결책에 그것을 immersing 하 여 두뇌 싱크. 참고: 조직 되 고 cryoprotected의 크기에 따라 솔루션에 싱킹 범위는 몇 시간에서 몇 일입니다. 큰 머리에 대 한 대체 cryoprotection 방법 간주 될 수 있습니다 (참조 Rosene 외. 16)입니다.</li>
		<li>기본 탑재 두뇌 동결 톰에 얼음을 형성 합니다. PB 동결 톰의 블록 얼굴에 결빙으로 기본 얼음을 생성 합니다. 중요: 얼음 기지의 표면 톰 블레이드 병렬 인지 확인 합니다. 이 위해 정확 하 게 절단 표면에 평행 하 게 얼음 베이스에 맞게 톰 블레이드를 사용 하 여 기본 빈 얼음 잘라.</li>
		<li>중간에 두뇌를 포함 하 고 평행 블록 얼굴을 관심 영역으로는 톰의 블록 얼굴에 그것을 마운트. 얼굴은 톰의 블록 얼굴 쪽으로 두뇌의 pial 표면. 중요: 샘플 크기;에 따라 동결 온도 조정 높은 온도 단면, 하는 동안 더 나은 섹션 무결성을 보장 하지만 큰 섹션 필요 낮은 온도 균일 하 게 샘플을 동결.</li>
		<li>(느리고 균일 한 절삭 속도 섹션 최상의 결과) 필요한 두께에서 접선 뇌를 잘라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세척 통에 15 분 동안 샌드위치에 섹션.</li>
</ol><img alt="Video Snapshot" src="/files/ftp_upload/56992/56992video1.jpg"> 비디오 1: 쥐 중간 entorhinal 외피 및 parasubicular 및 entorhinal 모듈의 레이아웃에서 접선 단면 구조 동영상. 설치류 두뇌의 중간 entorhinal 외피 외피의 뒤 끝에 위치 하 고 중간과 복 부 측으로 기울어져 있다. 접선 섹션이이 각도 따라 칼 동쪽으로 향하게 하 여 얻을 수 있습니다. 따라서, 적절 한 세포 유형 특정 얼룩 중간 entorhinal 외피와 인접 한 parasubiculum에서 모듈형 구조를 계시 한다. 비디오 레이 브레히트8에서 적응. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56992/Video_1_Tangential_Procedure_MEC.mp4" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
4. 시 토 크롬 산화 효소 얼룩을 사용 하 여 대뇌 피 질의 모듈의 시각화
참고: 다른 얼룩 프로토콜 웡 라일리17 에 의해 먼저 예를 들면, 시 토 크롬 산화 효소 활동의 조직화 학적인 탐지에 대 한 개발 되었고 나중 수정 Divac 외. 18 이 프로토콜 기반 Divac 외. 여 하나 18, 니켈 염화 황산 염 (니 아 스)를 사용 하 여 이후 높은 명암과 얼룩진된 피 질 영역에서 잘 정의 된 모듈에 발생합니다.
<ol><li>시 토 크롬 산화 효소 솔루션 얼룩을 준비 (참조 Divac 외. 18). 솔루션의 10 ml, 추가: 10 mL HEPES 버퍼 (0.1 m M, pH 7.4), 400 mg 자당, 12.5 mg 니 아 스, 2 mg 시 토 크롬 C, 6 mg diaminobenzidine (한 덩어리). 주의: DAB 및 니 아 스는 발암 성입니다. 참고: 섹션의 부 화 직전 한 덩어리를 추가 합니다.</li>
	<li>15 분 동안 통에 HEPES 버퍼 (0.1 m M, pH 7.4)에 섹션을 씻어.</li>
	<li>통에 실 온에서 착 솔루션에서 섹션을 품 어. 참고:는 얼룩의 속도 관찰 합니다. 보이는 반응이 있는 경우에, 37 ° c.에 외피로 변경 정착의 양에 따라 얼룩이 지 관찰할 수 있습니다 또는 10 분 후 몇 시간에.</li>
	<li>4%를 추가 하 여 반응을 중지 PFA; 이렇게 하면 원하지 않는 다시 죽어가 고 배경 신호 증가.</li>
	<li>섹션 3 시간 10 분 동안 HEPES 버퍼를 사용 하 여 씻는 다.</li>
	<li>탑재 하 고 유리 슬라이드에 섹션을 건조.</li>
	<li>탈수는 증가 알콜 행 섹션:<ol>
<li>워시 1 분 세척에 대 한 60% 에탄올에 슬라이드 슬라이드 80% 에탄올에 1 분 2 분 3 분 5 분 5 분 크 실 렌에 슬라이드를 씻어 한 소 프로 파 놀에 슬라이드 세척 한 100% 에탄올에 슬라이드 세척 한 96% 에탄올에 슬라이드 세척에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>즉시 빠른 경화 설치 매체를 추가 하 고는 coverslip 추가. 중요: 사용 하지 마십시오 물 기반 설치 매체, 니 아 스 밖으로 세척 될 것 이다 하 고 저하는 얼룩.</li>
	<li>장기 저장을 위한 4 ° C에서 섹션을 유지.</li>
</ol>5. 대뇌 피 질의 모듈 Immunohistochemical 얼룩을 사용 하 여 시각화
참고: 여러 개의 프로토콜 immunohistochemistry, 표본 및 조사 유형의 최적화에 대 한 사용할 수 있습니다. 적응을 만들 수 있습니다 필요에 따라, 항 체, permeabilizing 에이전트 및 보육 시간 다양 한 농도 의해. 다음 프로토콜 형광 프로브에 의해 항 체 및 시각화의 넓은 범위를 검색 하 여 좋은 결과 이끌어 낸다.
<ol><li>15 분 동안 PBS (0.1 m M, pH 7.4)에 섹션을 씻어.</li>
	<li>선택 사항: 정체 (Jiao 외 에 따라 물 목욕을 사용 하는 epitope를 항 원 복구 수행 19; 대체 참조 하십시오 Pileri 외. 20)입니다.<ol>
<li>80 ° c 물 목욕을 예 열 트라이-나트륨 시트르산 버퍼19 (pH 8.0)를 준비 하 고 80 ° c 물 목욕에 예 열</li>
		<li>트라이-나트륨 시트르산 버퍼 섹션을 전송 합니다. 80 ° C에서 30 분에 대 한 섹션을 품 어</li>
		<li>차가운 실내 온도 아래로 섹션</li>
		<li>15 분에 대 한 PBS에 섹션을 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS-X에 두 번 섹션을 세척 (0.5 %0.1 M PBS에 트리톤-X) 15 분.</li>
	<li>잠복기 2 h에 대 한 소 혈 청 알 부 민 (BSA; 2.5%)과 트리톤-X (0.75%) PBS에 솔루션에서 섹션으로 불특정 epitopes를 차단 합니다.</li>
	<li>1 차적인 항 체, 예를 들어, Calbindin-D28k에에서 섹션을 품 어 (1:5, 000, PBS-X에 1 %BSA), 4 ° c.에 셰이 커에 2-3 일 참고: 기본 항 체에 대 한 최적의 희석 사용 하는 특정 항 체에 따라 달라 집니다. 특정 항 체에 대 한 희석 기준을 제조 업체의 정보를 참조 하십시오. 여러 항 체 함께 사용 될 수 있다 그러나 다른 종에 대 한 발생 합니다.</li>
	<li>15 분에 대 한 PBS에 세 번 섹션을 씻어.</li>
	<li>통에 4 ° C에서 이차 항 체 (1: 200, PBS에서 1 %BSA)에서 하룻밤 섹션을 품 어. 참고: 여러 2 차 항 체 여러 기본 항 체 사용 되 면 다른 스펙트럼에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>10 분에 대 한 PBS에 세 번 섹션을 세척 하 여 이차 항 체를 씻어.</li>
	<li>탑재를 건조 한 유리에 대 한 섹션입니다. 참고: 섹션 여전히는 coverslip 장착 전에 촉촉한 이어야 한다.</li>
	<li>조직 섹션에 형광 염료에 대 한 적합 한 설치 매체를 적용 하 고는 coverslip 적용.</li>
	<li>1 시간에 대 한 섹션을 건조.</li>
	<li>장기 저장용 coverslip 매니큐어를 사용 하 여 밀봉 하 고 4 ° c.에 어둠 속에서 계속</li>
</ol>

<ol>
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저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.

대뇌 피 질에서 모듈화는 다양 한 기법을 사용 하 여 확인 되었습니다. 어느 시각화 하 여 초기 연구는 일반적으로 식별 대뇌 피 질의 모듈 세포 밀도 영역 또는 섬유1의 부재. 후속 메서드 수지상 번들24, 특정 지역25, afferents의 존재 또는 신경 전달 물질26의 농축 활용 했습니다. 여기 두 가지 방법, (i) 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry 및 (ii) immunohistochemical 얼룩이 보여 줍니다.
시 토 크롬 산화 효소 얼룩 그리고 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하는 가장 인기 있는 방법 중 하나 되었습니다 기본 감각 외피가27,28에 널리 사용 되 고 있다. 그것은 더 높은 미토 콘 드리 아 활동17, 그로 인하여 상당한 기능 응답을 유도 하는 해 부 모듈에 대 한 프록시 역할 영역에 대 한 어두운 얼룩으로 모듈을 시각화. 이 방법은 somatosensory 대뇌 피 질의 모듈 (그림 2)와 대뇌 피 질의 시각 령27모듈을 시각화 하기 위해 사용 되었습니다.
전통적인 조직화 학적인 방법의 단점 중 하나는 밝은 필드 가벼운 현미경 검사 법에 의해 그들의 전형적인 시각화 동시에 구상 될 수 있는 모듈의 수를 제한입니다. 그러나, 형광 시각화 프로브 활용에 immunohistochemical 방법, 특정 단백질을 확인 하 고 피 질 모듈을 식별 하도 활용할 수 있습니다. 예를 들어, 감각 외피가에 thalamic afferents somatotopic 방식으로 프로젝트. 따라서, 머릿속이 afferents, VGluT2 immunoreactivity를 사용 하 여 사용할 수 있습니다 우리 시각을 기본 somatosensory 피 질에 몸 지도 시각화를 사용 하 여 시 토 크롬 산화 효소 활동 (그림 2). 선택적 단백질 유전자 정의 된 셀의 그룹을 식별 하기 위해 세포 표식으로 사용할 수 있습니다. 우리 중간 entorhinal 외피 표현 칼슘 의무적인 단백질, calbindin6 (그림 3) 피라미드 세포의 클러스터를 식별 immunohistochemistry를 사용 하 고 클러스터의이 특정 유전자 결정 결정 셀 그룹 진화5, 그들의 기능을 기본 일반적인 마이크로 회로 원리를 나타내는 통해 보존 됩니다. 여러 fluorophores에 사용 하 여, 우리 또한 구분 된 중간 entorhinal 외피26, 보완 모듈 공간 메모리 기반이 병렬 칩을 보여주는.
역사적으로, 두뇌 화살, 코로나, 또는 수평 방향에서 본문에 그 위치에 수직 평면에서 구분 되어 있다. Somatosensory 피4 배럴 필드 같은 대뇌 피 질의 모듈의 식별도 메시지가 평평된 대뇌 피 질의 준비29, 후와 따라는 접선 단면 단면 같은 경우 비록 많은 이전30,31관찰. 배럴 피 식별 후 다른 대뇌 피 질의 모듈 또한에서 시체의 somatotopic 표현으로 완전 한 몸 지도32 의 존재로 서 1 차 시각 영역이27에서 확인 되었다 somatosensory 피 질입니다. 고양이 시각 피 질의 평평된 섹션도 추가 개조33에 대 한 필요 없이 방향 열 지형 조직을 밝혔다. 대뇌 피 질의 모듈화 또한 parahippocampal 외피가, presubiculum 및 parasubiculum26,34 중간 entorhinal 외피6등에서 입증 되었습니다. 평면 지도35곡선된 지구 표면의 계획의 무리에 의해 관찰 될 수 있다로 층 류 지형-왜곡 유도 일반적으로 곡선된 개체를 병합 합니다. 병합, 및 다음 병합 후 그들 사이 거리를 측정 하기 전에 정의 된 거리에 기준점을 도입 하 여 부분적으로 이러한 왜곡에 대 한 보상 하는 비교적 단순한 방법이입니다. 이 표 다음 양적 왜곡, 병합에 의해 도입 된 추정에 보조 하다 뿐만 아니라 또한 연속 섹션에 맞게 쉽게 기준점을 제공. 추가 층 류 충실도 보존 하기를 위한 중요 한 측면 섹션을 통해 동종 병합 보장 포함 하 고 마지막으로 정확 하 게 얻기 위해 층 류 레이아웃 접선 단면 최적화 층 류 피 질 부분.
평평된 접선 섹션에서 대뇌 피 질의 모듈의 시각화는 대뇌 피 질에서 매혹적인 구조-기능 관계를 드러내는에서 중요 한 부분을 담당해 왔습니다. 기본 somatosensory 피 질에 수염 및 신체 부의 지형 표현과 평평된 접선 대뇌 피 질의 섹션에 생성 하는 기능 그리드 셀 칩에 해 부 눈금의 존재 복잡 한 칩 공개 세부 정보는 다른 방향에서 이해 하기 어려울 것 이다. 그러나, 우리의 현재 기술만이 본질적으로 3 차원 모듈의 2 차원 조각을 제공합니다. 면역 형광 검사 기술과 조직 삭제 방법36,37을 사용 하 여, 그것은 전체적으로 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하 고 아마도 대뇌 피 질의 지도 및 모듈에 대 한 우리의 이해에 추가 공개 가능한 것.

일부 계통에서 뇌 구조에서 가장 중요 한 변화는 대뇌 피 질에서 관찰할 수 있습니다. 중요 한 차이도 불구 하 고 동물의 피 질 일반적인 패턴 및 분할 될 수 있다 광범위 하 게 두 가지 방법으로 레이어 및 지역1. 대뇌 피 질의 레이어 두뇌의 표면에 평행이 고 파충류 외피가2 에 3 층에서 포유류 외피가16 레이어 숫자에서 다. 대뇌 피 질의 영역 다른 한편으로 주로 해당 고유 기능, 예를 들면하는 외피의 별개 영역, somatosensory 피 터치의 시각적 입력 처리에 시각 피 질 감각에 참여. 이러한 대뇌 피 질의 영역 수 종종 수 세분화 패치 또는 모듈3, 정기적으로 해 부 구조, 근본적으로 뇌의 pial 표면에 평행 하 게 반복 하는. 대뇌 피 질의 모듈 특정 레이어4에 갇혀 있을 수 있습니다 또는 여러 레이어5에서 확장.
두뇌의 표준 단면 방법 코로나 또는 화살 처럼 두뇌의 표면에 수직 섹션을 포함 한다. 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다, 하는 동안 대뇌 피 질의 모듈은 두뇌의 표면에 평행한 평면에 접선, 시각 때 다양 한 흥미로운 기능 계시 될 수 있습니다. 예를 들어, 수염, 대표 설치류 두뇌 somatosensory 모듈 배럴 때 뇌 표면에 정상적인 시각으로 나타나고 따라서 지역 파생 이름 신 피 질. 그러나, 접선 방향에서 배럴, 머릿속에 외부 몸 표면에 수염의 정확한 레이아웃을 미러링 지형 방향에 배치 되 고 배럴을 가진 수염-지도, 공개 그들은. 경우에 따라, 모듈 배열도 탈출 상당한 기간에 대 한 감지 비 접선 방식으로 시각화 하는 경우. 중간 entorhinal 외피, 표 셀, 동물 환경이 이동 될 때 일반 육각 패턴에 발생 하는 신경 세포의 존재에 대 한 알려져 있다. 비록 그것은 무 겁 게 조사 지역, 최근, 패치의 존재 또는 중간 entorhinal 외피에 있는 세포의 모듈까지,이 실제로 6 각형 패턴6, 레이아웃 탐지를 탈출 했다. 존재와 쥐 뇌에서 이러한 모듈의 중간 entorhinal 외피의 접선 섹션을 만들고 layer-wise 방식으로 cytoarchitecture를 조사에 의해 촉진 되었다.
단면, 후 대뇌 피 질의 모듈의 시각화의 특정 측면도 여러 가지 방법으로 실현 될 수 있습니다. 고전적인, 연구 모듈 세포 밀도 또는 섬유 레이아웃1에 따라 구분 된 있다. 또 다른 인기 있는 방법은 높은 활동8의 영역을 계시 한다 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry의 사용 이다. 새로운 접근 유전자 결정된 세포 유형, 그들의 단백질 식 프로필6,8기준으로 구별을 보고 포함 한다.
이 연구에서 우리는 하 포유류 두뇌에서 외피 분리 평평된 접선 섹션, 대뇌 피 질의 모듈 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry 및 세포 형 특정 단백질의 immunohistochemistry 기반 시각화 방법을 강조 표시 합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cytochrome oxidase staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c from equine heart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1827</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antigen retrieval&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate</td><td>Carl Roth</td><td>4984.3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>TRITON-X 100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunohistochemistry&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000347</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal</td><td>Swant</td><td>RRID: AB_10000340</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V, biotin free</td><td>Carl Roth</td><td>0163.4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mounting or freezing media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (immunofluorescence)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt (histochemistry)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03989</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0696746</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Alcohol dehydration&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Carl Roth</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Carl Roth</td><td>P075.3</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752.4</td><td></td></tr><tr><td>Xylene substitute</td><td>Fluka</td><td>78475</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Devices/tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 650V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jung RM2035</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps - Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Bone Shears - 24 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>16150-24</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors - Large Loops</td><td>Fine Science Tools</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Fine Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices

포유류 두뇌의 대뇌 피 질은 별개 콘텐츠의 또는 모듈에 parcellated. 대뇌 피 질의 모듈 일반적으로 대뇌 피 질의 시트에 평행이 고 특정 immunohistochemical 조직화 학적인 방법에 의해 구분 된 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 대뇌 피 질의 시트 섹션 병렬을 얻기 위해 그들을 평평 하 게 포유류 두뇌에서 피 질을 분리 하는 방법을 강조 표시 합니다. 우리 더 강조 조직화 학적인 선택 하 고 이러한 처리 immunohistochemical 방법 평평 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하기 위해 접선 섹션. 다양 한 포유류의 somatosensory 피 질에 우리 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry 몸 지도 나 동물의 신체의 다른 부분을 대표 하는 대뇌 피 질의 모듈을 수행 합니다. 중간 entorhinal 외피, 그리드 셀 생성 되는 지역에서에서 우리 immunohistochemical 메서드를 여러 종에 걸쳐 대뇌 피 질의 시트에 그리드 패턴에서 배열 되는 유전자 결정된 뉴런의 모듈을 강조 표시 사용 합니다. 전반적으로, 프레임 워크를 분리 하 고 layer-wise 준비 대뇌 피 질의 섹션, 평평 하 고 대뇌 피 질의 모듈 사용 하 여 조직화 학적인 방법과 immunohistochemical 포유류 두뇌의 다양 한 시각화 제공 합니다.

우리 somatosensory 피 다양 한 두뇌, 대뇌 피 질의 평평된 섹션을 획득 하 고 그들을 다른 신체 부위를 나타내는 somatotopic 모듈을 시각화 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry에 대 한 처리. 이 비교 방법을 공부 진화 세력 그 모양 피 질, 예를 들어, 설치류 그리고 토끼목 배럴21 (그림 2)로 mystacial 털의 높은 보존된 표현을 보여주는 수 있습니다. 반면, 발, 성 기 등 다른 신체 부위 표시에 그들의 친척 크기 변화와 생태 틈새 또는 성적 선택22,23전문화를 반영.
중간 entorhinal 외피의 아키텍처를 이해 하려면 우리는 섹션 pial 표면에 평행 하 게 획득 이 주로 쥐, 쥐, 및 이집트 과일 박쥐에 중간 entorhinal 외피의 접선 단면에 의해 달성 되었다. 인간에서는, 상당히 큰 크기와 entorhinal 외피에서 더 많은 파동 때문에 우리가 부드럽게 결합 entorhinal 외피의 접선 컷 만들기 후 피 질. 그 후, 모든 두뇌 cryopreserved 되었고 60 cryostat에 구분 µ m. Immunohistochemistry 중간 entorhinal calbindin 양성 피라미드 셀 모듈을 시각화 하는 안티-calbindin 항 체로 얻은 섹션에서 수행 피 질5 (그림 3). Entorhinal 외피에 있는 calbindin 모듈 이러한 모든 두뇌에서 놀라운 주기를 표시 하 고 다양 한 크기에 걸쳐 10만 배 ~ 뇌에 20,000-fold 변이5크기.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig2.jpg"> 그림 2: 포유류 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry에 의해 식별에 걸쳐 총 신 피 질 모듈의 지형 레이아웃. 레이어 4 (A) 마우스, (B) 몽골 햄스터, 쥐 (C), (D) degu, (E) 햄스터, (F) 토끼 somatosensory 피 질에서 매우 보존된 somatotopic로 배럴을 보여주는의 접선 섹션 mystacial 털의 표현입니다. 스케일 바 = 500 µ m. m: 중간, l: 측면, r: Rostral, c: 꼬리; A에서 방향 B.에도 적용 됩니다. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56992/56992fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56992/56992fig3.jpg"> 그림 3: calbindin immunoreactivity에 의해 식별 하는 포유류에 걸쳐 중간 entorhinal 외피 모듈의 정기적인 레이아웃. (A) 마우스, 쥐 (B), (C) 이집트 과일 박쥐, 및 (D) calbindin-긍정적인 피라미드 셀 모듈의 보존된 정기적인 레이아웃을 보여주는 인간 중간 entorhinal 외피의 층 II에서에서 접선 섹션입니다. 스케일 바 = 250 µ m. m: 중간, l: 측면, d: 지, v: 복 부, r: Rostral, c: 꼬리; 방향 d에서 B, C.에도 적용 됩니다 <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56992/56992fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

이 문서는 포유류 외피가에서 평평된 접선 섹션을 가져오고 피 질 조직화 학적인 사용 모듈과 immunohistochemical 방법을 시각화 하는 상세한 방법론을 설명 합니다.

병합 된 포유류 외피가 대뇌 피 질의 모듈의 시각화

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

visualization-of-cortical-modules-in-flattened-mammalian-cortices

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.7K 조회수.  Humboldt University of Berlin. 이 문서는 포유류 외피가에서 평평된 접선 섹션을 가져오고 피 질 조직화 학적인 사용 모듈과 immunohistochemical 방법을 시각화 하는 상세한 방법론을 설명 합니다.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

연구

신경과학

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

지역 Gyrification 인덱스를 계산하기위한 단계별 자습서 : MR 이미지에서 두피 접기를 측정하는 방법

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

의학

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

다층 피질 칼슘<sup&gt; 2+</sup&gt; 프리즘 프로브 및 소형 형광 현미경으로 자유롭게 움직이는 마우스에서 이미징

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

행동분석학

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Microprism를 사용하여 딥 두피 레이어의 생체내 이미징에서

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

생물학

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain

Source: Slater, B. J., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53067">Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2015)
The video demonstrates the preparation of colliculo-thalamocortical brain slices from mouse pup brains. An isolated brain is aligned on a marked slide and cut at an angle to align the auditory midbrain and forebrain in the same plane. The brain is then sliced using a vibratome, and the slices containing the major auditory midbrain and forebrain structures are transferred to a holding chamber for preservation.

Preparation of Colliculo-Thalamocortical Slices from a Mouse Pup Brain(쥐 강아지 뇌의 Colliculo-Thalamocortical Slices)

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation for and Removal of ...