Name: determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
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Este projeto foi apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisas em Saúde PG # 20R47867.

1. Determinando a expressão relativa da proteína da superfície celular em astrocitos por biotinilação NOTA: Aqui, ilustramos a aplicação desta técnica de biotinilação ao estudo dos efeitos da molécula da molécula da matriz extracelular na localização da superfície celular do canal permeável à água aquaporin-4 (AQP4). Os materiais especializados necessários para este ensaio incluem sulfo-NHS-LC-biotina e resina de estreptavidina-agarose (ver Tabela de Materiais ). <ol><li> Usando o método descrito em Noel et al. 12 , preparar culturas de astrocitos corticais aproximadamente 2 semanas antes do ensaio e cultivá-las em frascos de cultura ventilados de 75 cm2. Quando os astrocitos são 80 a 90% confluentes, separe-os da superfície da cultura usando 0,05% de tripsina e, em seguida, passe-os 1: 3. </li><li> Às 48 horas anteriores ao ensaio, quando as células são novamente 80 - 90% de confluência, astrocitos de passagem 1: 3 (responsável pelo cHange no formato de cultura) em pratos de cultura celular de 60 mm de modo que estejam&gt; 70% confluentes no dia da realização do experimento. Certifique-se de que as células são distribuídas uniformemente entre pratos. </li><li> Às 16 h antes do ensaio, laminina de pipeta em meio de cultura até uma concentração final de 24 nM e incuba a 37 ° C. </li><li> Imediatamente antes do ensaio, preparar o seguinte e, em seguida, colocar sobre gelo ou refrigerar: CM-PBS (100 mg / L de MgCl2 ∙ 6H 2 O e 100 mg / L de CaCl2 em 1X PBS, pH 7,4), tampão de biotina (0,5 Mg / mL de sulfo-NHS-LC-biotina em CM-PBS), tampão de extinção (NH4Cl 50 mM em CM-PBS), tampão de lise (Tris 25 mM, pH 7,4, glicina 25 mM, NaCl 150 mM e 5 mM EDTA, 1% de triton X-100, coqueador de inibidor de protease 1X), tampão de carga 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, SDS a 6%, glicerol a 30%, TDT 300 mM e azul de bromofenol a 0,01%) e tampão de lavagem (10 mM Tris (pH 7,4), EDTA 1,5 mM, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, coquetel de inibidor de protease 1X). </li><li> RemOve pratos segurando as culturas de astrocite da incubadora e descarte o meio. </li><li> Lavar as células três vezes com 4 mL de CM-PBS refrigerado e colocar o prato no gelo esmagado. </li><li> Pipetar 2 mL de tampão de biotina em cada poço e inclinar suavemente os pratos para frente e para trás algumas vezes para garantir uma cobertura completa. Deixe em gelo durante 30 min. </li><li> Remova o tampão de biotina usando um aspirador e substitua-o por um tampão de extinção de 4 mL. Deixe no gelo por 10 min. </li><li> Aspirar o buffer de extinção e substituir por um volume equivalente do mesmo. Mais uma vez, deixe no gelo durante 10 min. </li><li> Descarte o tampão de extinção e lave as células três vezes com 4 mL de CM-PBS arrefecido. </li><li> Raspe as células em 1 mL de CM-PBS refrigerado usando um elevador de células e transfira a suspensão para o tubo de microcentrífuga. </li><li> Células de pelota por centrifugação a 100 xg durante 3 min. Descarte o sobrenadante e volte a suspender as células em 500 μL de tampão de lise. </li><li> Deixe amostras em gelo durante 30 min, vortexando a cada 5 minutos, ou plAce eles em um rotator de extremidade a ponta a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o lisado a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar quaisquer materiais insolúveis em detergente. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. <ol><li> Economize 50 μL deste lisado e adicione o buffer de carregamento a ele. Em seguida, desnaturar-se por aquecimento a 95 ° C num banho seco; Esta é a fração &quot;entrada&quot;, contendo proteínas de superfície celular biotiniladas, bem como proteínas citosólicas não biotiniladas. </li></ol></li><li> Amplie a abertura de uma ponta de pipeta cortando aproximadamente 0,5 cm de material da extremidade usando um par de tesoura afiada. Utilizando esta ponta de pipeta, transfira 75 μL de esferas de estreptavidina-agarose (normalmente armazenadas a 4 ° C) até o lisado e incuba a 4 ° C durante 3 h no agitador / balancim. <ol><li> Como a estreptavidina-agarose é frequentemente vendida como uma pasta contendo 50% de grânulos por volume, suspensa numa solução antimicrobiana, triturar a pasta para garantir que as esferasSão uniformemente suspensos e, em seguida, pipetar 150 μL da suspensão em cada amostra. </li></ol></li><li> Esferas de estreptavidina-agarose de pelota por centrifugação a 1500 xg durante 30 s a 4 ° C. <ol><li> Economize 50 μL do sobrenadante (adicione o tampão de carga e desnaturado a 95 ° C em um banho de água ou bloco de aquecimento); Isso representa a fração &quot;intracelular&quot;, e é composto principalmente de proteínas citossicas não biotiniladas. </li></ol></li><li> Ressuspender os grânulos sedimentados em 1 mL de tampão de lavagem e arrasar isto durante 3 min a 4 ° C. Grânulos de pelota (como no passo 1.16), e descartar o sobrenadante. Repita este processo 4x para minimizar a ligação não específica de proteínas citossicas não biotiniladas. </li><li> Granular as esferas por centrifugação (1500 xg durante 30 s a 4 ° C) e descartar o tampão de lavagem subjacente. Adicione 50 μL de tampão de carga 1X (diluído usando tampão de lise). Libere a biotina e a estreptavidina das esferas desnaturando isso a 95 ° C; Esta fraçãoSó contém proteínas de superfície celular biotiniladas (fração &quot;superfície celular&quot;). <ol><li> Separar a entrada, a superfície celular e as frações intracelulares por SDS-PAGE 13 e analisar pelo Western Blot 14 . NOTA: Enquanto usamos um gel de gradiente pré-moldado de 4 a 20% em nossas experiências, um gel de separação de 12-14% com uma camada de empilhamento de 4% (cada um contendo 0,1% de SDS) deve ser suficiente para as proteínas de interesse neste estudo. Um padrão de peso molecular da faixa de tamanho apropriada também deve ser usado. Note-se que às vezes pode haver um levantamento observável nas massas moleculares aparentes de proteínas biotiniladas. </li></ol></li></ol> 2. Determinando a taxa de internalização das proteínas de superfície celular em Astrocytes por Biotinilação NOTA: No seguinte, descrevemos um experimento típico de biotinilação de pulso-perseguição usado nesta instância para rastrear a endocitose de AQP4 em astrocitos. esteO método é baseado no usado por Madrid et al. 15 . Os materiais especializados necessários incluem sulfo-NHS-SS-biotina, resina de estreptavidina-agarose, glutationa reduzida e iodoacetamida (ver Tabela de Materiais ). <ol><li> Prepare culturas de astrocitos corticais de mouse em pratos de 60 mm usando os métodos descritos na seção anterior. Certifique-se de que as células estejam aproximadamente a 70% confluentes no dia do ensaio, e que cada prato contém um número equivalente de células. </li><li> Imediatamente antes do ensaio, preparar o seguinte e colocar sobre gelo ou refrigerar: CM-PBS (100 mg / L de MgCl2 ∙ 6H 2 O e 100 mg / L de CaCl2 em 1X PBS, pH 7,4), tampão de biotina (0,5 Mg / ml de sulfo-NHS-SS-biotina em CM-PBS), tampão redutor (50 mM de glutationa reduzida, NaCl 75 mM e NaOH 75 mM), tampão de extinção (iodoacetamida 50 mM, BSA a 1% em CM-PBS) Tampão de lise (Tris 25 mM, pH 7,4, glicina 25 mM, NaCl 150 mM e EDTA 5 mM, 1% triton X-100, 1Coque de inibidor de protease X), tampão de carga 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, SDS a 6%, glicerol a 30%, TDT 300 mM e azul de bromofenol a 0,01%) e tampão de lavagem (Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1,5 mM, NaCl 150 mM, 1% de triton X-100, coquetel de inibidor de protease 1X). </li><li> Prepare um meio de cultura celular fresco (DMEM suplementado com 10% de soro de bovino fetal (FBS), 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de L-glutamina) e coloque-o em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Remova as culturas de astrocitos da incubadora e aspirar o meio usando um aspirador. </li><li> Lavar as células três vezes com 4 mL de CM-PBS refrigerado e colocar o prato no gelo esmagado. </li><li> Pipetar 3 mL de tampão de biotina em cada prato, incline os pratos para frente e para trás algumas vezes para garantir que o tampão esteja bem distribuído e deixe isso no gelo durante 30 min. </li><li> Aspirar o tampão de biotina e substituí-lo por 5 ml de meio quente. Incubar um prato de cultura a 37 ° C durante 15 min e um segundo prato à mesma temperatura durante 30 min. Deixe um outro prato aos 46; C como a amostra de 0 min. </li><li> No final do período de incubação, descarte o meio e lave as células três vezes com 4 mL de CM-PBS arrefecido. Pipetar 6 mL de tampão redutor sobre células e deixar em gelo durante 15 min. </li><li> Remova o tampão redutor e, em seguida, substitua-o por 6 ml de tampão redutor fresco. Coloque no gelo por mais 15 min. </li><li> Remova a solução redutora e substitua-a por um tampão de remoção de 6 ml. Deixe em gelo durante 15 min. </li><li> Repita o passo de extinção mais uma vez. </li><li> Descarte o tampão de extinção e lave as células três vezes com 4 mL de PBS arrefecido. </li><li> Raspe células para 1 mL de PBS refrigerado usando um elevador de células e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga. </li><li> Células de pelota por centrifugação a 100 xg durante 3 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 500 μL de tampão de lise. </li><li> Deixe isso no gelo durante 30 min e vortex a cada 5 min. Alternativamente, coloque as amostras em um rotador de extremidade a ponta a 4 ° C durante este período. </li><li> CentrífugaSai a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar os materiais insolúveis em detergente, então transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Economize 50 μL deste lisado, adicione-lhe tampão de carga e desnaturar a 95 ° C num banho seco; Esta é a fração &quot;entrada&quot;, contendo proteínas endocitadas biotiniladas, bem como proteínas não biotiniladas. </li><li> Usando uma ponta de pipeta cortada, adicione 150 μL da pasta de estreptavidina-agarose ao lisado e incuba a 4 ° C por 3 h no agitador / balancim. Consulte 1.15 para obter detalhes adicionais sobre esta etapa. </li><li> Esferas de estreptavidina-agarose de pelota por centrifugação a 1.500 xg durante 30 s a 4 ° C. </li><li> Resuspendar os grânulos em 1 mL de tampão de lavagem e rolar durante 3 min a 4 ° C. Grânulos de pelota (conforme o passo 2.18), e descarte o sobrenadante. Repita este processo 4x para minimizar a ligação não específica de proteínas citossicas não biotiniladas. </li><li> Grânulos de pelotização por centrifugação a 1.500 xg durante 30 s, a 4 ° C, e descartar oveAcumulação de buffer de lavagem. Adicione 50 μL de tampão de carga 1X (diluído usando tampão de lise). Libere a biotina e a estreptavidina das esferas por desnaturação a 95 ° C; Esta fração deve conter apenas proteínas internas de superfície celular (fração &quot;endocitosa&quot;). </li><li> Separe a entrada, a superfície celular e as frações não ligadas por SDS-PAGE 13 e analise com o Western Blot 14 . NOTA: Enquanto usamos um gel de gradiente pré-moldado de 4 a 20% em nossas experiências, um gel de separação de 12-14% com uma camada de empilhamento de 4% (cada um contendo 0,1% de SDS) deve ser suficiente para as proteínas de interesse neste estudo. Um padrão de peso molecular da faixa de tamanho apropriada também deve ser usado. Note-se que às vezes pode haver um levantamento observável nas massas moleculares aparentes de proteínas biotiniladas. </li></ol>

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Modificações: Como esses métodos foram projetados para uso com células aderentes, especificamos o uso de PBS contendo 100 mg / L de MgCl 2 ∙ 6H 2 O e 100 mg / L de CaCl2 (CM-PBS) para os passos de lavagem e como base de certos tampões de modo a garantir que as células permaneçam ligadas à superfície da cultura e que as junções célula-célula não sejam interrompidas. No entanto, os protocolos também podem ser aplicados a tipos de células não aderentes, se as células forem sedimentadas entre cada etapa do procedimento. Nestes casos, CM-PBS pode ser substituído por PBS. Além disso, é importante notar que cada uma das condições mencionadas aqui são específicas deste protocolo, e só devem ser consideradas como diretrizes difíceis se os métodos forem utilizados para outras aplicações. Particularmente, deve-se verificar de forma independente que o procedimento de extração de detergente é apropriado paraTipo de célula r, e que as configurações de centrífuga são adequadas para o tipo de célula e para as esferas de estreptavidina-agarose sendo usadas. Finalmente, se houver preocupações com a ligação não específica e / ou fundo excessivo, pode-se substituir a estreptavidina pelas várias outras formas de avidina atualmente disponíveis no mercado. Avidina de Deglycosylated, por exemplo, tem afinidade significativamente menor para lectinas, e para moléculas carregadas negativamente, como DNA. Solução de problemas e controles: Embora os procedimentos analisados ​​neste relatório sejam bastante diretos, deve-se ter em mente uma série de questões críticas que podem afetar o resultado da experiência. Em primeiro lugar, embora ambos os ensaios dependam fortemente da natureza impermeável à membrana dos reagentes de biotinilação sulfatados, certas condições podem fazer com que a membrana plasmática das células se perturbe, resultando em certas proteínas intracelularesSendo biotinilado. Para controlar esta possibilidade, sugere-se que as frações biotiniladas sejam testadas para alvos conhecidos por não serem expressos na membrana plasmática, como a β-actina. Deve ter cuidado para aderir às condições de armazenamento adequadas para os reagentes de biotinilação (tipicamente 4 ou -20 ° C, com alguma forma de dessecação), pois podem falhar de outra forma, devido à sua natureza altamente sensível. No entanto, é uma boa prática investigar as frações de entrada, biotiniladas e não biotiniladas com estreptavidina-HRP para verificar se a biotinilação realmente ocorreu e que as proteínas biotiniladas foram precipitadas eficientemente (o que será evidente a partir da ausência de um sinal no Fração não biotinilada). Fazer isso deve permitir a eliminação da possibilidade de reagentes defeituosos. A redução da ligação dissulfureto é um passo crucial no procedimento de biotinilação endocítica, pois asseguraQue somente as proteínas internalizadas serão isoladas na fração biotinilada. A incorporação de controles em que o reagente redutor é omitido ( Figura 1 C ) permite que alguém tire uma impressão da eficácia do tratamento.

As proteínas na superfície celular desempenham uma variedade de papéis centrais para manter a função celular. Em muitos casos, sua atividade é dependente ou modulada por processos endocíticos que os sequestram temporariamente em locais intracelulares, ou que os direcionam para caminhos degradativos 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Aqui, destacamos 2 abordagens baseadas em biotinilação projetadas para permitir ao usuário marcar e isolar especificamente as proteínas expressas na membrana plasmática e as que foram internalizadas novamente. Através destes métodos, a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de qualquer proteína de interesse podem ser quantificadas, permitindo assim uma avaliação mais clara da sua regulação. Determinando a expressão relativa da proteína da superfície celular por biotinilação A biotina ou vitamina B7, anteriormente conhecida como vitamina H 6 , é uma pequena molécula solúvel em água que pode ser usada para modificar quimicamente grupos amino, sulfidrilo e carboxilo reativos de moléculas biológicas. A cultura atual de reagentes de biotinilação de superfície celular consiste principalmente de ésteres de N-hidroxissuccinimida (sulfo-NHS) sulfonados com membrana e nanotoxinas (sulfo-NHS), de biotina ou seus derivados, projetados para reagir com as aminas presentes nas cadeias laterais de resíduos de lisina de proteínas expressas em A superfície celular quando estes se tornam desprotonados em condições básicas, resultando em este último formando uma ligação amida com a unidade de biotina 7 . Assim, modificadas, as proteínas da superfície celular podem então ser isoladas através do uso de avidina, uma proteína tetramerica de 66 - 69 kDa que possui grande afinidade pela biotina, que se liga ao último com uma constante de dissociação de aproximadamente 10 a 15 , marcando-a como uma das Interações não covalentes mais fortes conhecidas 8 </suP&gt; , 9 . Uma série de métodos alternativos de quantificação da expressão protéica na superfície celular foram utilizados em estudos prévios. A rotulagem de células não permeabilizadas usando anticorpos marcados de forma fluorescente especificamente para a proteína de interesse, seguida pela visualização por microscopia de fluorescência, por exemplo, é uma abordagem comumente empregada, mas depende fortemente da disponibilidade de anticorpos que podem se ligar a epítopos extracelulares. Mais recentemente, os métodos que envolvem a utilização de proteínas quiméricas com fluoróforos sensíveis ao pH que reagem a exposição a meios ácidos também foram empregados com sucesso 10 . No entanto, tais ensaios geralmente envolvem a expressão exógena dessas construções em linhas celulares em que a proteína de interesse não é encontrada nativamente. Essas abordagens são, no entanto, capazes de fornecer informações valiosas sobre a localização subcelular e o itinerário exocítico daProteína alvo e, portanto, deve ser usado em conjunto com as abordagens baseadas em biotinilação aqui descritas se as ferramentas estiverem disponíveis. Num ensaio de biotinilação típico, as células são primeiro lavadas completamente em PBS a 4 ° C. Isso remove qualquer vestígio de proteínas séricas introduzidas pelo meio de cultura, garantindo assim que estas não consumam quantidades excessivas de biotina no próximo passo. Mais importante ainda, a redução da temperatura faz com que a endocitose desacelere significativamente. O reagente de biotinilação é então adicionado. Em seguida, as células são lavadas novamente e depois incubadas com um tampão de extinção contendo glicina ou NH4C1, cujo objectivo é inactivar todos os vestígios restantes da biotina não reagida. As células são então lisadas, após o que é adicionada streptavidina imobilizada em agarose para precipitar as proteínas biotiniladas. A análise é comumente realizada via western blot, permitindo a expressão relativa da superfície celular de vários prOteins a serem quantificados. Devido à base deste ensaio, é adequado para uso apenas com proteínas que possuem porções expostas ao ambiente extracelular. As proteínas transmembranares multipass, que provavelmente possuem uma série de lisinas reativas dentro de suas regiões de loop, são as mais favoráveis ​​a esse método, enquanto as proteínas de passagem única tendem a ser menos suscetíveis a serem biotiniladas. Mesmo nesses casos, existe a possibilidade de que mudanças conformacionais ou interações intermoleculares ocultem certos locais reativos, resultando em um rendimento de biotinilação inferior ao esperado. Determinando a taxa de internalização das proteínas de superfície celular por biotinilação Os princípios deste ensaio são em grande parte semelhantes aos da biotinilação celular, com várias exceções, sendo o mais importante o uso de reagentes reversíveis de biotinilação. Os grupos de biotina (destes) possuem disuLigação de ligações, dentro das suas estruturas, que são suscetíveis a agentes redutores; Isto é explorado para assegurar que apenas as proteínas de superfície celular tomadas nos locais intracelulares durante o período de ensaio serão deixadas biotiniladas. Um ensaio geralmente ocorre da seguinte maneira. As células são primeiro lavadas e biotiniladas com reagentes frios, então o meio de cultura de células a 37 ° C é reintroduzido e as células são devolvidas à incubadora; Isso faz com que as proteínas de superfície celular marcadas sofram endocitose. O agente redutor de glutationa - que não pode penetrar na membrana - é então adicionado para quebrar as ligações dissulfureto das porções de biotina ligadas às proteínas que permanecem na superfície celular. Finalmente, as ligações de dissulfureto quebradas são feitas reagir com iodoacetamida, consumindo os grupos de tiolos lábeis e impedindo que as ligações se reformem. Como antes, as células são então lisadas, e as proteínas marcadas são precipitadas usando estreptavidina-agarose. O disco de limitaçõesUssed na seção anterior também se aplicam aqui devido às semelhanças compartilhadas entre os métodos. Além disso, vale a pena ter em mente que as mudanças de temperatura envolvidas neste ensaio impedem a determinação exata de quanta proteína é endocitada para cada incremento de tempo, particularmente no caso de proteínas de reciclagem rapidamente ou internamente recicladas. O ensaio, portanto, apenas fornece uma estimativa semiquantitativa das taxas endocíticas. A microscopia de fluorescência de reflexão interna total pode ser utilizada para rastrear a absorção de cada vesícula carregada e fornecer uma medida mais precisa da cinética da endocitose. Por conseguinte, pode proporcionar um complemento muito útil a este ensaio, assumindo que existe uma construção quimérica marcada de forma fluorescente da proteína de interesse 11 .

<table><tbody><tr><td>Ammonium chloride (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610404</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610729</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610611</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21335</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21331</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Bio-Rad</td><td>#163-2109</td><td></td></tr><tr><td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Thaw on ice.</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;beta;-actin antibody (AC-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;beta;-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)</td><td>Leica Biosystems</td><td>B-DG-CE</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Reduced glutathione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6529</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agarose resin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#20347</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody</td><td>Alomone</td><td>AQP-004</td><td></td></tr><tr><td>Tris base (Trizma base)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation

As proteínas de superfície celular medem uma ampla gama de funções. Em muitos casos, sua atividade é regulada por processos endocíticos que modulam seus níveis na membrana plasmática. Aqui, apresentamos protocolos detalhados para 2 métodos que facilitam o estudo de tais processos, ambos baseados no princípio da biotinilação de proteínas de superfície celular. O primeiro é projetado para permitir a determinação semi-quantitativa dos níveis relativos de uma proteína particular na superfície celular. Nele, os resíduos de lisina das proteínas da membrana plasmática das células são primeiro marcados com uma porção de biotina. Uma vez que as células são lisadas, estas proteínas podem então ser precipitadas especificamente através da utilização de estreptavidina imobilizada em agarose, explorando a afinidade natural destes últimos com a biotina. As proteínas isoladas de tal maneira podem então ser analisadas através de uma abordagem padrão de Western Blot. O segundo método fornece um meio de determinar a taxa endocítica de umaAr alvo da superfície celular durante um período de tempo. As proteínas de superfície celular são primeiro modificadas com um derivado de biotina contendo uma ligação dissulfureto clivável. As células são então deslocadas de volta para condições de cultura normais, o que provoca a absorção endocítica de uma proporção de proteínas biotiniladas. Em seguida, as ligações dissulfureto de grupos de biotina não internalizados são reduzidas usando o agente redutor impermeável à membrana glutationa. Através desta abordagem, as proteínas endocitadas podem assim ser isoladas e quantificadas com um alto grau de especificidade.

Usando a biotinilação de superfície celular para avaliar a expressão da membrana plasmática de AQP4 em astrocitos As culturas de astrocitos tratados com laminina e células de controlo não tratadas foram sujeitas a biotinilação de superfície celular usando os métodos descritos. As proteínas biotiniladas foram precipitadas com estreptavidina conjugada com agarose e depois separadas via SDS-PAGE. As frações de superfície celular foram avaliadas para AQP4 e β-dystroglycan (β-DG) como controle de carga de superfície celular, enquanto a entrada e as frações intracelulares foram transferidas para AQP4 e β-actina ( Figura 1 A ) como controle de carga. As intensidades de banda para a fração da superfície celular foram quantificadas por densitometria, e os níveis de AQP4 para cada conjunto de células foram primeiro normalizados contra os valores de β-DG, e essas proporções foram então normalizadas contra as células de controle. O histograma ( Figura 1 </strong&gt; B ) representa os valores médios ± SEM para três experiências independentes. O tratamento com laminina, em média, causa um aumento próximo de 2X no AQP4 expresso na superfície celular. Investigar a taxa endocítica de AQP4 utilizando biotinilação A endocitose AQP4 em astrocitos foi rastreada ao longo de um período de 30 min. Resumidamente, um análogo de biotina clivável foi usado pela primeira vez para rotular as proteínas de superfície em 3 pratos de astrocitos. As células foram deslocadas para 37 ° C durante 0, 15 e 30 min, respectivamente, durante as quais as proteínas marcadas foram internalizadas. O rótulo que permaneceu na superfície foi então removido usando um agente redutor, e as proteínas endocitadas foram precipitadas com estreptavidina conjugada com agarose. Após a separação via SDS-PAGE, estes foram então sondados para AQP4 ( Figura 2 A ). Os níveis de AQP4 foram quantificados usando densitometria, e os valores correspondentes naOs pontos de tempo de 15 e 30 min foram normalizados para aqueles para a amostra de 0 min. O histograma ( Figura 2 B ) representa os valores médios ± SEM para quatro dessas experiências. <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55974/55974fig1.jpg" /> Figura 1 . AQP4 Expressão na superfície celular na presença de Laminin. (A) As fracções de superfície celular, intracelular e total (Entrada) de astrócitos não tratados (-LN) e astrócitos tratados com laminina-111 (+ LN) 24 nM foram sondadas para AQP4 e β-DG. (B) Histograma ilustrando as diferenças nos níveis de superfície celular de AQP4 não tratado e astrócitos tratados com laminina, normalizados em relação aos níveis de β-DG. Os valores representam intensidades médias de pixels normalizadas ± SEM, expressas em relação aos valores das células de controle. O asterisco indica uma estatísticaUm aumento significativo no AQP4, conforme determinado por um teste t de Student de duas colas (n = 3, * p = 0,033). Esta figura foi modificada de Tham et al. 16 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55974/55974fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55974/55974fig2.jpg" /> Figura 2 . AQP4 Internalization in Astrocytes. (A) As proteínas internalizadas por culturas de astrocitos a 0, 15 e 30 min foram avaliadas para AQP4. (B) Histograma resumindo as taxas de internalização do AQP4 para 4 experimentos independentes, normalizados contra valores para o ponto de tempo de 0 min. O asterisco indica um aumento estatisticamente significante na quantidade de AQP4 endocitadas entre 15 e 30 min, conforme determinado por duas caudasEd teste t de Student (n = 3, * p = 0,017). (C) Quando a glutationa é utilizada para quebrar a ligação dissulfureto no análogo de biotina clivável, a contribuição da superfície celular AQP4 para a fracção biotinilada é acentuadamente reduzida, resultando numa clara diferença entre as amostras de 0 e 15 min (C, superior esquerda ) . Quando esta etapa é omitida, o sinal proveniente do pool de superfície celular torna a mudança entre os 2 pontos de tempo indetectáveis (C, canto superior direito) . Esta figura foi modificada de Tham et al. 16 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55974/55974fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

São apresentados neste relatório dois métodos baseados em biotinilação, projetados para determinar a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas expressas na membrana plasmática.

Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

determining-cell-surface-expression-endocytic-rate-proteins-primary

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K visualizações.  University of British Columbia.  São apresentados neste relatório dois métodos baseados em biotinilação, projetados para determinar a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas expressas na membrana plasmática. 

Vídeo: Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biologia

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Rotulagem diferencial de superfície celular e internalizado Proteínas após Anticorpo Alimentação da Vivo Cultivadas neurônios

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Neurociência

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Taxas de medição de plasma Proteína de membrana endocítica por Biotinilação reversível

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population of surface-expressed receptors is constantly adapting and subject to strict mechanisms of regulation. The paradigmatic example and one of the most studied trafficking events in biology is the regulated control of the synaptic expression of glutamate receptors (GluRs). GluRs mediate the vast majority of excitatory neurotransmission in the central nervous system and control physiological activity-dependent functional and structural changes at the synaptic and neuronal levels (e.g., synaptic plasticity). Modifications in the number, location, and subunit composition of surface expressed GluRs deeply affect neuronal function and, in fact, alterations in these factors are associated with different neuropathies. Presented here is a method to study GluR trafficking in dissociated hippocampal primary neurons. An &#34;antibody-feeding&#34; approach is used to differentially visualize GluR populations expressed at the surface and internal membranes. By labeling surface receptors on live cells and fixing them at different times to allow for receptors endocytosis and/or recycling, these trafficking processes can be evaluated and selectively studied. This is a versatile protocol that can be used in combination with pharmacological approaches or overexpression of altered receptors to gain valuable information about stimuli and molecular mechanisms affecting GluR trafficking. Similarly, it can be easily adapted to study other receptors or surface expressed proteins.

This article presents a method to study glutamate receptor (GluR) trafficking in dissociated primary hippocampal cultures. Using an antibody-feeding approach to label endogenous or overexpressed receptors in combination with pharmacological approaches, this method allows for the identification of molecular mechanisms regulating GluR surface expression by modulating internalization or recycling processes.

Uma abordagem de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in brain homeostasis, astrocytes supply neurons with vital metabolites and buffer extracellular water, ions, and glutamate. An integral component of the &#8220;tri-partite&#8221; synapse, astrocytes are also critical in the formation, pruning, maintenance, and modulation of synapses. To enable these highly interactive functions, astrocytes communicate among themselves and with other glial cells, neurons, the brain vasculature, and the extracellular environment through a multitude of specialized membrane proteins that include cell adhesion molecules, aquaporins, ion channels, neurotransmitter transporters, and gap junction molecules. To support this dynamic flux, astrocytes, like neurons, rely on tightly coordinated and efficient intracellular transport. Unlike neurons,&#160;where intracellular trafficking has been extensively delineated, microtubule-based transport in astrocytes has been less studied. Nonetheless, exo- and endocytic trafficking of cell membrane proteins and intracellular organelle transport orchestrates astrocytes&#8217; normal biology, and these processes are often affected in disease or in response to injury. Here we present a straightforward protocol to culture high quality murine astrocytes, to fluorescently label astrocytic proteins and organelles of interest, and to record their intracellular transport dynamics using time-lapse confocal microscopy. We also demonstrate how to extract and quantify relevant transport parameters from the acquired movies using available image analysis software (i.e., ImageJ/FIJI) plugins.

Here we describe an in vitro live-imaging method to visualize intracellular transport of organelles and trafficking of plasma membrane proteins in murine astrocytes. This protocol also presents an image analysis methodology to determine cargo transport itineraries and kinetics.

Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Cell-surface Biotinylation Assay

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively sequestered in the cytoplasm. Once within a cell, these surface proteins can be either destroyed or &#8220;recycled&#8221; back to the membrane. The cell surface biotinylation assay provides researchers with a way to study these phenomena. The technique makes use of a derivative of the small molecule biotin, which can label surface proteins and then be chemically cleaved. However, if the surface protein is endocytosed, the biotin derivative will be protected from cleavage. Thus, by analyzing the uncleaved, endocytosed biotin label, scientists can assess the amounts of internalized surface proteins.In this video, we review the concepts behind the biotinylation assay, delving into the chemical structure of the biotin derivative and the mechanism of its cleavage. This is followed by a generalized protocol of the technique, and finally, a description of how researchers are currently using it to study the dynamics of different cell surface proteins.

Ensaio de Biotinilação de Superfície Celular

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively ...

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Assessing the Internalization of  Target Surface Proteins Using a Biotin Derivative

Source: Tham, D. K. L., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55974">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a method to assess target protein internalization in the mouse cortical astrocytes using biotinylation, followed by cell lysis, streptavidin-based protein extraction, denaturation, and Western blot analysis to confirm successful internalization.

Avaliação da internalização de proteínas de superfície alvo usando um derivado de biotina

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Determining Internalization ...