Name: induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos
Uploaded: 2017-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo apoio do Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z a WAH e a bolsa DFG KH 376 / 1-1 concedida a HK

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Cambridge. 1. Manutenção de animais <ol><li> Embriões de sapo NOTA: Os embriões podem ser criados e mantidos de acordo com o animal e instalações laboratoriais. Aqui, um exemplo da manutenção animal é descrito. <ol><li> Preparar solução de solução Barth&#39;s Solution (MBS) de 0,1x: NaCl 0,88 mM, KCl 10 uM, NaHCO3 24 uM, HEPES 100 μM, MgSO4 8,2 μM, Ca (NO3) 2 , 3,3 μM e CaCl2 a 4,1 uM, pH 7,6 . </li><li> Obter embriões Xenopus laevis por adubação in vitro . <ol><li> Induzir a ovulação em sapos africanos de raparigas africanas ( Xenopus laevis) por injeção com gonadotrofina sérica da maria grávida uma semana (60 UI) e 12 h (500 UI) antes da postura do ovo. </li><li> Recolher oócitos e fertilizá-los in vitro com testículo masculino homogeneizado. </li><li> RaiEmbriões em 0.1x MBS a 16 - 18 ° C. Etapa os embriões de acordo com a tabela Normal de Xenopus laevis 14 . Tome cuidado para selecionar embriões inteiros e vivos para a experiência. </li></ol></li></ol></li><li> Embriões de peixe-zebra NOTA: Os embriões podem ser criados e mantidos de acordo com o animal e instalações laboratoriais. Aqui, um exemplo da manutenção animal é descrito. <ol><li> Preparar meio de embrião: NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, CaCl2 0,33 mM, MgSO4 0,33 mM e azul de metileno 0,00001%. </li><li> Manter e produzir WT AB cepa Danio rerio a 26,5 ° C. </li><li> Recolher os embriões na manhã da adubação, aumentar até 4 dias após a adubação (dpf) a 28 ° C em meio de embrião preparado como descrito acima, selecionar e andar como descrito anteriormente 15 . </li></ol></li></ol> 2. Indução da hipoxia in vivo </P&gt; <ol><li> Construção da câmara de incubação de gás <ol><li> Use um tanque aquático de reprodução ( Figura 1A ) que é normalmente usado na instalação de peixes para construção de câmara hipóxico. Este tanque deve caber uma placa de 24 poços. </li><li> Prepare uma placa de 24 poços com fundo de malha, conforme descrito na Figura 1 . Remova o fundo de plástico da placa de 24 poços ( Figura 1B ), por exemplo , usando uma fresadora para este fim. </li><li> Preencha o espaço entre o plástico dos poços e as paredes da placa com resina epoxi. Anexe qualquer filtro de nylon ( Figura 1C ) com um diâmetro de malha de 0,1-0,2 mm ao plástico revestido com resina e deixe a placa ser completamente seca. </li><li> Uma vez seco, perfure três ou quatro túneis ( Figura 1D ) de 10 mm de comprimento e 5 mm de diâmetro nas paredes de placas revestidas com resina e malha. Anexar barras de plástico ou teflon( Figura 1E ) de diâmetro apropriado e 30 mm de comprimento para os túneis e coloque a placa no tanque de escolha. </li><li> Coloque a placa de 24 poços de malha no tanque aquático de escolha. Usando a tubulação de silicone ( Figura 1F ), prenda um tanque de gás ( Figura 1G ) com a mistura O 2 / N 2 desejada ou outra mistura de gás de escolha para uma válvula distribuidora ( Figura 1H ) usando um regulador de gás apropriado (IOC) (BOC 200 Barra). Aqui, use tanques de gás contendo uma mistura de 5% de oxigênio e 95% de N 2 nas experiências de hipóxia apresentadas aqui. </li><li> Ajuste o caudal de oxigênio no meio da câmara para 0,0017-0,0019 metros cúbicos por segundo. Sob esta taxa de fluxo de gás, nenhum perigo do meio deve ser visto nos poços da placa. <ol><li> Utilize o regulador de gás de duas fases de alta pureza para este fim. Defina o regulador para reduzir a pressão interna doE tanque de gás (1000 - 2500 PSI) a uma pressão de entrega de 10 PSI durante todo o experimento. Assim, de acordo com as especificações deste regulador de gás, um fluxo de 0,00189 metros cúbicos por segundo foi alcançado durante todo o experimento. </li></ol></li><li> Conecte a tubulação de silicone e a válvula de distribuição a um difusor de disco cerâmico ( Figura 1J ) dentro do tanque aquático. Feche o tanque aquático e selar com cuidado a tampa, revesti-lo com graxa de silicone ( Figura 1K ) (compare com a Figura 1 ). Se for necessária uma temperatura não-ambiente específica, coloque a câmara hipóxica em uma incubadora de laboratório da temperatura desejada. </li><li> Dependendo do tipo de embriões utilizados no experimento, encha o tanque de câmara hipóxico com o meio de embrião apropriado e comece a difundir a mistura de gás através do difusor de disco cerâmico. Equilibre-se por 10-15 min. </li><li> Após o equilíbrio com oE desejada mistura de oxigênio, medir a concentração de oxigênio na água usando um oximetro ou sonda de oxigênio. Aqui, use um oxímetro com o sensor de temperatura e oxigênio dissolvido em fibra óptica para este fim. </li></ol></li><li> Indução de hipoxia em embriões <ol><li> Selecione cuidadosamente os embriões para o experimento, use embriões inteiros e vivos para a incubação de hipoxia. Aqui, nós embriões de sapo do estágio 38 ou embriões de peixe zebra 4 dpf nos experimentos aqui apresentados. </li><li> Coloque os pratos de embrião na incubadora ( Figura 1K ) contendo a câmara de incubação de gás e deixe-os equilibrar à temperatura da incubadora. </li><li> Transmita cuidadosamente os embriões nos poços da placa de 24 poços mesclado ( Figura 1B ) da câmara de incubação de gás, usando uma pipeta de plástico. Use sempre uma pipeta de plástico para transferência de embriões ao longo do protocolo. NOTA: Cada poço desta placa pode conterPara 5 embriões de sapo do estágio 38 ou até 7 embriões de peixe cebre de 4 dpf. Rotule os poços com cuidado se estiver usando diferentes genótipos. </li><li> Manter a câmara de incubação de gás sob uma infusão constante com a mistura gasosa de escolha por 5 h ou por um período mais longo que se adapte à experiência. Use uma mistura de 5% de O2 e 95% de N2 aqui. </li><li> Transfira cuidadosamente os embriões da câmara de incubação de gás de volta ao meio normoxico correspondente ao tipo de embrião e continue imediatamente com os Passos 3 ou 4. </li><li> Se for necessário um tratamento normoxico adicional, transfira cuidadosamente os embriões para o meio normoxídico correspondente ao tipo de embrião. </li></ol></li></ol> 3. Controle da Indução de hipoxia bem sucedida monitorando os níveis de HIF-1α <ol><li> Preparativos <ol><li> Prepare 0,4 mg / ml de solução de MS222 em 0,1 x MBS. </li><li> Prepare o tampão de homogeneização: Compre o buffer de ensaio Radioimmunoprecipitation (RIPA bUffer) para a homogeneização do tecido e suplementar a quantidade de tampão necessária para a sua experiência com Inibidor de Protease para uma concentração final de 1: 100 v / v. </li><li> Prepare soluções para Western blot. <ol><li> Preparar tampão de carga de gel Laemmli 4x: Tris 425 mM pH 8,0, 40% v / v Glicerol, SDS a 8% v / v, 4% v / v de beta-mercaptoetanol, 0,5% p / v Bromofenol Azul, volume total de 10 mL ddH 2 O. </li><li> Preparar 5x tampão de corrida: 15 g de base de Trizma, 72 g de glicina, 5 g de SDS, volume total de 1 L ddH 2 O. </li><li> Preparar buffer de transferência: 2,66 g de base de Trizma, 14,4 g de glicina, 200 mL de metanol a 100%, volume total de 1 L ddH 2 O. </li><li> Preparar 10% TBST: 5 ml de Tris 1 M pH 8,0, 30 mL de NaCl 5 M, 2,5 mL de Tween 20, 1 volume total de H 2 O. </li><li> Prepare a solução de bloqueio: 4% p / v de leite em pó desnatado em 1x TBST. </li></ol></li></ol></li><li> Coleção de tecido <ol><li> Anestesiar os embriões tomando banho na solução MS222 a 0,4 mg / mL16 , 17 e transferi-los para um tubo de reação de plástico preenchido com tampão de homogeneização usando uma pipeta de plástico. Use 20 μL de tampão por embrião. Note-se que pelo menos 5 embriões de rã de estágio 38 ou 7 embriões de peixe-zebra de 4 dpf são necessários para determinar uma alteração significativa nos níveis de proteína HIF1α. </li><li> Homogeneizar o tecido usando um homogeneizador de tecido apropriado ou um sonicador. Remova os restos por centrifugação (15 min; 13,000 xg; 4 ° C). <ol><li> Alternativamente, dissecar as retinas dos embriões de sapo anestesiados 17 e homogeneizar como acima. Use 20 μL de tampão de homogeneização por 10 retinas. </li></ol></li><li> Pegue o sobrenadante utilizando uma pipeta, desnaturar a 85 ° C durante 5 minutos e suplementar com tampão de carga de gel de Laemmli até uma concentração final de 1x v / v ( por exemplo , adicionar 5 μL de tampão 4x Laemmli a 15 μL de homogeneizado). Use este sobrenadante para o WesTern blot ou congelar as amostras a -20 ° C. </li></ol></li><li> Western Blot <ol><li> Carregue as amostras preparadas como descrito no Passo 3.2 em um gel pré-moldado de 12% em um sistema de eletroforese usando 1x v / v Tampão de corrida. Use uma escada de proteína para determinação do tamanho da proteína. Transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose (membrana de 0,45 μm) em tampão de transferência durante 1 h embalado em gelo a 4 ° C, de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Bloqueie locais de ligação inespecíficos incubando a membrana em tampão de bloqueio durante 60 min. Siga com 3 x 10 min lavagens em 1x TBST. </li><li> Incubar a membrana em soluções de anticorpo anti-HIF-1a de coelho e anti-α-tubulina de rato diluídas 1: 100 v / v e 1: 5000 v / v, respectivamente, em solução de bloqueio, durante 2,5 h à TA. Siga com 3 x 10 min lavagens em 1x TBST. </li><li> Para detecção, incubar em anticorpos de cabra anti-coelho e conjugado anti-camundongo de cabra diluídos 1: 1000 v / v em solução de bloqueio durante 1 h.Siga com 3 x 10 minutos de lavagem em 1x TBST e visualize a coloração HRP usando um kit comercial e uma máquina de revelação de escolha. </li><li> Quantifique a quantidade de proteína HIF1α usando a quantificação digital. </li></ol></li></ol> 4. Monitoramento da proliferação celular na hipóxia <ol><li> Preparativos <ol><li> Prepare solução de EdU 5 mM no meio embrionário de escolha. A solução pode ser usada imediatamente ou dividida em alíquotas e armazenada a -20 ° C por até 6 meses. </li><li> Preparar salina tamponada com fosfato (PBS) ou comprar PBS a partir de recursos comerciais. Autoclave durante 10 minutos a 115 ° C. </li><li> Prepare soluções para a detecção de incorporação de EdU. <ol><li> Preparar solução de fixação: 4% v / v de solução de reserva de formaldeído a 16% em PBS. </li><li> Preparar solução de sacarose: 30% p / v de sacarose em PBS. </li><li> Preparar PBST: 0,1% v / v Triton X-100 em PBS. </li><li> Preparar solução de bloqueio: 10% v / v Soro de cabra inactivado pelo calor (HIGS) no PBST. </li><li> Preparar a solução DAPI: 1: 1000 v / v 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBST. </li></ol></li></ol></li><li> Incubação de embriões em hipoxia para incorporação de EdU <ol><li> Preencha a câmara de incubação de gás com 400-500 mL de solução de EdU 5 mM suplementada com DMSO a 1% v / v. Pré-equilibre a solução com a mesma mistura de gás utilizada no experimento durante 15 minutos antes da experiência. Note-se que o volume da solução de incubação pode ser minimizado através da fixação de varas mais curtas ( Figura 1E ) à placa inferior de malha. </li><li> Conecte o tubo de gás ao cilindro de gás contendo uma mistura de gás de 5% de O2 e 95% de N2. Incube a solução por 15 min. </li><li> Transfira os embriões para a câmara hipóxica, distribuindo-os uniformemente entre os poços e incubar durante 2 h. Cada poço pode acomodar até 5 embriões de sapo do estágio 38 ou até 7 embriões de peixe cebre 4 dpf. </li><li> Analisar o embriãoS para incorporação de EdU. </li></ol></li><li> Curso temporal de incubação embrionária em hipoxia e incorporação de EdU <ol><li> Preencha a câmara de incubação com 500 ml de meio embrionário de escolha. Conecte o tubo de gás ao cilindro de gás contendo uma mistura de gás de 5% de O2 e 95% de N 2 e equilibre o meio com a mistura de gás durante 15 min. </li><li> Transfira os embriões para a câmara hipóxica, distribuindo-os uniformemente entre os poços e incubar durante o período de tempo desejado até 48 h. Durante as últimas 1 h, substitua o meio embrionário com solução EdU 5 mM suplementada com DMSO a 1% v / v. </li><li> Transfira os embriões de volta para o prato normoxic e analise a incorporação de EdU. </li></ol></li><li> Detecção e análise de incorporação de EdU <ol><li> Anestesiar os embriões tomando banho em solução de MS222 a 0,4 mg / mL. </li><li> Transfira os embriões para um frasco de vidro apropriado e conserte incubando na solução de Fixação por 2 haT RT ou O / N a 4 ° C. Siga com 3 x 10 min lavagens em PBS. Transferir cuidadosamente os embriões para a solução de sacarose para a crioproteção tecidual. Incubar durante 4 h ou até que os embriões afundem no fundo do frasco de vidro. </li><li> Incorporar os embriões em meio de incorporação (composto de temperatura de corte ideal). Blocos de criosecção com embriões imediatamente ou armazenar até 14 d a -80 ° C. </li><li> Cryosecção os blocos contendo embriões usando um criostato. Coletar secções de 12 μm (embriões de peixe zebra) ou 16 μm (embriões de sapo) em lâminas de microscópio e deixar secar. Processe criosecções imediatamente ou armazene a -20 ° C por até 3 meses. </li><li> Detectar incorporação de EdU por coloração imunofluorescente usando um kit de química comercial. Prepare a quantidade de EdU Reaction Mix necessária para o número de criosecções no experimento, conforme descrito pelo fabricante. <ol><li> Para 500 μL de EdU Reaction Mix, use 430 μL de 1X EdU reaction buffer, 20 μL de CuSO 4 , 1,2 μL de azida de Alexa Fluor, 50 μL de aditivo de tampão EdU 1X. </li></ol></li><li> Lave as criosecções uma vez com PBS para remover o meio de incorporação e 3 x 5 min com PBST para permeabilizar o tecido. Incubar as criosecções na solução de bloqueio por 30 min. </li><li> Incubar as criosecções com o EdU Reaction Mix por 1 h e seguidas de 3 x 10 min lavagens em PBST. Costeie as criosecções com solução de DAPI durante 15 min, seguido de lavagens de 3 x 10 minutos em PBST. Monte as lâminas com criosecções coloridas em meio de montagem, cubra com lamínulas e deixe secar antes de analisar sob um microscópio fluorescente ou armazenando a 4 ° C por até 1 ano. </li><li> Analise as criosecções com coloração anti-EdU sob um microscópio de varredura confocal invertido e determine o número de células positivas para EdU usando a quantificação digital. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui apresentamos um novo método fácil, mas robusto, para induzir hipoxia que é ajustada para uso com embriões de sapo e zebra, mas também pode ser adequada para outros organismos aquáticos. A principal vantagem deste método reside na sua simplicidade e eficiência de custos. No entanto, os resultados obtidos com este método são muito robustos. Mostramos que a hipoxia pode ser induzida eficientemente na câmara tanto em embriões inteiros quanto em tecido específico - aqui, retinas. Para determinar a eficácia...

A pesquisa de hipoxia tem inúmeras aplicações. Estes incluem a investigação da patogênese e o desenvolvimento de tratamentos para condições médicas caracterizadas por hipoxia 1 e doença aguda de alta altitude 2 . O estresse hipóxico causa grandes alterações metabólicas em todos os organismos que necessitam de oxigênio. O estresse hipóxico também influencia o crescimento e desenvolvimento fetal e a patogênese de várias doenças humanas, incluindo a restrição do crescimento intra-uterino 3 . O estresse hipoxico não só pode levar a um menor peso ao nascer, mortalidade fetal e neonatal, mas também pode resultar em muitas complicações na vida adulta, como doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, obesidade e hipertensão 4 . O estresse hipóxico também é freqüentemente observado durante o desenvolvimento de tumor sólido, quando o tecido tumoral ultrapassa o suprimento de sangue. Por conseguinte, é crucial poder estudar os efeitos da hipóxia in vivo e directamente durante o embrião<html> Desenvolvimento yônico. Entre os métodos mais bem conhecidos que foram empregados para estudar os efeitos da hipoxia durante o desenvolvimento é o uso de cloreto de cobalto no meio de crescimento ou a incubação do organismo em uma câmara hipóxica. O cloreto de cobalto induz artificialmente uma resposta hipóxica sob a concentração normal de oxigênio, devido ao seu papel na estabilização do alfa de factor 1 induzível pela hipoxia (HIF-1a), prevenindo sua degradação proteossômica 5 , 6 , 7 . No entanto, sendo um método conveniente 8 , o uso de cloreto de cobalto, bem como outros miméticos de hipóxia química semelhantes, podem ter efeito deletério inespecífico sobre células e tecidos, por exemplo , apoptose 9 . Portanto, as câmaras hipóxicas são um método melhor para a indução de &quot;hipoxia natural&quot; em organismos vivos ao longo do desenvolvimento normal. Nós nos concentramos no desenvolvimento de um sistema de indução de hipoxia em embriões de animais aquáticos, tanto os sapos quanto o peixe-zebra tornaram-se organismos modelo informativos de vertebrados para estudos de numerosos processos biológicos, bem como modelos para várias doenças humanas. Embriões de sapo e zebra Desenvolver externamente, eliminando a complicação da compensação materna. Além disso, um rápido processo de desenvolvimento permite manipular fatores ambientais e observar as mudanças fenotípicas na formação de órgãos em tempo real. Além disso, muitos componentes das principais direções de transdução de sinal são altamente conservados em Esses organismos modelo e foram caracterizados em detalhes por uma grande quantidade de literatura. A principal vantagem no uso de sapos e embriões de peixe-zebra para estudar os efeitos da hipóxia no desenvolvimento de vertebrados é que todos os processos podem ser monitorados diretamente, já que o oxigênio penetra rapidamente nos embriões. Assim, em sapos e peixe-zebra, como em contraste com outros organismos modelo, comoEmbriões de camundongo, a influência de uma concentração específica de oxigênio pode ser estudada no tecido de interesse, sem levar em consideração a presença ou falta de vasculatura funcional. A maioria das configurações comercialmente disponíveis para incubação hipóxica tem a desvantagem de ser comparativamente grande e ter custos de funcionamento correspondentemente elevados. Além de seu alto custo inicial e consumo de gás, equilíbrio e manutenção de câmaras de hipoxia comuns requer manutenção de atmosfera hipoxica constante contra o gradiente de gás que ocorre naturalmente nestas câmaras devido ao seu maior tamanho e / ou respiração do organismo. Isso requer emprego de ventiladores de gás e um sistema de resfriamento, o que aumenta a quantidade de equipamentos necessários adicionais, impede a destreza do pesquisador e diminui a simplicidade do procedimento experimental. Em contraste, a configuração que apresentamos aqui é comparativamente robusta, mas muito econômica, pequena, fácil de estabelecer e permite que fEquilíbrio de gás, atmosfera hipóxica estável e troca simples de materiais e soluções dentro da câmara. Nosso sistema pode ser empregado para uso com qualquer organismo modelo aquático de interesse. Nós construímos uma câmara hipóxica que é convenientemente pequena e, portanto, pode ser colocada dentro de uma incubadora comum de laboratório, que permite facilmente procedimentos experimentais a qualquer temperatura específica. Fornecer um controle conveniente da temperatura, bem como a concentração de oxigênio no meio, a vantagem do nosso sistema contra as incubadoras de hipoxia comercialmente disponíveis reside no seu pequeno tamanho e eficiência de custos. Assim, nossa configuração pode ser estabelecida usando suprimentos laboratoriais gerais disponíveis para a maioria dos laboratórios de pesquisa e não exige materiais caros. Além disso, nossa configuração não gera calor, ao contrário das incubadoras de hipoxia comercialmente disponíveis, e permite o uso a temperaturas inferiores à temperatura ambiente colocadas em uma incubadora. A laSt é especialmente crítico para o trabalho com organismos de sangue frio, como sapos e peixes, onde as taxas de desenvolvimento e metabólicas são fortemente dependentes da temperatura. Sendo muito rentável e facilmente construído, a nossa câmara de incubação de gás é, no entanto, muito versátil no estabelecimento de várias condições hipóxicas ou hiperóxicas, além de permitir uma administração rápida e fácil de diferentes meios e soluções para uma grande quantidade de condições experimentais. Além disso, empregando uma placa de 24 poços em vez de pratos comumente usados ​​ou tanques de laboratório 10 , 11 , 12 , nosso sistema permite a observação e tratamento experimental de várias condições mutantes ao mesmo tempo. Para controlar a indução correta de hipoxia, monitoramos os níveis da proteína HIF-1a por detecção de Western Blot. Além disso, o número de células que proliferam antes e depois da incubaçãoN na câmara hipóxica pode ser usado para determinar se a hipóxia foi induzida no tecido. Este método baseia-se nos resultados publicados anteriormente 13 , mostrando que a proliferação no nicho das células-tronco da retina embrionária diminui após a indução da hipoxia. Assim, monitorizamos o nível de proliferação de células estaminais da retina por adição de 5-etinil-2&#39;-desoxiuridina (EdU) ao meio embrionário e medindo sua incorporação no DNA de células que proliferam recentemente.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>KCl/0.1x MBS, Embryo mediu,</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>0.1x MBS</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Calcium nitrate</td><td>Sigma</td><td>202967</td><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Embryo medium</td></tr><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>CG10</td><td>Frog fertilization</td></tr><tr><td>Zebrafish breeding tank</td><td>Carolina</td><td>161937</td><td>Gas chamber construction</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction</td></tr><tr><td>Epoxy resin</td><td>RS Components UK</td><td>Kit 199-1468</td><td></td></tr><tr><td>Gas distributor valve</td><td>WPI Luer Valves</td><td>Kit 14011</td><td>Aquatic tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>High precision gas valve</td><td>BOC&amp;nbsp;</td><td>200 bar HiQ C106X/2B</td><td>Gas tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;I&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>5% oxygen and 95% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>BOC</td><td>226686-L</td><td>Hypoxic gas mixture</td></tr><tr><td>ceramic disc diffuser</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Art&amp;nbsp;</td><td>Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;J&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>silicone grease</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>VAC1100</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;K&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>oxymeter</td><td>Oxford Optronix&amp;nbsp;</td><td>Oxylite, CP/022/001</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>fibre-optic dissolved oxygen sensor</td><td>Oxford Optronix</td><td>HL_BF/OT/E</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>plastic pasteur pipette</td><td>Sterilin</td><td>STS3855604D</td><td>For embryo transfer</td></tr><tr><td>MS222&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>Embryo anesthetic</td></tr><tr><td>RIPA buffer&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R0278-50ML</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>4x Laemmli loading buffer, 10x TBST</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer</td></tr><tr><td>beta-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td>10x TBST</td></tr><tr><td>skim milk powder</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td>Blocking Solution</td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge tube</td><td>Sigma</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>tissue homogenizer</td><td>Pellet Pestle Motor Kontes</td><td>Z359971</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>pellet pestles</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>precast 12% gel</td><td>Biorad</td><td>Mini-ProteinTGX, 456-1043</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>protein ladder</td><td>Amersham</td><td>Full-Range Rainbow ladder, RPN800E</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>nitrocellulose membrane (0.45 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-HIF-1&amp;alpha; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab2185</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-&amp;alpha;-tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T6074</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-mouse antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97080</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Pierce ECL 2 reagent&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>80196</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>ECL films Hyperfilm</td><td>GE Healthcare Amersham</td><td>28906837</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>5-Ethynyl-2&amp;prime;-deoxyuridine &amp;nbsp;</td><td>santa cruz</td><td>CAS&amp;nbsp;61135-33-9</td><td>EdU, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>1x</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Fixation solution</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fluka</td><td>S/8600/60</td><td>Solution solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>PBST</td></tr><tr><td>Heat-inactivated Goat Serum (HiGS)</td><td>Sigma</td><td>G6767-100ml</td><td>Blocking solution (EdU incorporation)</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation</td></tr><tr><td>glass vial</td><td>VWR</td><td>98178853</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Tissue-Plus optimal cutting temperature compound&amp;nbsp;</td><td>Scigen</td><td>4563</td><td>Embedding medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>cryostat Jung Fridgocut 2800E</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3035S</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>microscope slides Super-Frost plus Menzel glass</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>EdU Click-iT chemistry kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>FluorSave</td><td>Calbiochem</td><td>D00170200</td><td>Mounting medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>coverslips</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr></tbody></table>

induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos

Aqui, apresentamos um novo sistema de indução de hipoxia, que desenvolvemos para estudar os efeitos da hipóxia em organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema compreende uma câmara com uma configuração simples que, no entanto, é robusta para induzir e manter uma concentração específica de oxigênio e temperatura em qualquer solução experimental de escolha. O sistema apresentado é muito econômico, mas altamente funcional, permite a indução e sustentação da hipoxia para experiências diretas in vivo e por vários períodos de tempo até 48 h. Para monitorar e estudar os efeitos da hipóxia, empregamos dois métodos - aferição de níveis de fator 1alpha (HIF-1α) induzível por hipoxia em embriões inteiros ou tecidos específicos e determinação da proliferação de células estaminais da retina por 5-etinil-2&#39;- Incorporação de desoxiuridina (EdU) no DNA. Os níveis de HIF-1α podem servir como marcador de hipoxia geral em todo o embrião ou tecidoDe escolha, aqui retina embrionária. A incorporação de EdU nas células de proliferação da retina embrionária é uma produção específica de indução de hipoxia. Assim, mostramos que os progenitores de retina embrionária hipóxica diminuem a proliferação dentro de 1 h de incubação sob 5% de oxigênio de embriões de sapo e zebrafish. Uma vez dominado, nossa configuração pode ser empregada para uso com pequenos organismos modelo aquáticos, para experiências diretas in vivo , qualquer período de tempo e sob concentração de oxigênio normal, hipóxica ou hiperóxica ou sob qualquer outra mistura de gás.

Empregar o sistema de câmara hipoxica que apresentamos aqui permite o estudo dos efeitos da hipoxia individual e in vivo em animais vivos inteiros. A hipoxia pode ser induzida colocando embriões inteiros de sapo ou zebra na câmara hipóxica ( Figura 1 ), e deve ser realizada em diferentes combinações de condições. Uma imagem da nossa configuração completa da câmara de gás é mostrada na Figura 2 . Nós monito...

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Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Apresentamos um novo sistema de câmara hipóxico para uso com organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema é simples, robusto, econômico e permite a indução e sustentação da hipoxia in vivo e até 48 h. Apresentamos 2 métodos reprodutíveis para monitorar a eficácia da hipoxia.

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K visualizações.  University of Cambridge.  Apresentamos um novo sistema de câmara hipóxico para uso com organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema é simples, robusto, econômico e permite a indução e sustentação da hipoxia in vivo e até 48 h. Apresentamos 2 métodos reprodutíveis para monitorar a eficácia da hipoxia. 

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Biologia do Desenvolvimento

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biologia

Investigando o desenvolvimento com manipulação de sinalização optogenética em peixe-zebra

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Autor em destaque: Manipulando a sinalização em embriões de peixe-zebra para decodificar decisões de destino celular 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Ativação da Sinalização Optogenética em Embriões de Zebrafish

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Provocando estresse celular e morte utilizando convencional UV laser microscopia confocal

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Neurociência

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Resumo

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Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Ativação da Sinalização Optogenética em Embriões de Zebrafish

Ativação da Sinalização Optogenética em Embriões de Zebrafish

Ativação da Sinalização Optogenética em Embriões de Zebrafish

Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

Provocando estresse celular e morte utilizando convencional UV laser microscopia confocal

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish