Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder DP2OD008470.

Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na Universidade de Notre Dame. Preparação de Solução de Ringer 1. <ol><li> Adicione uma solução de NaCl 116 mM, KCl 2,9 mM, 3,6 mM de CaCl 2, 5 mM de Hepes e com ultrapura H 2 O por meio de agitação contínua para evitar qualquer precipitação de sal. </li><li> Após a adição de sais e enquanto a solução ainda está agitação, adicionar 100 unidades / ml de penicilina e por 100 g de estreptomicina por ml. </li><li> Depois de adicionar todos os antibióticos e sais, realizar a esterilização filtro da solução e guarde em recipiente estéril. Nota: N-feniltioureia (1-fenil-2-tioureia) ou PTU pode ser adicionado à solução de Ringer para bloquear a formação de pigmento na grânulo embriões implantados sem consequências negativas para a saúde do embrião. Para preparar solução de bloqueio / pigmentação de Ringer, use uma concentração de 0,003% PTU. Devido à baixa concentração de UTP a ser adicionado é aconselhável que um maior volume de Solução de Ringer ser feita, pelo menos, um L, para evitar a adição de quantidades minúsculas de pó PTU. Adicionar PTU durante a etapa 1.2, enquanto a solução é agitação. </li></ol> 2. Preparação de Solução tricaina <ol><li> Adicionar 2 g de cloridrato de 3-aminobenzoato de sal metanossulfonato de (tricaina) por L de solução mais 0,1 M de Tris, a partir de um estoque 1 M equilibrada para um pH de 9.5 e fez ultrapura com H 2 O. Nota: tricaina será usado para sacrificar os embriões de peixe-zebra no ponto de tempo desejado para ensaiar fenótipos implantação do grânulo. </li></ol> 3. Preparação de Solução E3 <ol><li> Adicione uma solução de 0,25 M de NaCl, 10 mM de KCl, 12,5 mM de CaCl2, e 16,6 mM de MgSO 4 para 1 L de água ultrapura para criar 1 L de E3. </li><li> Adicionar 200 ul de azul de metileno à solução de E3 para inibir o crescimento de fungos. </li></ol>4. Needles que puxam para Microbead Transferência <ol><li> Use fogo polido vidro de borosilicato com filamento a uma DO: 1,0 mm ID: 0,5 mm, com um comprimento de 10 cm. </li><li> Coloque vidro borosilicated em um extrator micropipeta para preparar agulhas finas. Nota: Os quatro dimensões que se seguem podem ser utilizados como um ponto de partida para puxar as agulhas: Calor = 540, Pull = 245, velocidade = 200, Tempo e = 125. </li><li> Depois de puxar um número adequado de agulhas, armazenar em plástico coberto placas de petri, posicionados em tiras de massa de modelar ou fita adesiva para evitar a quebra da ponta da agulha, até o uso. </li><li> Para cortar a ponta da agulha para o diâmetro desejado, usar um par de fórceps finos para marcar a extremidade da agulha. Nota: diâmetro da agulha pode variar, dependendo do tamanho micropérola a ser utilizado, bem como as preferências de manuseamento utilizador. Um bom ponto de partida é diâmetros ofício em um intervalo entre 100 e 200 mm se microesferas que vão 50-100 mm será utilizado. </li><li> Prior de usar, inserir a agulha aparado no suporte do tubo capilar para formar o instrumento de transferência microbead concluída. </li></ol> 5. Bigode / Lash ferramenta de preparação <ol><li> Obter um triz, chicote, ou outra peça ainda pequena empresa de filamento de cabelo natural ou sintético. Cortar perto da base do filamento num ângulo de 45 °. Aderir a suiça a uma ponta micropipeta P-1000 usando cola permanente adesivo transparente. </li></ol> 6. Microbead Implantação Bandeja Preparação <ol><li> Misturar 2 g de agarose com 100 ml de solução de E3 para fazer um 2% de gel de agarose E3. </li><li> Aquece-se a solução de agarose a 2% durante 1 minuto e 30 segundos num balão de Erlenmeyer de 250 mL, agitando o frasco a cada 30 segundos, a fim de evitar que o gel de borbulhando. </li><li> Tirar a tampa de 60 mm x 15 milímetros placa de Petri e coloca-se numa maior 150 milímetros x 15 milímetros prato com o interior voltado para cima. </li><li> Despeje o gel de agarose quente na 150 milímetros x 15 mm placa de Petri, certificando-se de ancorar-sea tampa da placa de menor com o dedo indicador. Nota: Permitir uma fina camada de agarose de baixo da tampa do prato menor para remover a condensação que se formam quando se vaza o gel; isso fará com que as contas mais fáceis de ver sob um microscópio de dissecção. </li><li> Como a agarose arrefece, mas antes que solidifique, colocar um molde bem no gel. Isto irá permitir a fácil colocação dos embriões. </li><li> Nota: A fim de evitar bolhas nos poços, coloca o molde lentamente num ângulo até ser flutuante no topo do gel. </li><li> Usando um microspatula, remova cuidadosamente o bem molde uma vez que o gel tem solidificado. Adicionar solução E3 e armazenar a 4 ° C. </li></ol> Coleção 7. Embryo <ol><li> Prepare câmaras de acasalamento, separadas por divisórias, preenchendo-os com água do sistema, e em seguida, colocando adulto do sexo feminino (s) pares do sexo masculino (s) peixe-zebra e nas câmaras O / N. </li><li> Recolher os ovos fertilizados usando um filtro fino de malha de arame (estágios embrionários irá variar um pouco). </li><li> Depositar os ovos fertilizados em um ambiente limpo, 10 centímetros de diâmetro petri prato girando o filtro de cabeça para baixo e enxaguá-lo com um bom fluxo de E3 até que não haja ovos deixados no coador, e há cerca de 25 ml de solução E3 no prato. </li><li> Após a coleta, dividir os ovos em vários pratos (aproximadamente 50-60 ovos por placa) para evitar a superlotação, o que pode levar a assincronia de desenvolvimento dentro da embreagem e fazer a coleta desejados pontos vezes difícil. </li><li> Incubar embriões em solução E3 a 28,5 ° C para permitir a avaliação do desenvolvimento de acordo com a série de paragem peixe-zebra padrão 40. Nota: Os embriões devem ser transferidos para E3 / PTU às 24 horas pós fecundação (hpf) para prevenir o desenvolvimento de pigmento se manipulações em estágios mais velhos necessitam de clareza óptica. </li></ol> 8. Bead Implantação <ol><li> Incubam-se as microesferas em concentração molécula de ensaio ou o veículo desejado s correspondentesolution durante o tempo necessário num volume apropriado. Nota: O pesquisador pode utilizar placas de Petri esterilizadas que variam de 3-6 cm de diâmetro, ou placas de multi-poços, os quais permitem a visualização das microesferas dentro da solução. O tempo pode variar dependendo do tipo e quantidade de molécula de interesse e o investigador deve referir-se ao fabricante ou recomendações publicadas para a duração de incubação e outros aspectos, tais como a sensibilidade à luz e temperatura. </li><li> Uma vez que os embriões atingiram o ponto de tempo de desenvolvimento desejado, remova os embriões de suas córions usando uma pinça fina. </li><li> Incubar os embriões na solução de Ringer filtrada com antibióticos, durante 10 min a aclimatar-los para a solução. </li><li> Enquanto os embriões são aclimatação, transferir as microesferas para a placa micropérola situado dentro da bandeja de implantação e lavá-los em solução de Ringer durante 10 minutos. Nota: Implante as contas dentro de 50 min após chegar a este ponto. Esta wdoente diminuir a probabilidade de que uma vai implantar um grânulo com uma menor concentração da molécula de interesse. </li><li> Disposição dos embriões nas cavidades da bandeja de implantação microbead, tendo o cuidado de orientá-los para que a área de interesse, onde o microbead será implantado está acessível. </li><li> Fazer uma pequena incisão no embrião usando a agulha de tungsténio. </li><li> Transferir um microbead para o embrião usando a pipeta de transferência microcapilar: pressionando o bulbo da pipeta, puxe o microbead na coluna capilar, e, em seguida, liberar a pressão para transferir o microbead no destino desejado. </li><li> Use a ferramenta da suiça / chicote para posicionar o microbead dentro do embrião. Nota: Certifique-se de posicionar o microbead para o tecido longe do local da incisão para que o microbead não será expulso do embrião como ele cura. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ao longo do século passado, a compreensão do plano de padronização corpo e organogênese tem sofrido avanços monumentais. Técnicas de manipulação de tecidos foram críticos em revelar informações importantes sobre esses processos vitais. A modificação genética é um dos métodos mais utilizados para determinar a função do gene, e métodos de análise de mosaico, tais como o transplante de células, fornecer abordagens úteis para compreender a autonomia da função do gene. Implantação Microbead fornece um outro local para interrogar como as moléculas especial alterar a dinâmica de desenvolvimento, já que este método permite que o pesquisador de alterar um ambiente tecidual local através da introdução de moléculas ou inibidores da sinalização. Uma gama de diferentes micro-esferas estão comercialmente disponíveis, que têm diferentes tamanhos e outras propriedades físicas existem (por exemplo, carga) de tal modo que eles podem ser utilizados para as condições experimentais de interesse. Assim, através da implantação de microesferas que são embebidos numa proteína ou químicocal de interesse dentro de um organismo, os pesquisadores podem investigar os efeitos localizados durante o desenvolvimento e encontrar associações entre o gene ou molécula de interesse e especial fenótipo biológico (s). Estudos como o realizado por Wada e seus colegas usaram implantação microbead a fim de avaliar o efeito do aumento de sinalização Hedgehog no padrão esquelético no neurocranium anterior (ANC) em peixes-zebra 23. Estudos anteriores demonstraram que Shh é necessária para a formação de 14 ANC. Usando microesferas Shh-revestidos pesquisadores identificaram que este sinal promove a formação de cartilagem no ANC. O processo de implantação microbead foi utilizado para demonstrar uma ligação clara entre a sinalização Hedgehog e formação de cartilagem no ANC. Outro exemplo chave desta técnica de manipulação de tecidos em peixes-zebra é observada em estudos em que os cientistas investigaram o controlo transcricional do eritroblastoma Vinte e seis (ETS) f domíniomolécula relacionada com a ETS atores (ERM) e Polioma potenciador ativador 3 (Pea3) por sinalização Fgf durante o início do desenvolvimento do cérebro do peixe-zebra 19. Através de experiências de implantação microbead, eles foram capazes de mostrar que Fgf8 e Fgf3 pode ectopically activar a expressão de erm e pea3. Estes exemplos ilustram a utilidade das microesferas para proporcionar perspectivas sobre os mecanismos de desenvolvimento que colaboram durante a formação do tecido, que podem ser bem caracterizados pelo uso de métodos para avaliar a expressão do gene 41. Assim, o transplante de microesferas pode ser um método viável para explorar outros tecidos, tais como a mesoderme intermediária (IM), que dá origem ao rim. Especificamente, ele iria ajudar em estudos de desenvolvimento renais, para investigar como diferentes moléculas afetam nephron segmentação 42 e tubulogenesis 43,44, processos que estão apenas superficialmente compreendidas no presente. Além disso, o implante micropérola começou a ser utilizado para estuy processos de regeneração em peixes-zebra 29] e pode ser adaptado para utilização com qualquer número de modelos de regeneração de órgãos, tais como após a ablação a laser dos tecidos embrionários como o nefrónio 45 ou em conjunto com os métodos que têm sido formuladas para realizar pesquisas com as estruturas correspondentes adultos 46-49. Finalmente, o implante micropérola tem o potencial de ser utilizados em modelos de doenças humanas, tais como cancro ou tecido degeneração 50,51 52,53. No presente protocolo, que demonstram o método de implantação micropérola em embriões de peixe-zebra, o que também foi descrito de forma semelhante por outros investigadores, mas não mostrado, através de protocolos de vídeo 1. Com a prática mínima fomos capazes de implantar microbeads a uma taxa aproximada de 8-10 embriões / h, que se refere a viabilidade deste processo uma vez que o pesquisador tem alguma experiência. Os resultados aqui apresentados demonstram que os grânulos de vários dimensions pode ser implantado em fases iniciais, e que, com cuidado, esta técnica de manipulação de tecidos pode ser implementado com um mínimo de ruptura física do embrião. Uma melhoria que devem ser enfatizados é a utilização de uma ferramenta suiça / chicote para posicionar a micropérola no embrião. Esta peça relativamente simples e barata do equipamento é aproximadamente o mesmo diâmetro que a micropérola, é fácil de obter e ajuda a acelerar o processo de implantação. A suiça / chicote pode ser cortado para um comprimento desejado para produzir um firme ainda ferramenta de manipulação de cordão delicado, dependendo destreza pesquisador e preferência. Finalmente, enquanto nós aqui descrita como manipular fisicamente microbeads e embriões de peixe-zebra para realizar o implante, este protocolo não descrevem os procedimentos de manipulação específicas para diferentes drogas ou peptídeos. Em geral, microesferas tratados quimicamente deve ser implantado no animal com a conveniência, para evitar efeitos indesejados em outras áreas do organismo, e os investigadores devem ser bastanteformada sobre os possíveis problemas de segurança associados a tais produtos químicos antes de iniciar seus estudos. Em suma, nós demonstramos um método de implantação micropérola relativamente simples e eficaz com uma ampla gama de aplicações, usando materiais que estão prontamente disponíveis no laboratório. Finalmente, nós esperamos que este manual vai ajudar pesquisadores com a natureza delicada da manipulação dos tecidos do peixe-zebra.

Pesquisadores Developmental Biology utilizar uma vasta gama de métodos celulares, moleculares e genéticas para descobrir os mecanismos que controlam como um organismo é formado. Entre essas abordagens, manipulação de tecidos é uma ferramenta chave para decifrar questões complexas sobre o destino da célula, movimento celular, ea organização dos tecidos. Uma maneira de alterar a ambientes de tecidos locais é através da aplicação cirúrgica de microesferas que são usados ​​para fornecer uma fonte de foco de proteínas ou outras moléculas de sinalização 1. Esse tipo de manipulação experimental tem sido amplamente implementado em modelos embriologia vertebrados clássicos, como a rã e pintainho 2. O peixe-zebra tornou-se um importante organismo modelo vertebrado para o estudo da organogênese e também fornece muitas vantagens únicas para a modelagem de doença 3-5 como eles compartilham alta conservação genética com os seres humanos 6. Em particular, a transparência óptica e external desenvolvimento do embrião de peixe-zebra oferece um ponto de vista inigualável para a observação da ontogenia do tecido 3-5. A aplicação de telas genéticos para a frente em grande escala tem gerado um repositório poderoso de estirpes mutantes de peixe-zebra para o estudo mais aprofundado 7,8, e a identificação de técnicas de rastreio alternativos que podem ser eficazmente conduzido à escala reduzida em laboratórios 9,10 individuais. Mais trabalho experimental com peixe-zebra foi facilitada através de avanços nas metodologias de transgênicos e reverter abordagens genéticas 11,12, bem como a genética químicos 13-15. Técnicas de manipulação de tecidos, tais como a aplicação de micro-esferas, não têm sido tão amplamente empregue no peixe-zebra, mas não obstante constituem uma ferramenta útil para entender melhor a sinalização celular durante o desenvolvimento. Microbead implantação tem sido utilizado para interrogar os processos de formação de órgãos na retina de peixe-zebra16,17, coração 18, 19-22 cérebro, crista neural 23, e fin 24,25. Nestes e em outros estudos, os grânulos foram aplicados durante o desenvolvimento para compreender a difusão de moléculas de sinalização 26, como gradientes afectar a migração de células 27 e 28 axial patterning. Mais recentemente, foram utilizadas microesferas para avaliar os mecanismos de regeneração em adultos zebrafish 29. Em estudos de desenvolvimento, por exemplo, o trabalho microbead peixe-zebra forneceu insights sobre os mecanismos de formação dos membros por meio de estudos da nadadeira peitoral 25. O broto barbatana peitoral peixe-zebra é homóloga à bud membro anterior no rato 30 e 31 de pintinho. O botão do membro vertebrado tem dois nós de sinalização essenciais: a zona de actividade polarizadora (ZPA), que estabelece o eixo anterior-posterior, para, através da expressão de hedgehog Sonic (Shh) e alvos de genes Hox a jusante,e a crista ectodérmica apical (AER) presente na ponta do botão do membro, que actua para estabelecer a identidade proximal distal do membro através da expressão de factores de crescimento de fibroblastos (FGFs). por implante de micropérolas Fgf embebidos em mutantes de peixe-zebra Shh genéticos, investigadores identificado Fgf como essencial para a progressão do ciclo celular e o crescimento do membro 25 de vertebrado. Em adição ao Fgf e Shh cascatas de sinalização que estabelecem identidade posicional, estudos pioneiros utilizando o botão pintainho membro identificado de ácido retinóico (RA) como uma molécula que pode mimetizar a acção da região de polarização para estabelecer a identidade anterior para posterior 32. Esses experimentos envolvidos colocando pequenas tiras de papel Whatman RA-embebido no membro pintainho para avaliar dígito padronização 32. Além disso, os investigadores realizaram outros estudos elegantes que empregam o uso de microesferas, o transplante de células, e exógenoTratamentos da AR em peixe-zebra para determinar que a AR age para fornecer longo alcance pistas posicionais dentro da hindbrain peixe-zebra e mesoderme 28. No entanto, actualmente muitas questões permanecem sobre os papéis de fatores como Fgf e RA sinalização durante vários aspectos do desenvolvimento dos vertebrados. Os efeitos de sinalização de AR, na qualidade de um morfogénio, impactar muitos órgãos 33, tais como o coração em desenvolvimento 34 e os progenitores renais, onde RA especifica células renais proximais tipo destinos 35-39. Ainda mais a compreensão de temas poderiam beneficiar significativamente a partir de estudos experimentais utilizando técnicas de manipulação de tecidos e implantação microbead. Embora poucos estudos têm sido realizados com o implante de microesferas no peixe-zebra, quando comparado com modelos como o pintainho, aqueles que foram realizadas foram altamente informativa. Uma das razões para a escassez de implantação microbead baseada em investigação no embrião de peixe-zebra é likely a noção de que existem desafios técnicos difíceis, com base no tamanho do embrião, o que constitui um impedimento para a execução de tais manipulações com sucesso. No entanto, a implantação de embriões de peixe-zebra microbead pode ser aprendido com a prática e assistida através da observação visual da técnica, e, portanto, pode ser perseguido como um meio para interrogar os mecanismos de desenvolvimento. Aqui, demonstramos a aplicação precisa de uma micropérola no embrião do peixe-zebra, o qual pode ser utilizado para a realização de uma ampla variedade de ensaios de formação de tecido e morfogénese celular.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer Flask</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB-500-250</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-50B</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 Micropipette tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>2707402</td><td></td></tr><tr><td>Low Temperature Incubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Dimethly Sulfoxide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45-106 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>140-1454 AG1-X8</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45 &amp;micro;m)</td><td>Polysciences</td><td>7314</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Tweezer</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Needle</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tube holder</td><td>Globe Scientific Inc.&amp;nbsp;</td><td>51674</td><td></td></tr></tbody></table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

O peixe-zebra tem emergido como um sistema modelo genético valiosa para o estudo da biologia do desenvolvimento e da doença. Zebrafish compartilhar um elevado grau de conservação do genoma, bem como semelhanças em processos celulares, moleculares, fisiológicos e, com outros vertebrados, incluindo os seres humanos. Durante a ontogenia precoce, embriões de peixe-zebra são opticamente transparentes, permitindo aos pesquisadores visualizar a dinâmica da organogênese usando um microscópio estereoscópico simples. Microbead implante é um método que permite a manipulação do tecido através da alteração de factores no ambiente local. Isto permite que os investigadores para testar os efeitos de qualquer número de moléculas sinalizadoras de interesse, tais como péptidos segregados, em pontos espaciais e temporais específicos dentro do embrião em desenvolvimento. Aqui, nós detalhe um protocolo para a manipular e grânulos de implantes durante o desenvolvimento do peixe-zebra cedo.

Vários tipos de ferramentas de manipulação são úteis para o tratamento de microesferas durante aplicações de pesquisa (Figura 1). Além disso, um molde de agarose simples com pequenos poços podem ser utilizados para manter o embrião do peixe-zebra, o que é vital para realizar estas experiências de uma maneira rápida e eficiente (Figura 1). A implantação de uma micropérola pode ser realizada na posição espacial e temporal da fase de interesse, o que permite limitar os investigadores a uma janela de acção específico para a molécula de interesse. Aqui, microesferas individuais foram implantadas em embriões de peixe zebra na fase de botão de cauda ou em pontos de tempo posteriores durante fases somitogénese (Figura 3). Dois microesferas de diferentes tamanhos, lavadas com solução de Ringer sozinho, foram utilizados neste protocolo de demonstração (figura 3A, 3B e 3C). Este implante micropérola na ausência de qualquer conjugadomoléculas pequenas demonstra que o implante de grânulo pode ser conseguida sem efeitos morfológicos brutas durante o desenvolvimento correcto do embrião do peixe-zebra (Figura 4). O experimentalista podem encontrar dificuldades à manobra da microbead no buraco punção feita por uma agulha de tungstênio sobre o embrião. Para conseguir um melhor manuseamento do micropérola uma vez colocado no embrião com a micro-agulha, um / chicote suiça ferramenta pode ser usada. Isto pode ser trabalhada com naturalmente derramado felino ou canino bigodes, embora outros filamentos lash natural ou sintético pode ser utilizado (Figura 1). Um empurrãozinho da microbead quer com a agulha de tungstênio ou a ferramenta suiça deve ver o microbead afundar em solução de Ringer do molde. Uma vez que a micropérola se afundou no molde deve ser movido grandes distâncias, se necessário, utilizando a agulha de tungsténio e uma vez sobre o embrião a ferramenta ou de filamentos emaranhados de agulha pode ser usado para position O microbead no embrião. O sucesso da implantação microesferas pode ser imediatamente avaliada através da visualização em um estereomicroscópio, tal como o rebordo irá permanecer estavelmente posicionado no tecido. Para avaliar a posição do grânulo ao longo do tempo, cada amostra embrião pode ser trabalhada por meio da fotografia curso de tempo vivo ou verificado a intervalos regulares (como representado na Figura 4) para assegurar que a localização do grânulo não se deslocou ao longo da duração da experiência, devido ao tecido endógeno morfogênese. Compreendendo a posição do cordão ao longo do tempo é crítica para a interpretação mais informado dos resultados, tais como a avaliação do efeito de uma molécula pequena sobre um tecido-alvo ou processo de desenvolvimento. A utilização destes passos acima irá proporcionar um ambiente ideal para encaixar microesferas no embrião do peixe-zebra de cada vez e posição desejada. Em nossa experiência, os usuários novatos deste protocolo implantação microbead tipicamente ganhou a habilidade necessário para executar a implantação cirúrgica consistente de microesferas no embrião de peixe-zebra após cerca de uma semana de prática. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> Figura 1. As ferramentas usadas para realizar o implante micropérola. (A) A bandeja de implantação talão (esquerda, 15 cm de diâmetro) com moldes de embrião (à esquerda) e uma bandeja de incubação micropérola (no lado direito, a 6 cm de diâmetro). Este tabuleiro de trabalho permite ao investigador para colocar os embriões na orientação desejada para a implantação microesferas, e ter as microesferas preparadas para implantação em estreita proximidade na estação de microscópio. Microesferas devem ser incubadas em pequena molécula (s) e / ou o veículo e depois foi enxaguada numa placa separada micropérola (direita) antes da sua colocação na bandeja implantação do grânulo que está posicionado por baixo da estação de microscópio. (B) Dois pares de uma pinça fina vai ser utilizado para remover o choriem torno de cada embrião do peixe-zebra e também para quebrar a extremidade da agulha microcapilar. (C) Uma agulha de tungsténio serão empregues para fazer um furo muito fina no embrião do peixe-zebra, em que posicionar o microesferas. (D) A transferência pipeta microcapilar será usado para pegar e posicionar uma microbead em cima do embrião de peixe-zebra perto do local da punção. (E) A suiça / ferramenta de cílios vai permitir o posicionamento suave do microbead no local da incisão dentro do embrião que foi anteriormente feita pela agulha de tungstênio. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema do procedimento de implante micropérola. (A) Um tabuleiro de implantação micropérola com micropérolas Soaking na solução de lavagem desejado está configurado sob uma estação de microscópio estereoscópico, e os embriões posicionado com o tecido voltado para cima. (B) Utilizando uma agulha de tungsténio, de uma pequena incisão no embrião pode ser feita com um ligeiro movimento ainda forte. (C) Com uma pipeta microcapilar transferência, a micropérola desejado pode ser retirado da câmara de microesferas de incubação na bandeja, localizada no lado direito, e trazido para a esquerda do compartimento onde a área de trabalho do embrião está situado. A micropérola deve ser depositado perto do local da incisão, e depois delicadamente posicionado no local de incisão feita pela agulha de tungsténio usando a ferramenta / chicote suiça. Uma vez que uma micropérola é manobrado para o local da incisão, ela deve ser dobrado para o tecido (distância a partir da incisão) para posicionar de forma estável e a micropérola impedir o movimento subsequente para fora do embrião, o desenvolvimento continua. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>locação clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> Figura 3. microesferas pode ser implantado em embriões em diferentes estádios de desenvolvimento. (A) Zebrafish embriões foram implantados com um microesferas (diâmetro de aproximadamente 50 mm) para o tronco na fase cauda broto. Quando examinados no 24 horas após o implante do talão (hpbi), os embriões tinham desenvolvido normalmente e a micropérola mostrou movimento mínimo durante a passagem do tempo de desenvolvimento. (B) Zebrafish embriões implantados com microesferas (com um diâmetro de aproximadamente 50 mm) para o saco vitelino no estádio 3 somito (ss) exibido desenvolvimento normal com o movimento do grânulo relativamente menor ao longo do tempo. (C) microesferas maiores (diâmetro de aproximadamente 70 mm) foram implantados no embrião 7 ss semelhante mostrou subsequente desenvolvimento normais, assim como mini-mal se qualquer movimento a partir do local de implantação. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> Figura 4. desenvolvimento bruta do embrião do peixe-zebra é perturbado pela presença de uma micropérola através de 72 hpbi. Zebrafish embriões foram implantados com microesferas embebidas em solução de Ringer (com um diâmetro de cerca de 50 um) na fase 7 somito (ss). Cada microbead foi cirurgicamente inserida no tronco, entre somites 3 ​​e 4. A presença do talão não foi associada com defeitos evidentes de desenvolvimento em 24 horas após talão implante (hpbi), 48 hpbi, ou 72 hpbi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.4K visualizações.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Vídeo: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Imunologia e Infecção

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Um dispositivo de transplante simples e eficaz para embriões de zebrafish

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Biologia do Desenvolvimento

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Medições de força direta de mecânica subcelular em confinamento usando pinças ópticas

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

Um modelo de embrião de Zebrafish para na visualização de Vivo e Intravital análise de biomateriais-associado Staphylococcus aureus infecção

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Bioengenharia

<meta charset="utf8"></head><body>Elucidando o comportamento da microglia no desenvolvimento do tecto óptico do peixe-zebra

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and function. Externally developing zebrafish embryos possess optical transparency, which along with well-characterized transgenic reporter lines that fluorescently label microglia, make zebrafish an ideal vertebrate model for such studies. In this paper, we take advantage of the unique features of the zebrafish model to visualize the dynamics of microglia cells in vivo and under physiological conditions. We use confocal microscopy to record a timelapse of microglia cells in the optic tectum of the zebrafish embryo and then, extract tracking data using the IMARIS 10.0 software to obtain the cells' migration path, mean speed, and distribution in the optic tectum at different developmental stages. This protocol can be a useful tool to elucidate the physiological significance of microglia behavior in various contexts, contributing to a deeper characterization of these highly motile cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Usando o peixe-zebra para explorar a migração da microglia durante o desenvolvimento do cérebro

We demonstrate a method that takes advantage of fast scanning confocal microscopy to perform live imaging of microglia cells in the developing zebrafish optic tectum, allowing for the analysis of the dynamics of these cells in vivo.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

Resumo

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A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Um dispositivo de transplante simples e eficaz para embriões de zebrafish

Medições de força direta de mecânica subcelular em confinamento usando pinças ópticas

Um modelo de embrião de Zebrafish para na visualização de Vivo e Intravital análise de biomateriais-associado Staphylococcus aureus infecção

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade