Name: preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

Os autores reconhecem a assistência técnica da Abigail Harris. Eles também reconhecem Paula Cohen e Kim Holloway para ajudar a otimizar o protocolo de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato. Os autores também apreciam a leitura crítica do manuscrito por Karen Schindler.
Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 GM106262 para K.M.B.

Todos os métodos envolvendo ratos utilizaram alta ética e padrões de bem-estar e foram aprovados pelo Comitê de uso na faculdade de medicina da Universidade de Drexel e institucional Cuidado Animal.
1. preparação de soluções e instrumentos necessários
<ol><li>Prepare o tampão de extração hipotônica (HEB) em 50 mL de água de grau de laboratório ultrapura, pH 8,2-8,4 (tabela 1). Fazer a solução fresca cada vez, lembre-se no gelo e usar até 2 horas de preparação se espalha; Isto é necessário para otimizar a redução e a protease, inibir a atividade dos TDT e PMSF, respectivamente. Use 10 mL de HEB para cada par de testículos de rato.</li>
	<li>Prepare uma solução de sacarose 100 mM (frescos de cada vez), acrescentando 0,342 g de sacarose a 10 mL de laboratório ultrapura água de grau. Ajustar o pH a 8.2</li>
	<li>Preparar a solução fixador (1% paraformaldeído (PFA), 0,15% Triton X-100, pH ajustado a 9.2 com 1 N HCl ou 1 NaOH de N) mensal fresco e loja em temperatura ambiente protegido da luz. Diluir um 16% comercialmente PFA partido estoque disponível para 4% em 1X PBS para uso como um estoque de trabalho e em seguida armazenar alíquotas de 4% a-20 ° C.<ol>
<li>Para preparar a solução de fixador, adicionar 10 mL de solução a 4% PFA e 600 µ l de 10% Triton X-100 a 30 mL de 1X PBS, misture bem e ajustar o pH a 9.2 com 1 N HCl ou 1 N NaOH. Armazene a solução fixador em um tubo cônico de 50 mL, embrulhado em papel de alumínio à temperatura ambiente (para não mais de 4 semanas).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar soluções de lavagem (enquanto slides estão secando o passado 30 min) com 200 Photo-Flo: 0,4% Photo-Flo 200/PBS (320 µ l de Photo-Flo 200 em 80 mL de 1X PBS) e 0,4% Photo-Flo 200/dH2O (160 µ l de Photo-Flo 200 em 40 mL de água de grau de laboratório ultrapura). Use uma jarra de Coplin 50ml repleta de 40 mL de soluções para lavar slides 10 ou menos de cada vez.</li>
	<li>Preparem-se os seguintes instrumentos: 1 par de tesouras cirúrgicas (para cortar a pele), 1 par de tesouras cirúrgicas de ponta fina (para entalhar o peritônio), 2 pares de pinças de ponta fina em linha reta (para dissecar para fora cada testículo), 1 lâmina de barbear de borda reta (para entalhar cada testículo), curva de 2 pares de pinças de ponta (para imobilizar cada testículo e espremer para fora dos túbulos seminíferos), 50 mL frascos de Coplin, Teflon impresso 3 slides de anel, 1 Bisturi com lâmina de tamanho 11, câmara umidificada, pratos de Petri 100 x 15mm, marcador permanente de ponta fina ou lápis e um agitador rotativo de plataforma.<ol>
<li>Prémio de lugar sem carga deaner final fosco corrediças de vidro vertical em uma jarra de Coplin 50ml repleto de fixador solução até o uso. Nota: O lápis é preferencial se slides serão usados posteriormente em procedimentos que requerem a etanol, tais como hibridação de fluorescência in situ .</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. núcleos de maturação se espalhando
<ol><li>Eutanásia em um rato masculino de acordo com as orientações institucionais (por exemplo, deslocamento cervical com ou sem CO2 asfixia).</li>
	<li>Use P10 - P20 machos avaliar células meióticas na primeira onda da espermatogênese; rotineiramente usamos P15 - P17 machos para obter células de todos os substages da prófase I. testículos adultos irão fornecer células de prófase, eu também, mas eles também irão produzir células mais postmeiotic, como espermátides.</li>
	<li>Colheita e pesar os testículos (gravar os pesos emparelhados); em seguida, colocá-los em uma placa de Petri contendo algumas gotas de frio HEB para mantê-los húmida.</li>
	<li>Segure o testículo contra o fundo do prato com pinça de ponta curva e usar uma lâmina de borda reta para fazer uma pequena incisão vertical através da cápsula do testículo. Mantendo ainda o testículo contra o fundo do prato com uma pinça, use um segundo conjunto de pinças de ponta curvada ou lâmina de barbear borda reta para apertar suavemente os túbulos seminíferos do testículo.<ol>
<li>Coloque os túbulos em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de frio HEB, tendo o cuidado de evitar colocar pedaços da cápsula para o tubo. Repita essas etapas com o testículo segundo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incube os túbulos seminíferos congelada no tubo cônico contendo HEB no gelo por 30-60 min, dependendo do tamanho dos testículos. Incubar os túbulos seminíferos de um par de testículos, pesando 30 mg ou menos por 30 min, túbulos de um par de testículos, pesando 31 a 50 mg por 30-45 minutos e maiores testículos durante 60 minutos. Não altere as vezes para um único testículo. Nota: O tempo de incubação ideal pode variar dependendo da experiência do experimentador, os reagentes utilizados e os ratos que está sendo analisados.</li>
	<li>Enquanto os túbulos seminíferos estão incubando em HEB, use um marcador ou um lápis para rotular as extremidades foscas de slides deaner com mouse, número, data e número do slide. Em seguida, coloque as lâminas previamente limpas em uma jarra de Coplin contendo a fixador solução.</li>
	<li>Após incubação, despeje túbulos e HEB limpa uma placa de Petri e túbulos separados em grupos de diâmetro aproximadamente 3 mm. Cada grupo produz 2 slides e o número de slides rendido depende do tamanho dos testículos. Nota: Nós obtemos 8 slides de tipo selvagem e 6 slides da subfertile Chtf18-nula P16 testículos (que são menores devido à diminuição da números de meiótico e mitótico das células germinativas,8). Um testículo adulto com peso igual ou superior a 100 mg seria esperado para produzir 16 slides.</li>
	<li>23 lugar µ l da solução de sacarose 100 mM em um anel de Teflon um impresso, 3 anel slide e adicionar um grupo de túbulos seminíferos para o anel.  Em seguida, usando curvas dica pinça para segurar a moita, picar delicadamente túbulos com uma lâmina de barbear 11 tamanho até que a solução se torna opaco. Nota: Não overmince, pois isso resultará em cromossomos fragmentados. Note-se que os cromossomos fragmentados também podem ser indicativos de um fenótipo mutante.</li>
	<li>Remova os detritos, adicione outra 23 μL de solução de sacarose e usar uma micropipeta para suavemente Pipetar a mistura acima e para baixo algumas vezes para ajudar a separar as células em suspensão.</li>
	<li>Retirar a lâmina de imersão no Coplin frasco contendo solução fixador e incline o slide sobre o frasco para que uma gota generosa recolhe no canto inferior do slide.<ol>
<li>Pipetar 20 µ l de suspensão de células de sacarose a partir do anel do slide impresso 3 anel Teflon para o fixador da gota em um premium fosco lâmina de vidro e pipetar a suspensão acima e abaixo de 2 - 3 vezes. Nota: A gota de fixador deve ser grande o suficiente no volume para que a adição de 20 µ l de suspensão de células de sacarose para permite a cobertura em slide inteiro quando a mistura é espalhada (ver 2.11 abaixo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lentamente, incline o slide para o lado oposto da gota para espalhar a suspensão de células ao longo do comprimento do slide. Em seguida, incline lentamente a lâmina traseira para espalhar a suspensão de células ao longo da largura do slide para cobri-lo completamente. Evite a propagação da suspensão sobre a mesma área do slide mais de uma vez caso contrário que as células se sobrepõem uns aos outros.</li>
	<li>Coloque o slide flat em uma câmara umidificada imediatamente e repita etapas 2.8 para 2.11 até todos os grupos de túbulos seminíferos têm sido usadas para fazer slides. É importante não mover a câmara umidificada durante o processo de secagem para evitar rasgar e sobreposição de células.</li>
	<li>Permitir que os slides incubar em uma câmara umidificada coberta em temperatura ambiente por 2,5 h para que secam lentamente e não completamente. Alta umidade e secagem lenta nesta etapa são importantes para garantir a adequada divulgação da cromatina. Então remova a tampa da câmara e permitir slides secar ao ar completamente um adicional 30 min.</li>
	<li>Coloque os slides (de costas ou em um padrão em ziguezague) em uma jarra de Coplin contendo 0,4% Photo-Flo 200/1 X PBS solução e lavar as lâminas duas vezes, 5 min cada, agitando suavemente o Coplin jar em uma plataforma girando o agitador. Use a solução fresca para cada lavagem e manter slides de mouses diferentes em frascos separados para cada uma das lavagens.</li>
	<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin contendo 0,4% Photo-Flo 200/dH2O solução por 5 min uma vez enquanto agita.</li>
	<li>Remover slides de Coplin o jar (última lavagem), cuidadosamente Limpe as bordas e o fundo dos slides para remover o excesso de líquido e coloque os slides em uma posição angular, quase-vertical para secar. Um experimentador que é proficiente nesta técnica pode processar e preparar os núcleos de propagação da superfície de 4 ou 5 ratos em um dia.</li>
	<li>Uma vez seco (15-20 min), processo slides imediatamente para a mancha da imunofluorescência ou loja a-80 ° C em uma caixa de slides hermeticamente fechado, protegida da luz por um período máximo de 3 semanas (dependendo das proteínas alvo sendo avaliadas; melhores resultados podem ser obtidos se manchado o mesmo dia ou dentro de 2 semanas).<ol>
<li>Se armazenado a-80 ° C, permite slides para a temperatura e lavar em uma jarra de Coplin contendo 1 X PBS ou bloco por 5 min antes da coloração. Nota: Muitos protocolos de coloração diferente da imunofluorescência proporcionará bons resultados; referem-se para um protocolo de imunocoloração8para Berkowitz et al.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Para obter o elevado número de núcleos de maturação bem espalhados, de boa qualidade, as etapas mais críticas do presente protocolo incluem o tempo de incubação apropriada dos túbulos seminíferos no HEB, apropriado de picagem de túbulos seminíferos, e a técnica empregada para a suspensão de células de sacarose se espalhou o fixador slides revestido. Nós incubar túbulos seminíferos dos testículos dos machos de tipo selvagem, variando de pós-Natal dia 15 à idade adulta em HEB para 45 min, enquanto os testículos de comparàvel envelhecido Chtf18-ratos nulos são incubados por apenas 30 min porque os testículos são metade do tamanho e contêm significativamente menos células germinativas8. Em nossa experiência, incubação de Chtf18-nulo os testículos para mais de 30 min comprometem a integridade das células, resultando em homologs mal resolvidos. Túbulos seminíferos são picados apenas para obter uma suspensão de células de sacarose nublado, e cada slide deve conter uma gota generosa de fixador antes de espalhar-se (ver 2.10). Slides são inclinados em uma direção por vez e não para trás e para frente. O método é ideal estudar meiose I, mas é em grande parte limitada a substages da prófase eu. No entanto, núcleos em fase de premeiotic S, metáfase I e II podem ser observadas e foram relataram7,9.
Este é um método simples que exige alguma prática para obter melhores resultados e competência. Resultados de qualidade inferior podem ocorrer por vários motivos diferentes. Núcleos podem não ser bem distribuídos, resultando em cluster ou sobreposição de células. Isso pode ocorrer se a suspensão de células de sacarose não é pipetada adequadamente ou não há suficiente fixador do slide para espalhar os núcleos bem. Se os slides não são revestidas com bastante fixador residual ou a suspensão de eritrócitos não espalharam o slide em uma direção suave ou repetidamente espalhar e para trás, as células se sobrepõem e aglutinar-se. Se os túbulos seminíferos são "overminced" homologs podem ser fragmentados ou aparecem um pouco desfiados. Porque os testículos mutantes podem ser menor, contêm espermatócitos menos e ser mais suscetíveis à "overmincing" ou fragmentação dos túbulos seminíferos, recomendamos praticar algumas vezes em testículos de controle (por exemplo, tipo selvagem), primeiro para otimizar a técnica na mãos de um novato.
Preparação de núcleos de disseminação de superfície é uma técnica fundamental usada para examinar as etapas-chave reguladoras e progressão da meiose, bem como para caracterizar fenótipos meióticos em camundongos. Portanto, usamos este método extensivamente e ensinar todos os novos membros do laboratório a realizá-la. Uma vez que esta técnica é dominada, uma miríade de outras técnicas pode ser usada posteriormente e em conjunto com ele. Por exemplo, vários tipos de imunocoloração e/ou microscopia incluindo widefield ou confocal com epifluorescência, ou elétron microscopia pode ser executada. Além de estudar proteínas específicas de meiose como componentes do complexo de synaptonemáticos, aqueles interagindo com o SC, tais como cohesins, complexos Multiproteicos que medeiam a coesão, podem ser avaliadas (revisto em 10,11 12). Regulamento de DNA crossover formação, processamento e maturação pode ser e também têm sido estudados com esta técnica13. In addition, esta técnica tem sido realizada após o uso de métodos para obter populações específicas de rato espermatócitos: 1) na sequência de cultura de espermatócitos em ácido ocadaico para induzir a progressão para a transição G2/MI, produzindo o aumento do número de diplóteno, diacinese e metáfase espalha-se14,15 e 2) depois de métodos usados para isolar uma população enriquecida de paquíteno espermatócitos14.
A técnica de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos rato descrito e demonstrado que aqui é uma técnica extremamente útil e simples. É por excelência a cada laboratório que estuda meiose usando ratos como um organismo modelo, mas requer alguma prática e finesse para alcançar os melhores resultados.

Ratos são usados extensivamente como um organismo modelo para estudar meiose em mamíferos. Ambos os processos de desenvolvimento normais e defeitos que ocorrem durante a meiose podem ser avaliados. A linha do tempo e a progressão das características salientes que ocorrem durante a prófase I e substages, bem como uma infinidade de proteínas específicas envolvidas nos processos fundamentais para a regulação da meiose pode ser caracterizado no tipo selvagem e ratos mutantes. Vários processos especializados que ocorrem durante a meiose, que pode ser estudado em detalhe (revisto em Handel e Schimenti1). Estes incluem formação de ruptura da dobro-Costa (DSB) de DNA e reparação, recombinação, formação de complexos synaptonemáticos e segregação do cromossomo.
Um aspecto importante de estudar processos meióticos é a capacidade de examinar os núcleos contendo cromossomos homólogos que são visualmente e opticamente resolvidos para melhor distinguem e identificam os substages da prófase I. prófase que é composto por 5 substages que são caracterizadas por características específicas, incluindo a formação do complexo synaptonemáticos (SC). O SC é um andaime proteína tripartite que permite emparelhamento e DNA dobro-Costa reparação de homologs. Durante leptonema, homologs alinhar como elementos axiais do SC são estabelecidos. Em seguida fixação dos elementos centrais para o complexo de synaptonemáticos durante zygonema facilita a conexão física e pareamento (sinapse) entre pares de homologs. Durante pachynema, sinapse de homologs torna-se completa e os cruzamentos de DNA são formados a partir de reparação de uma população seleto de DNA dupla-quebras através de recombinação homóloga. O SC desmonta durante diplonema, permitindo homologs para desynapse, mas permanecem conectados em seus centrómeros e em locais de cruzamentos de DNA. Finalmente, durante diacinese, homologs recondense e ocorre a transição para a metáfase1.
Historicamente, superfície-propagação da cromatina meiótica rendeu alguns núcleos, especialmente aqueles das primeiras fases da prófase eu2. Como resultado, esses métodos foram modificados para melhorar a separação de células de tecidos (testículo ou ovário), a técnica de espalhamento de cromatina meiótica e o rendimento dos núcleos meiótico de alta qualidade para avaliação2,3, 4. Além disso, este método provou para ser útil na preservação nuclear e cromatina ligado proteínas em núcleos meióticos, como demonstrado por técnicas de immunolocalization publicada a5,6,7. Portanto, o método inicialmente descrito por Peters2 e demonstrado aqui rende muitos núcleos de maturação explosão separado contendo homologs passando pelos leptóteno, zygote, paquíteno, diplóteno e diacinese substages da prófase eu.
A técnica de preparação de superfície-propagação núcleos (também chamados de análise de propagação de cromatina) é amplamente utilizada para estudar meiose nos campos da biologia reprodutiva e celular. Slides contendo núcleos de propagação da superfície podem ser posteriormente immunostained com anticorpos para proteínas de interesse ou submetidos a coloração prata e depois analisaram com microscopia. O método é semelhante para os ratos masculinos e femininos, embora modificações foram descritas para ratos fêmeas2. É crucial para não overmince túbulos seminíferos. Núcleos devem também ser bem espalhados para que seguir immunostaining homologs e proteínas associadas são claramente vistas com microscopia. Núcleos de propagação da superfície podem ser preparados em apenas algumas horas e qualquer immunostained imediatamente ou armazenados a-80 ° C por um período máximo de 3 semanas antes de descongelar e imunocoloração. No entanto, óptimos resultados melhores são obtidos para algumas proteínas se immunostaining é executada imediatamente, ou dentro de 2 semanas de preparação de superfície-propagação núcleos. Slides podem ser immunostained com um protocolo padrão usando anticorpos para proteínas de interesse, seguido de incubação com anticorpos secundarios conjugados para fluorescente proteínas ou corantes, em seguida, fotografada com microscopia de fluorescência8. No pós-Natal dia 15-21 há tecido suficiente por par de tipo selvagem testículos a produzir slides de 6-10, e os ratos mais velhos (incluindo adultos) produzirá mais slides. No entanto, ratos de tipo selvagem 6 semanas de idade e mais velhos também irão produzir mais pós-meiose células (ou seja, espermátides) nas corrediças de imunocoloração a seguir. Além disso, todos os substages da prófase eu pode ser observado em ratos jovens e adultos. Os testículos dos machos no pós-natal dias 10 a 15 renderá muitos mais células leptóteno e zygote. Os ratos mais velhos que pós-Natal dia 14 a 15 renderá mais núcleos paquíteno e diplóteno.
Aqui descrevemos e demonstrar um método amplamente utilizado de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.

<table><tbody><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>1464510</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Teflon printed 3 ring slides</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63418-11</td><td></td></tr><tr><td>Premium uncharged frosted end glass slides</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td></tr><tr><td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-12</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Straight fine tip forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Curved medium tip forceps</td><td>Fisher</td><td>16100110</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>Use at 1:300</td></tr><tr><td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-234-0001</td><td>Use at 1:50</td></tr><tr><td>Humidified chamber</td><td></td><td></td><td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td></tr><tr><td>Widefield microscope with epifluorescence</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>Any standard model</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td></tr></tbody></table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

Mamíferos meiose é um processo dinâmico de desenvolvimento que ocorre em células germinativas e pode ser estudado e caracterizado. Usando um método para espalhar núcleos na superfície de slides (ao invés de deixá-los de altura), podemos demonstrar uma técnica otimizada em espermatócitos de rato que foi descrita pela primeira vez em 1997. Este método é amplamente utilizado em laboratórios para estudar mamíferos meiose porque produz uma infinidade de núcleos de alta qualidade, passando por substages da prófase I. seminíferos túbulos primeiro são colocados em uma solução hipotônica para inchar espermatócitos. Em seguida, espermatócitos são liberados em uma solução de sacarose para criar uma suspensão de células e núcleos são espalhados em lâminas de vidro encharcada de fixador. Na sequência de imunocoloração, uma diversidade de proteínas pertinentes aos processos meióticos pode ser examinada. Por exemplo, proteínas do complexo synaptonemáticos, uma estrutura tripartida que conecta os cromossomo eixos/núcleos de homologs juntos podem ser facilmente visualizadas. Proteínas de recombinação meiótica, que estão envolvidas na reparação de quebras da dobro-costa de DNA por recombinação homóloga, também podem ser immunostained para avaliar a progressão da prófase eu. Aqui descrevemos e demonstrar em detalhe uma técnica amplamente utilizada para estudar mamíferos meiosis em espermatócitos de ratos machos juvenis ou adultos.

A capacidade desse método para fornecer um grande número de superfície espalhar núcleos contendo homologs intactas depende de três fatores principais: 1) tempo de incubação apropriada dos túbulos seminíferos no buffer hipotônica (ou seja, HEB) para obter adequadamente inchou maturação núcleos que estourou, mas não se desintegram de prolongada incubação em HEB, 2) micropipetting as gotas de sacarose de células para obter uma suspensão separada dos núcleos que não são aglutinados e 3) inclinar cada fixador revestido slide em uma direção de cada vez e não e para trás. Uma vez preparado, superfície de propagação núcleos podem ser immunostained com fluorescente etiquetados anticorpos para proteínas de interesse e então fotografaram com microscopia (representante exemplos são mostrados na Figura 1 e Figura 2. A Figura 1 mostra exemplos de núcleos de paquíteno tipo selvagem que estão bem espalhados (A), núcleos contendo irregularmente immunostained, esfarrapados homologs aparecendo devido a incubação em HEB demasiado longo (B), mal distribuídos sobreposição de núcleos (C) e em núcleos contendo homologs fragmentados devido a "overmincing" dos túbulos seminíferos (D). Quando a técnica é realizada também, uma infinidade de núcleos que representa os principais 5 substages da prófase eu pode ser obtido. A Figura 2 demonstra os leptóteno, zygote, paquíteno, diplóteno e diacinese fases da prófase I em núcleos do tipo selvagem espermatócitos de machos juvenis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55378/55378fig1.jpg"> Figura 1: Superfície espalhar núcleos de tipo selvagem espermatócitos de ratos juvenis. Núcleos de maturação paquíteno estavam manchados com anti-SYCP3 (verde), que mancha os núcleos de elementos do axial/lateral do complexo synaptonemáticos (A) bem espalhados. (B) os núcleos dos túbulos seminíferos incubada em HEB há muito tempo. (C) mal espalhe núcleos sobrepostos. (D) fragmentados homologs devido a "overmincing" dos túbulos seminíferos (setas indicam dois fragmentos pequenos do homólogo). Barra de escala é 5 μm. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55378/55378fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55378/55378fig2.jpg"> Figura 2: Exemplos de núcleos de substages da prófase eu. Espermatócitos de tipo selvagem de machos juvenis estavam manchados com soro de crista (vermelho), que as manchas centrómeros, e anti-SYCP3 (verde), que mancha os elementos axial/lateral do complexo synaptonemáticos. Os leptóteno, zygote, paquíteno, diplóteno e diacinese fases da prófase I, respectivamente, são mostrados. Barra de escala é 5 μm. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55378/55378fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Quantidade</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-Cl (pH 8,2)</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>30 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sacarose</td>
			<td>g 0,85575</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Citrato trissódico dihidratado</td>
			<td>0,25 g</td>
			<td>17 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5 EDTA DE M</td>
			<td>500 ΜL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ditiotreitol (DTT)</td>
			<td>g 0,00385</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,2 fluoreto de Phenymethylsulfonyl M (PMSF)</td>
			<td>25 ΜL</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Receita de solução hipotônica tampão (HEB). Adicione os reagentes de laboratório ultrapura 50ml grau água e ajustar o pH 8,2-8,4 (se necessário use solução de NaOH N 1 ou 1 N HCl). Preparar HEB fresco sempre, manter no gelo e usar até 2 horas de preparação.

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Meiose é o processo de desenvolvimento pelo qual gâmetas são formadas através de uma única rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação do cromossomo. Mamíferos meiose pode ser examinado, utilizando uma técnica para preparar os cromossomas se espalha. Aqui, vamos demonstrar um método de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.

Preparação de cromossomos se espalha a partir do Mouse espermatócitos

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

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Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

11.7K visualizações.  Drexel University College of Medicine. Meiose é o processo de desenvolvimento pelo qual gâmetas são formadas através de uma única rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação do cromossomo. Mamíferos meiose pode ser examinado, utilizando uma técnica para preparar os cromossomas se espalha. Aqui, vamos demonstrar um método de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Biologia do Desenvolvimento

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Genética

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Preparação Spread cromossômica de células estaminais embrionárias humanas para Cariotipagem

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Biologia

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Enriquecimento de espermatócitos de Pachytene e Spermatids de testes de camundongo usando equipamento de laboratório padrão

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedimento de injeção de espermátides redondas murinas para estudar o desenvolvimento embrionário

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Injeção de espermátide redonda em camundongo

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...