Este novo método eficiente para isolar subpopulações de espermatototos e espermatozoides de camundongos adultos pode ser usado para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à meiose e espermatogênese. Este método usa um corante de ligação de DNA de baixa citotoxicidade com um amplo espectro de excitação que pode ser aplicado às ordens FACS mais usadas atualmente. Este método é muito simples.
O aspecto mais desafiador é o fluxo de citometria, mas a estratégia detalhada de gating deve ajudar na adaptação do protocolo a outras células. Demonstrando o procedimento estará Yu-Han Yeh, um assistente de pesquisa do Laboratório satoshi Namekawa. Depois de colher ambos os testículos de um rato macho de oito semanas de idade, coloque os tecidos em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo dois mililitros de PBS gelado e remova a tunica albuginea.
Separe suavemente os testículos com fórceps para dispersar ligeiramente os túbulos seminiferos. E transfira os túbulos para uma gota de PBS gelado fresco em uma placa de Petri de 100 milímetros. Use os fórceps para desembaraçar suavemente os túbulos e lavar os túbulos em três gotículas adicionais de PBS como apenas demonstrado.
Após a última lavagem, coloque os túbulos seminiferos desemaranhados em um tubo de 15 mililitros, contendo dois mililitros de tampão de dissociação para uma incubação de 20 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, use uma pipeta de 1000 microliteres para in pipeta suavemente os túbulos 20 vezes, antes de devolver o tubo à incubadora por mais seis minutos. No final da incubação, pipeta os tecidos mais 20 vezes, antes de devolver o tubo à incubadora.
Após três minutos, pipeta suavemente os túbulos 10 vezes ou até que não restem pedaços de tecido visíveis, antes de parar a dissociação com 10 mililitros de tampão FACS. Em seguida, centrífuga para a suspensão tecidual duas vezes usando um adicional de 10 mililitros para tampão FACS fresco para a segunda lavagem para remover o espermatozoide e o máximo de detritos possível. Para colorar as células para análise citométrica de fluxo, suspenda a pelota em três mililitros de tampão FACS.
E filtrar a suspensão celular através de um coador de células de nylon de 70 mícrons, em um tubo de 50 mililitros. Após a contagem, transfira 10% das células para um novo tubo no gelo como o controle negativo não manchado. E misture completamente seis microliters de mancha de DCV na suspensão restante da célula.
Depois de uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius no escuro com agitação suave a cada 10 minutos, adicione cinco microliters de DNase I às células. E filtrar as células através de um filtro de malha de nylon de 35 mícrons em um tubo FACS de cinco mililitros no gelo. Para análise citométrica de fluxo das células, crie um novo experimento no software de análise de fluxo e, sob o menu de ferramentas de planilha, clique em nova densidade para criar uma área de dispersão para a frente versus o gráfico de densidade da área de backscatter em uma escala linear.
Clique em um novo histograma para criar um gráfico de histograma azul DCV em uma escala logarítmica. E clique em iniciar e gravar para começar a processar a amostra não manchada. Enquanto a amostra estiver em execução, clique no detector e nas configurações do limiar para ajustar as tensões PMT de dispersão dianteira e lateral para colocar as células não manchadas na escala do gráfico de dispersão para frente e para trás.
Ajuste a tensão PMT para o canal jappy para localizar a posição da população negativa do DCV na primeira década do lote logarítmico do histograma azul DCV. Em seguida, clique em parar para descarregar a amostra não manchada. Depois de brevemente vórtice e carregamento da amostra manchada, clique no próximo tubo para criar uma nova planilha para a amostra.
Defina o cítmetro para adquirir pelo menos uma vez 10 para os seis eventos, e clique em iniciar e gravar. Em seguida, clique em nova densidade para criar altura de dispersão para a frente versus largura de dispersão para a frente. E dcv azul versus DCV gráficos de densidade vermelha em uma escala linear.
Na área de dispersão dianteira versus o gráfico de densidade da área do backscatter, use a ferramenta polígono para desenhar um portão chamado células para incluir a maioria das células e excluir pequenos detritos. Aplique este portão à altura de dispersão dianteira versus o gráfico de largura de dispersão para a frente e use a ferramenta retângulo para desenhar o portão de uma única célula para excluir células não únicas. Aplique o portão da célula única no gráfico de densidade vermelha DCV versus DCV e ajuste a escala para capturar um perfil estendido.
Use a ferramenta polígono para desenhar um portão DCV para excluir as células e a população lateral não manchadas, e aplique o portão a uma trama de histograma azul DCV em uma escala linear. Os três principais picos referem-se aos diferentes conteúdos de DNA 1C, 2C e 4C. Crie um segundo gráfico de densidade vermelha DCV em escala linear.
E portão de trás do portão DCV para o lote para localizar as populações 1C e 4C. Crie outra trama de densidade vermelha DCV versus DCV em escala linear. E use a ferramenta de elipse para desenhar um portão na população 1C.
Use a ferramenta polígono para portalar a população 4C com uma curva contínua. E criar outra trama de densidade vermelha DCV em escala linear. Use a ferramenta polígono para criar um portão 4C um.
Em um novo gráfico de dispersão para a frente, use a ferramenta de elipse para criar paquiteno, diploteno e leptoteno, portões de espermatocitatocito de zygoteno. Quando todos os portões forem desenhados, crie um novo gráfico de pontos de ponto azul DCV versus DCV em escala linear para aplicar o portão 4C para garantir que as três populações estejam em uma ordem contínua dentro do portão. Em seguida, crie uma nova área de dispersão para a frente versus o gráfico de densidade da área de backscatter em uma escala linear, e selecione o tamanho unificado das células como uma população espermicida redonda pura.
Após a triagem, as purezas representativas das frações de espermatotocitetos de leptoteno, zigoteno, paquiteno e diploteno são tipicamente entre 80% e 90%, conforme confirmado pelas imunostaining SYCP3 e Gamma H2AX. A pureza da facção esperoxida redonda pode ser confirmada por coloração de núcleo com DCV em combinação com a coloração de Sp56 e H1t, e também é tipicamente em torno de 90% A viabilidade das populações celulares isoladas é geralmente superior a 95% E os rendimentos totais médios de cada fração de um único rato adulto são tipicamente suficientes para várias análises a jusante. As células classificadas podem ser usadas para várias análises de sequenciamento de próxima geração para explorar melhor a expressão genética e a regulação durante a espermatogênese.
