Este protocolo pode ser usado para analisar os mecanismos de divisão celular no contexto do tecido vivo e intacto usando microscopia de fluorescência. A principal vantagem dessa técnica é que os ambientes fisiológicos nativos das células são preservados, ao mesmo tempo em que permitem imagens vivas ao longo de cursos de longa data. A parte mais importante desta técnica é garantir que os testículos não sejam danificados durante a dissecção ou montagem.
Esta é uma habilidade que é adquirida com um pouco de tempo e prática. A demonstração visual desse método é fundamental, pois mostra como identificar e isolar os testículos, e como montá-los para imagens sem danificar o tecido. Prepare animais, ferramentas e mídia como descrito no manuscrito.
Antes de iniciar a dissecção, use a seringa de filtro preenchida à mídia para expulsar três gotas de mídia cada 50 microliters na parte superior, média e inferior de um slide de vidro. Usando uma sonda dissecando, transfira de 5 a 10 terceiros larvas instar ou pupas precoces para a gota superior de mídia no slide. Agitar suavemente as larvas e pupas na mídia com a sonda dissecando para remover qualquer alimento ou detrito.
Use a sonda dissecando para girar uma única larva ou pupae de lado. Procure os dois testículos bilaterais que aparecem como estruturas ovais translúcidas no terço posterior do corpo. Animais que não têm testículos são fêmeas e devem ser descartados.
Quando uma larva macho ou pupaé é encontrada e está limpa, mova-a para a segunda gota de mídia. Repita até que três ou quatro larvas machos ou pupas tenham sido transferidas para a segunda gota de mídia. Em seguida, trabalhando na segunda gota de mídia, agarrar um único animal com um par de fórceps em sua região média, apenas antes dos testículos.
Use um segundo par de fórceps para arrancar suavemente o animal ao meio. Usando um par de fórceps, segure a extremidade posterior do animal no escorregador de vidro. Começando ao lado dos fórceps, empurre para baixo na cutícula usando a borda do bisturi.
Mova o bisturi para a extremidade cortada do animal. Isso expulsará os órgãos internos do animal, que incluem tripas, corpos gordos e testículos. Os testículos são órgãos ovais incolores e quase transparentes embutidos em fitas de corpo gordo.
Provoque suavemente os testículos do resto dos órgãos. Para transferir os testículos um de cada vez, insira a borda do bisturi sob o corpo de gordura, levante o tecido para fora da mídia e mova-o rapidamente para a terceira gota. Se não houver corpo de gordura suficiente ainda preso aos testículos para levantar o tecido com o bisturi use uma pipeta pasteur de vidro que foi pré-enfeitigueda com meio de dissecção.
Trabalhando na terceira gota de média, use a extremidade afiada do bisturi para cortar suavemente o excesso de gordura do corpo dos testículos, deixando apenas uma pequena borda de corpo gordo ao redor das bordas. Primeiro, use a seringa do filtro para depositar uma única gota do meio de Schneider cerca de 30 microliters no centro de um prato de cultura permeável de 50 milímetros. Usando a ferramenta bisturi ou uma pipeta Pasteur pré-enlatado transfira até cinco dos testículos preparados para a queda no prato.
Em seguida, use a ferramenta bisturi para empurrar suavemente os testículos para baixo na membrana permeável do gás, e para o centro da gota de meio. Usando uma seringa de um mililitro, coloque quatro gotas de óleo de halocarbono na membrana permeável do gás em torno da gota de médio. Os locais das gotas devem corresponder aos quatro cantos de uma tampa de classe de 22 milímetros.
Em seguida, alinhe os cantos de uma tampa de vidro de 22 milímetros com as quatro gotas de óleo de halocarboneto e abaixe suavemente a mancha de cobertura na mídia e óleo. Deixe que a tampa se instale, e para a mídia que contém os testículos a propagação entre as gotas de óleo. Coloque o prato de cultura sob um microscópio dissecando.
Para remover o excesso de mídia, insira o canto de uma tarefa delicada limpar sob a mancha de cobertura. Afasta a mídia suficiente para a tampa de vidro para fazer contato com a superfície do maior testis. Não remova muita mídia e abaixe o deslizamento de tampas muito longe.
Isso exercerá pressão sobre os testículos e pode causar a ruptura. Por fim, coloque uma gota de óleo de imersão na tampa de vidro logo acima dos testículos. Vire o prato e coloque-o no palco do microscópio.
Mova o objetivo do microscópio de 40 ou 60 X para o óleo até que ele esteja logo abaixo dos testículos. Use a luz transmitida para encontrar um único testis e trazê-lo em foco. Coloque 0,5 mililitros de 8% de paraformaldeído em PBSTx em um poço de um prato de nove bem dissecando.
Use uma pipeta pasteur de vidro para transferir até 10 dos testículos para o poço. Certifique-se de que os testículos estão deitados na parte inferior do poço. Após 20 minutos, transfira os testículos para um poço contendo 0,5 mililitros de PBSTx.
Lave os testículos agitando suavemente por cinco minutos. Lave mais duas vezes em novos poços com PBSTx fresco. Prepare uma diluição do anticorpo primário em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito no manuscrito.
Em seguida, transfira os testículos do prato de dissecação de vidro de nove poços para o tubo. Incubar o tubo durante a noite a quatro graus Celsius com balanço suave ou nozes. O procedimento para coloração dos testículos com o anticorpo secundário é semelhante.
Veja o manuscrito para obter detalhes. Primeiro, usando uma pipeta Pasteur, transfira os testículos da placa de nove poços para um slide de microscopia de vidro. Se necessário, use a borda do bisturi para empurrar os testículos para baixo na superfície do slide.
Em seguida, use o canto de uma delicada limpeza de tarefas para afastar o excesso de líquido dos testículos. Remova o máximo de líquido possível. Em seguida, aplique uma gota de 30 a 50 microliter de microscopia de montagem média para os testículos.
Por fim, coloque um deslizamento de cobertura de 22 milímetros sobre a gota do meio de montagem. Deixe que a mancha de cobertura se instale e o meio de montagem se espalhe sob a mancha de cobertura. Se necessário, aplique uma pressão suave na tampa para espremer o excesso de montagem média e permitir que a mancha de cobertura repouse sobre a superfície dos testículos.
Quando este protocolo é executado com sucesso, a organização celular dos testículos é preservada, e a progressão da diferenciação celular de uma extremidade do test é para a outra é visível. Os espermatotozóides prestes a começar a meiose e os da metafásia podem ser identificados. Em testes preparados por meio deste protocolo, a análise de imagem ao vivo mostra a reorganização dinâmica do ânticulo endoplasmático e micro túbulos na divisão dos espermatocitotas.
Como descrito no protocolo, deve-se tomar muito cuidado para não aplicar pressão que faz com que os testículos explodam. Cistos de espermatototos fluem rapidamente de um testíase rompido, dificultando a imagem do lapso de tempo ao vivo. Este protocolo é otimizado para imagens que dividem espermatototas em tecido vivo e intacto.
Portanto, é essencial que os testículos não sejam danificados durante a dissecção ou montagem. Nosso método também deve ser adequado para técnicas de imagem de super resolução, como microscopia de iluminação estruturada, fornecendo novas percepções sobre processos subcelulares dinâmicos que regem a divisão celular.
