Name: an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
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We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê de animais institucional a Fundação de Pesquisa Infantil de Cincinnati. Para este estudo, as células estaminais hematopoiéticas foram isoladas a partir da medula óssea de ratinhos C57BL / 6 com idade consanguínea 2 - 4 meses. Separação de células utilizando FACS após coloração da BM com diferentes fabricantes de superfície, incluindo Linhagem, c-kit, Sca-1, Flt3 e CD34 foi utilizada para a purificação de HSC baseado em Lin Sca-1 + Flt3 c-kit + - estratégia gating - CD34 como protocolo padrão descrito anteriormente 8. CUIDADO: Vários produtos químicos altamente tóxicos são utilizados durante este procedimento. Estes são tóxico por inalação e contato com a pele. Por favor, use luvas e vestuário de protecção. Trabalhar no exaustor ao trabalhar com esses produtos químicos. 1. células, a fixação, coloração e Pré-incorporação <ol><li> Classificar 10.000 células-tronco hematopoéticas (usando Lin - Sca-1 <sup&gt; + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating estratégia; LT-HSC população) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 600 ul de Iscove modificado por Dulbecco Médio (IMDM) com soro fetal bovino a 10%, utilizando FACS. </li><li> Girar HSCs ordenadas a 1.000 xg durante 10 min num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, utilizando uma centrífuga com baldes swing-out. Remova o meio por aspiração suave e deixar 200 ï¿½ de meio nos tubos em cada etapa. Nesta fase, o sedimento celular permanece invisível no tubo. </li><li> Fixar as células por adição de 0,2 ml de solução fixadora 2x à temperatura ambiente (TA) durante 1 h 1,9. <ol><li> Faça a solução fixadora fresco antes da utilização. Em 1x, a solução é composta por 3% de paraformaldeído e 2,5% de glutaraldeído em tampão de cacodilato 0,1 M. </li></ol></li><li> Centrifugar as células a 1000 xg durante 10 min a 30 ° C, utilizando uma centrífuga com baldes swing-out. </li><li> Lavar as células com 600 uL de tampão de 0,1 M de cacodilatousando centrifugação e deixar tampão 200 ul no tubo após centrifugação. </li><li> Corar as células fixadas pela adição de 200 ul de solução de 2 mg / ml de azul de Evans em tampão cacodilato e incubar durante 20 min à TA. As células serão de cor azul. </li><li> Lavar as células 3 vezes com 600 ul de tampão de cacodilato 0,1 M utilizando a centrifugação e deixar tampão 200 ul no tubo de cada vez. </li><li> Re-suspender as células em 200 ul de tampão e transferir a suspensão de células para um tubo de 0,5 ml. Centrifugar a 1.000 xg durante 10 min usando uma centrífuga de bancada. Remover tampão suavemente, sem perturbar o sedimento celular pequena agora visível, e deixar tampão 50 ul no tubo. </li><li> Adicionar 200 mg de baixo ponto de fusão de agarose a 5 ml de tampão de cacodilato 0,1 M no tubo de 15 ml de uma solução de agarose a 4%. Derreter a agarose por transferência do tubo de água fervente em uma garrafa de vidro de 100 ml e manter morno até ser utilizado. </li><li> Adicionar 200 mL de 4% baixo ponto de fusão agarose dissolvido em cacodyla 0,1 Mtampão TE para a suspensão de células em tubos de 0,5 ml e imediatamente centrifugar a 1000 xg durante 10 min a 30 ° C usando uma centrífuga de bancada. </li><li> Depois de confirmar que as células sedimentadas no fundo do tubo de 0,5 ml em agarose semi-sólida após a centrifugação, transferir imediatamente o tubo a 4 ° C ou de gelo durante 20 minutos para solidificar a agarose. Este passo é muito crítica, como um pequeno agregado de células visíveis nesta etapa resulta num bom grupo de células sob o microscópio electrónico. </li><li> Transferir cuidadosamente a agarose solidificada contendo o sedimento de células a partir do tubo de plástico para uma placa de Petri de 35 mm contendo tampão usando uma agulha de 27 G 3,10. </li><li> Aparar a agarose solidificadas contendo o sedimento de células em um pedaço de cerca de 1 - 2 mm com um bisturi. Transferir o pedaço de agarose contendo o sedimento de células para um novo tubo de 1,5 mL. </li><li> Lave 2 - 3 vezes usando 600 ul de tampão de 0,1 M de cacodilato, adicionando e removendo tampão que usa a pipeta sem centrifugação. Use este pedaço de agarose contendo o sedimento de células para o próximo passo. Nesta etapa, a amostra pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite, antes de passar ao passo seguinte. </li></ol> 2. Osmification, desidratação, Embedding <ol><li> Remover o tampão de cacodilato a partir do tubo de 1,5 ml com o sedimento celular contendo agarose, utilizando uma pipeta. Adicionar 1,0 ml de 1% de tetróxido de ósmio (OsO4) solução num exaustor de fumos, e incubar durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Lavar três vezes com 600 ul de tampão de cacodilato 0,1 M e transferir a amostra para um frasco de cintilação de 20 ml de vidro com uma tampa. </li><li> Processar a amostra para a desidratação, infiltração e embutir em resina (por exemplo, LX-112) com as mudanças de série dos seguintes soluções em uma placa de 6 bem. Mover a peça de agarose de células-pellet usando uma pinça. <ol><li> Imergir a amostra em 25% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Imergir a amostra em 50% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Imergir a amostra em 75%etanol à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Imergir a amostra em 95% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Imergir a amostra em 100% de etanol à temperatura ambiente durante 15 min, duas vezes. </li><li> Imergir a amostra em etanol: resina (3: 1) à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Imergir a amostra em etanol: resina (1: 1) à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Imergir a amostra em etanol: resina (1: 3) à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Imergir a amostra de resina pura à temperatura ambiente durante 60 min, duas vezes. </li></ol></li><li> Transferir a amostra para a parte inferior da ponta em forma de pirâmide do molde de borracha com a pinça e cuidadosamente adicionar mais resina pura no topo da amostra para encher o molde. Incubar a amostra a 60 ° C durante 72 horas, para a polimerização da resina. </li><li> Retirar a pirâmide de resina polimerizada a partir dos moldes, torcendo o molde de borracha. Um pequeno aglomerado negro de células devem ser visíveis na pirâmide resina polimerizada, conforme descrito anteriormente 7. Anexar a pirâmide de resina polimerizada no cilindro de montagem usando cianoacrilato. </li></ol><ol><li> Apare o bloco de pirâmide com uma lâmina de barbear e uma faca de diamante após a montagem do bloco em um ultra-micrótomo. Adicione uma forma trapezoidal de largura curto com a parte superior e a parte inferior do bloco paralelas entre si, e com os lados uniformemente inclinada. Esta forma de pirâmide ajuda para o seccionamento em série. </li><li> Além disso, cortar o bloco em torno do pellet celular com a faca de diamante e remover os perfis de plástico ao redor do pedaço de agarose pellet celular. </li><li> Corte 1 mm seções usando um ultra-micrótomo. Mova os 1 mm seções do barco da água para uma lâmina de vidro usando uma ferramenta de cílios e uma ferramenta alça de metal conforme relatado anteriormente 7. seções de transferência em slides e slides de transferência para a placa de aquecimento (37 ° C) para a secagem. </li><li> Adicionar uma gota de solução de azul de toluidina para as secções, utilizando uma seringa equipada com filtro de 0,22 um e incubar durante 3 min. Lavar as lâminas com água destilada e let as secções secar. Verifique com um microscópio de luz para identificar a posição das células. </li><li> Cortar seções ultra-finas (70 - 100 nm) usando uma faca de diamante. Mova 2 - 3 seções sobre grelhas de 200 malha do barco da água para uma placa de Petri de vidro usando uma ferramenta de cílios. </li><li> Transferir a placa de Petri de vidro contendo grades com secções sobre uma placa quente a 30 ° C para secar secções durante 30 min. </li><li> Corar as grades com gotas de 1% de acetato de uranilo à TA durante 10 min e, em seguida, lavar em água destilada 6 - 8 vezes. Mancha com citrato de chumbo de Reynolds, à TA, durante 5 min e lavar em água destilada 6 - 8 vezes. Transferir a placa de Petri de vidro contendo as grades sobre uma placa quente a 37 ° C para secar secções. </li><li> Analisar as seções com um microscópio eletrônico, a 80 kV 7. </li></ol>

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	<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy.">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy.">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li><li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy.">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li><li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li><li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+(TEM)+of+rare+cell+populations.">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reactions+between+formaldehyde,+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide,+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks.">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li><li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils:+immunocytochemical,+molecular,+and+biochemical+studies.">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation.">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Este método permite a análise TEM em números de celulares de baixo, usando Evans coloração azul e agarose a incorporação de localizar um pellet de células pequenas durante a desidratação, inclusão em resina e seccionamento processos. É importante notar que mantém agrupamentos de células em conjunto e preserva a ultra-estrutura celular, o que é desejável para examinar várias células para quantificação de dados. Em estudos TEM, um sedimento celular, contendo milhões de células é muitas vezes necessária para embebimento eficiente em uma matriz de agarose / gelatina e para lavagens, desidratação e infiltração para obter dados a partir de numerosas células. Os investigadores adoptaram imobilização da suspensão de células em uma resina polimerizada BSA-bisacrilamida, coloração de monocamadas sobre um suporte fino, ou citospinas para análise de TEM em baixos números de células / escassos amostras 4-6. No entanto, continua a ser um trabalho entediante para localizar e cortar as células sob a ETM, devido à distribuição escassa das células dentro da matriz epossíveis alterações da morfologia celular, devido à divulgação e uma clivagem entre as células durante a preparação cytospin que muitas vezes necessários reincorporação antes do corte. Além disso, a monocamada continua sendo um desafio para localizar para seccionamento 11. Assim, um agregado de células, mesmo a partir de amostras biológicas escassos do número de células de baixa é muito mais fácil para a análise TEM 1. Este método representa uma vantagem significativa para os métodos publicados anteriores 4,5 em termos de análise ultra-estrutural qualitativa e quantitativa de amostras limitadas. Juntos, este protocolo descreve uma maneira eficiente para localizar os sedimentos celulares para TEM utilizando azul de Evans, o que torna o processamento de amostras de números de celulares de baixo fáceis para TEM para permitir a análise de dados qualitativos e quantitativos. Tipicamente, a preparação de amostras para TEM requer um maior número de células do que o que é geralmente necessário para a microscopia de luz, por causa dos múltiplos passos de processamento da amostra Fou TEM e orientação correta do bloco de celas para o corte na posição correta 1,10. Sabe-se que o pós-fixação osmification fornece um melhor contraste nas imagens, particularmente aqueles de membranas e partículas de glicogênio sob um microscópio electrónico de 9, e ainda mais coloração suporte com acetato de uranilo, uma mancha relativamente não específico para as proteínas, e citrato de chumbo que mancha membranas, ácidos nucleicos e glicogénio. No entanto, osmification é quase impossível de realizar com amostras biológicas escassos em suspensão após pré-incorporação em BSA-BA devido à alta probabilidade de perda de amostra durante o corte e escurecimento da matriz. Assim, a qualidade das micrografias electrónicas foi comprometida em estudos anteriores 4,9. Osmification aqui levou ao escurecimento do sedimento celular com uma mudança mínima na cor da agarose. Assim, o presente protocolo permite osmification após pré-incorporação em agarose, de modo a proporcionar um bom contraste em MET imas idades. grupos de células foram bastante fácil de analisar com microscopia eletrônica utilizando este método. O pré-coloração com azul de Evans ajudou a localizar pequenas pelotas de células durante a preparação da amostra sem afetar sub-organela detalhes celulares. Este método oferece uma abordagem alternativa para a preparação de amostras para realizar com êxito a partir de análise de TEM números celulares baixas. Neste método, a análise TEM foi efectivamente realizada utilizando células de um tamanho pequeno (5-8 um). Assim, esta abordagem pode facilmente ser adoptada com o número de células ainda mais baixa (~ 1.000 células) de células maiores, tais como fibroblastos e as células endoteliais. Apesar de azul de Evans não afetou detalhes celulares sub-organela no presente estudo, o uso de azul de Evans para microscopia eletrônica de imuno-ouro com o número de células baixas não foi testada. Em conjunto, um método eficiente para a preparação de amostras para realizar estudos de MET a partir de um número de células de baixo está descrito. TEM estudos são necessários para revelar Critical informações sobre a morfologia e as ultra-estruturas de células. Por isso, a informação ultra-estrutural é muitas vezes ausente em várias populações de células escassos. Esta alternativa e nova abordagem para a preparação da amostra será útil para realizar estudos TEM de qualquer população de células raras. Além disso, este método permite que os dados qualitativos e quantitativos da análise de agrupamentos de células. Como microscopia eletrônica oferece detalhes inigualáveis ​​da ultra-estrutura e organização celular, este método vai ser muito útil para compreender muitos processos biológicos na chave, mas raro, populações de células.

Detalhes ultra-estruturais e sub-organela das células foram revelados principalmente por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) estudos de tecidos ou pellets de células 1,2. peças sólidas de tecidos pode ser facilmente utilizada para estudos de microscopia electrónica. No entanto, análises de MET 1,3 em células em suspensão e necessitam de permanecer desafiador números elevados de células, isto é, milhões de células. Devido a isso, análises de ultra-estruturais das populações de células raras em suspensão, por exemplo, células estaminais hematopoiéticas (HSCs), não são facilmente avaliados. Várias tentativas para análise de TEM de amostras usando escassos cytospin ou monocamada abordagens não conseguem obter os dados quantitativos significativa do número limitado de células. Deste modo, a exigência de um elevado número de células limita a utilização desta ferramenta poderosa para compreender os detalhes ultraestruturais subcelulares de populações de células raras. Uma limitação fundamental para estudos TEM com um número limitado de célulass em suspensão, é a localização das células para o processamento e, portanto, a partir de estudos TEM células limitadas com tamanhos especialmente pequenos permanecem desafiador. Várias abordagens alternativas foram adotadas para contrariar esta limitação: a BSA / bisacrilamida (BSA-BA) polimerização mediada de suspensão de células, a coloração das células com um corante para torná-los visíveis num suporte de película fina incluindo lamelas, e analisa MET a partir de preparações de Cytospin 4-6. No entanto, o sucesso muito limitado foi alcançado, como muito poucas células foram encontrados nas secções após ultra-seccionamento. O principal desafio de identificar células esparsas persiste porque a monocamada de células permanece praticamente invisível no gel solidificado para seccionamento. Além disso, a preparação Cytospin de células pode alterar a sua organização celular devido ao espalhamento das células e a fragilidade da estrutura celular. Por conseguinte, estes inconvenientes inerentes garante uma nova abordagem para a realização de estudos de MET a partir de populações de células raras com maisconsistência. Para ultrapassar este problema, nós descrevemos um método novo e preparação de amostras alternativa para estudos TEM de populações de células raras 7. Aqui, descrevemos um protocolo de preparação da amostra eficiente para realizar TEM de amostras biológicas escassos com resultados qualitativos e quantitativos consistentes. O azul de Evans foi realizada a coloração após a fixação de localizar um pequeno agregado de células a partir de células baixo número, ou seja, 10.000 tronco hematopoiéticas da medula óssea e células progenitoras que de outra forma teriam permanecido invisível, e o sedimento foi incorporado em agarose antes de processos de desidratação e de resina de incorporação. Este método agrupa as células em conjunto e permite a análise eficiente da ultra-estrutura e organização subcelular das células estaminais hematopoiéticas (identificado como Lin - Sca-1 + c-kit + Flt3 - CD34 -; HSC), um raro 0,2 - população de células 0,5% na medula óssea. Este pro experimentalprotocolo pode ser útil para realizar estudos ultra-estruturais e obter resultados quantitativos sobre muitas populações raras, mas muito importantes.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>15713</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>16350</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Cacodyladate buffer&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 &amp;deg;C. &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td></tr><tr><td>Evans Blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Low melting agarose&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>19130</td><td>1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; stock, &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LX-112 Embedding Kits (LADD&amp;reg;)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (Nadic methyl anhydride)</td><td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Uranyl acetate (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>composition: NaCl, NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>Pyramid tip mold&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>mounting cylinders</td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-microtome&amp;nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mesh grids (nikil)</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope</td><td>Hitachi model H-7650&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image capture engine software</td><td>AMT-600&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastic Petri dishes</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass scintillation vials&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eyelash tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal Loop tool&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornece detalhes sobre a organização celular e ultra-estrutura. No entanto, a análise TEM de populações de células raras, especialmente as células em suspensão, tais como células estaminais hematopoiéticas (HSCs), permanece limitada devido à exigência de um elevado número de células durante a preparação da amostra. Há um cytospin ou monocamada algumas abordagens para a análise de MET a partir de amostras escassos, mas estas abordagens não conseguem obter os dados quantitativos significativos do número limitado de células. Aqui, uma abordagem alternativa e inovadora para preparação de amostras em estudos TEM é descrito para populações de células raras que permite a análise quantitativa. Um número de células relativamente baixa, ou seja, 10.000 HSCs, foi utilizado com sucesso para a análise de TEM em comparação com os milhões de células, tipicamente utilizados para estudos TEM. Em particular, Evans azul coloração foi realizada após paraformaldeído-glutaraldeído (PFA-GA) de fixação para visualizar o pequeno pel celularvamos, o que facilitou a incorporação de agarose. Aglomerados de numerosas células foram observadas em seções ultra-finas. As células tinham uma morfologia bem conservada, e os detalhes de ultra-estruturais das mitocôndrias e vários complexos de Golgi eram visíveis. Este protocolo eficiente, fácil e reprodutível permite a preparação da amostra a partir de um número de células de baixo e pode ser usado para a análise TEM qualitativa e quantitativa sobre as populações de células raras a partir de amostras biológicas limitados.

Um protocolo eficiente e consistente para a preparação da amostra para realizar a análise TEM de baixo número de células é descrito. Coloração pós-fixação com azul de Evans e da transferência de células para um tubo de 0,5 ml de microcentrífuga ajudou a visualizar o pequeno pellet celular 7. Osmification com tetróxido de ósmio em agarose levou a uma detecção fácil do sedimento celular escuro durante a desidratação e a incorporação. Secções semi-finas dos blocos que contêm um aglomerado de células pequenas confirmou um aglomerado de várias células em conjunto (Figura 1A e 1B). Seções ultra-finas foram cortadas da área do cluster de células e analisado sob microscopia eletrônica (Figura 1C). A morfologia e ultra-estrutura destas células foram bem preservadas (Figura 1D). A micrografia eletrônica de célula individual mostrou alto nível de detalhes sobre o intracelularultra-estruturas (Figura 1E). Além disso, as imagens (50,000X) elevada ampliação, mostraram uma estrutura bem preservados e a integridade de organelos subcelulares, tais como mitocôndrias (Figura 1F). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54724/54724fig1.jpg" /> Figura 1: Análise de Imagem sob a luz e Microscópio Eletrônico. (A) imagem de baixa ampliação uma área representativa de uma secção corada com azul de toluidina de uma m de espessura sob microscópio de luz. Imagem de microscópio de luz que mostra a morfologia das células intactas em conjunto, após coloração com azul de toluidina de uma secção de espessura iM (B). (C) Um campo de visão geral do grupo de células observadas ao microscópio de electrões, após coloração com acetato de uranilo e citrato de chumbo. (D) Um único LT-HSC sob microscópio eletrônico. (E) magnif Superiorimagem icação de HSC mostrando estruturas subcelulares. (F) imagem Maior ampliação de mitocôndrias de HSPC. Barra de escala: de A / B, 100 ^ M; C, 10 ^ M; D, 2? M; E / F, a 500 nm. &#160; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54724/54724fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

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Biology

13.6K visualizações.  Cincinnati Children’s Research Foundation. Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis. 

Vídeo: An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these stressors are combined there may be synergistic effects that enable unique microstructural evolution mechanisms to activate. Understanding of these mechanisms is necessary for the input and refinement of predictive models and critical for engineering of next generation materials. The basic physics and underlying mechanisms require advanced tools to be investigated. The in situ ion irradiation transmission electron microscope (I&#179;TEM) is designed to explore these principles.
To quantitatively probe the complex dynamic interactions in materials, careful preparation of samples and consideration of experimental design is required. Particular handling or preparation of samples can easily introduce damage or features that obfuscate the measurements. There is no one correct way to prepare a sample; however, many mistakes can be made. The most common errors and things to consider are highlighted within. The I&#179;TEM has many adjustable variables and a large potential experimental space, therefore it is best to design experiments with a specific scientific question or questions in mind.
Experiments have been performed on large number of sample geometries, material classes, and with many irradiation conditions. The following are a subset of examples that demonstrate unique in situ capabilities utilizing the I3TEM. Au nanoparticles prepared by drop casting have been used to investigate the effects of single ion strikes. Au thin films have been used in studies on the effects of multibeam irradiation on microstructure evolution. Zr films have been exposed to irradiation and mechanical tension to examine creep. Ag nanopillars were subjected to simultaneous high temperature, mechanical compression, and ion irradiation to study irradiation induced creep as well. These results impact fields including: structural materials, nuclear energy, energy storage, catalysis, and microelectronics in space environments.

Sample preparation techniques are outlined with specific considerations for in situ ion irradiation TEM experiments. Ion species, energy, and fluence are discussed with methods for how to select and compute them. Finally, procedures for conducting an experiment are described and accompanied by the representative results.

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these ...

Engenharia

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers of multi-layered samples. This removal of layers prior to plunge freezing can aid in reducing sample thickness to a level suitable for cryo-EM data collection, improving sample flatness, and facilitating image processing. The peel-blot technique allows for the separation of multilamellar membranes into single layers, of layered 2D crystals into individual crystals, and of stacked, sheet-like structures of soluble proteins to likewise be separated into single layers. The high sample thickness of these types of samples frequently poses insurmountable problems for cryo-EM data collection and cryo-EM image processing, especially when the microscope stage must be tilted for data collection. Furthermore, grids of high concentrations of any of these samples can be prepared for efficient data collection since sample concentration prior to grid preparation can be increased and the peel-blot technique adjusted to result in a dense distribution of single-layered specimen.

The peel-blot technique is a cryo-EM grid preparation method that allows for the separation of multilayered and concentrated biological samples into single layers to reduce thickness, increase sample concentration, and facilitate image processing.

A Técnica Peel-Blot: Um Método de Preparação de Amostras Crio-EM para Separar Camadas Individuais de Amostras Biológicas Multicamadas ou Concentradas

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Bioquímica

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

Otimizando a preparação de amostras para microscopia eletrônica criogênica

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

Uma abordagem imparcial de amostragem TEM seções em neurociência

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Neurociência

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-Microscopia Eletrônica de Preparação de Amostras por meio de um Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Biologia

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Preparação e observação de amostras biológicas Grosso por Scanning Transmission Electron Tomografia

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo otimizado para preparação de amostras organoides retinianas para TEM

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Analisando a ultraestrutura sináptica em organoides retinianos maduros usando TEM

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

Preparação de amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM

Resumo

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Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

A Técnica Peel-Blot: Um Método de Preparação de Amostras Crio-EM para Separar Camadas Individuais de Amostras Biológicas Multicamadas ou Concentradas

Otimizando a preparação de amostras para microscopia eletrônica criogênica

Uma abordagem imparcial de amostragem TEM seções em neurociência

Cryo-Microscopia Eletrônica de Preparação de Amostras por meio de um Focused Ion Beam

Preparação e observação de amostras biológicas Grosso por Scanning Transmission Electron Tomografia

Preparação de amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão

Preparação de amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão

Preparação de amostras de organoides retinianos para microscopia eletrônica de transmissão

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão