The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.

Todos os ratos foram mantidos e tratados de acordo com a Lei de Bem-estar animal suíço e em conformidade com os regulamentos do escritório Cantonal Veterinária, Zurique. 1. Preparação da dissecção Material, Meios de Cultura, microfluídicos <ol><li> Autoclave pinças micro-dissecção e tesouras (121 ° C, o tempo de esterilização: 20 min) e armazená-los em um recipiente estéril. </li><li> Esterilizar lamelas de vidro (24 mm x 24 mm), incubando-as em HCl 1 M durante 24 h num agitador orbital a 37 ° C. Lavar três vezes com estéril, H2O destilada e três vezes com etanol a 99%. A seco seguida as lamelas a 37 ° C ou sob câmara de fluxo estéril. Finalmente, autoclave ou expor as lamelas a luz UV (30 min) para completar a esterilização. As lamelas podem então ser armazenados em etanol a 70%. </li><li> Remova cuidadosamente os dispositivos de isolamento AXIS Axon do pacote usando uma pinça estéril e colocá-los em uma placa de Petri estéril. </li&gt; <li> Usando uma biópsia estéril (o: 1 mm) criar um buraco por amostra a ser cultivadas (Figura 1), em correspondência com as câmaras de cultura. NOTA: Não perfurar demasiado perto das estrias, pois eles podem ser danificados pela pressão aplicada. </li><li> Esterilizar os dispositivos de isolamento AXIS Axon por imergindo-los em etanol a 70%. Seca, então AXIS Axon dispositivos de isolamento e lamelas completamente sob uma capela de fluxo estéril. Espere um mínimo de 3 horas antes de prosseguir. NOTA: secagem incompleta resultará em conjunto com defeito de dispositivos microfluídicos. </li><li> Colocar em cada lamela de 35 mm numa caixa de Petri ou num poço numa placa de 6 poços. </li><li> Coloque o dispositivo de isolamento AXIS Axon na lamela e pressione delicadamente mas com firmeza com uma pinça com extremidades dobradas a fim de permitir a adesão completa entre o dispositivo de isolamento ea lamela de vidro. </li><li> Em cada câmara de cultura, pipeta 150 uL de poli-D-lisina (0,1 mg / ml em estéril, destilada H 2O). Colocar os dispositivos de microfluidos sob vácuo durante 5 minutos, a fim de remover todo o ar das câmaras de cultura. </li><li> Se o ar ainda pode ser visto dentro das câmaras, re-pipeta a solução de poli-D lisina para as câmaras. </li><li> Incubar os dispositivos com poli-D-lisina O / N a 37 ° C. </li><li> Lavar três vezes com câmaras estéreis, H2O destilada </li><li> Encha as câmaras com 150 ul de solução de trabalho laminina (Sigma-Aldrich, 5 ug / ml, em PBS ou meio isento de soro), e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Preparar 50 ml de meio de culturas de gânglios do trigémeo 37, composto como se segue: 48 ml de meio Neurobasal, 1 ml de B-27, 100 U de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, fator / ml de penicilina / 5 ng / mL de crescimento do nervo (NGF) , 12:25 citosina arabinósido. </li><li> Preparar 50 ml de meio de culturas de germe de dente 37, a seguinte composição: 40 ml de DMEM-F12, 10 ml de soro fetal bovino (FBS, concentração final: 20%), 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 150 ug / ml de ácido ascórbico. </li></ol> 2. mouse Embryo Geração e Dissection <ol><li> Determinar a idade embrionária de acordo com plugue vaginal (plug vaginal: dia embrionária de desenvolvimento 0.5, E0.5) e confirmá-la através de critérios morfológicos. Para este protocolo, geralmente usamos embriões E14.5-E17.5 rato. </li><li> Limpe a área de dissecção eo estereoscópio com etanol 70%. </li><li> Sacrifique a mãe grávida via deslocamento cervical. Bloquear o pescoço do rato com o primeiro e segundo dedo dentro de uma grade, e puxar com a decisão da cauda. </li><li> Dissecar a pele ao redor do abdômen inferior, e abrir o abdômen com uma tesoura. Localize o útero: durante estas fases tardias da gravidez, o útero abundantemente encher a cavidade abdominal. </li><li> Dissecar o útero e coloque em um tubo cheio de PBS em gelo. Quando em gelo, o tecido pode ser deixado para várias horas. Descarte o cadáver da mãe de acordo com as diretrizes institucionais </li> &lt;li&gt; Dissecar os embriões do útero e libertá-los de seus tecidos extra-embrionário. Coloque os embriões em PBS em gelo. </li><li> Decapitar os embriões utilizando uma tesoura, e separar o maxilar inferior do resto da cabeça com uma tesoura de micro-dissecção (Figura 2A). Remover precisamente o maxilar inferior, sem danificar o gânglio trigeminal; em que esta última está localizada na proximidade da mandíbula inferior, o seu dano acidental é possível. Preservar a mandíbula e o resto da cabeça em PBS frio, em gelo. </li><li> Para dissecar TG, pegue a cabeça e colocá-lo em uma placa de Petri de vidro dissecação, anteriormente preenchido com PBS frio. Usando fórceps, remover a pele e o crânio. Remove então o telencéfalo e ao cerebelo, colocando uma pinça abaixo do telencéfalo e elevador; do telencéfalo e ao cerebelo vai virar em conjunto, deixando a parte inferior da cabeça exposta. </li><li> Localizar o gânglio trigeminal (mostrado na Figura 2B). Use a pinçapara separar o TG a partir dos nervos trigeminais. Elimine os restos das projeções do trigêmeo utilizando as agulhas de dissecação como facas. Inserir o TG dissecados numa caixa de Petri cheio com PBS frio e mantê-los em gelo. </li><li> Para dissecar dentes embrionárias, coloque a mandíbula inferior, previamente separado do crânio, sobre o vidro dissecção placa de Petri, cheio de frio PBS. Usando agulhas de dissecação como facas, retirar a língua ea pele ao redor da mandíbula. Separa-se o hemi-mandíbulas esquerdo e direito através do corte ao longo da linha média da mandíbula. Os germes dentários são facilmente visíveis, como mostrado na Figura 1C. Isolar os germes dentários utilizando agulhas de dissecação e remover o excesso de tecidos não dentais. Coloque os germes dentários dissecados em uma placa de Petri preenchido com PBS frio e mantê-los no gelo. </li></ol> 3. microfluídicos Co-culturas <ol><li> Após a dissecção, remova laminina a partir dos dispositivos microfluídicos. Encha as câmaras com 200 ul da respective mídia. </li><li> Com uma pinça, transferir suavemente os TG e dente germes dissecados nos orifícios criados por perfuração (Figura 1D). Certifique-se de que os germes dentários não flutuam e que eles afundam até que entre em contato com as lamelas. </li><li> Cultura as amostras em estufa a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Alterar o meio de cultura a cada 48 horas. Não esvaziar as câmaras completamente, e não pipetar diretamente para as câmaras de cultura. O esvaziamento completo de câmaras que resultam na formação de bolhas de ar no interior das câmaras; pipetagem direto para a câmara iria resultar em lesão axonal. Para evitar estes problemas, o meio de remover a pipeta apontando para o lado externo das cavidades; Do mesmo modo, pipetar o meio fresco no lado das cavidades localizadas de frente para as câmaras. </li><li> Durante o período de cultura, co-culturas podem ser facilmente visualizados por microscopia de lapso de tempo. Co-culturas pode ser mantida por mais de 10 dias. </li><li> Após a cultura period, lavar as câmaras por pipetagem de 150 ul de PBS por poço para uma câmara, e permitindo PBS fluir através das câmaras de três vezes. </li><li> Remover o PBS e fixar as amostras por pipetagem de 150 uL de paraformaldeído a 4% (em PBS) por poço em uma câmara; incubar à TA durante 15 min. </li><li> Lavam-se as câmaras duas vezes com PBS como descrito em 3.6. </li><li> Avançar com a análise. </li></ol>

<ol>
	<li>Pagella, P., Jim&#233;nez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues.">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).</li><li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+dependence+in+tissue,+organ,+and+appendage+regeneration.">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).</li><li>Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-derived+sonic+hedgehog+defines+a+niche+for+hair+follicle+stem+cells+capable+of+becoming+epidermal+stem+cells.">Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells.</a> Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).</li><li>Katayama, Y., Battista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+sympathetic+nervous+system+regulate+hematopoietic+stem+cell+egress+from+bone+marrow.">Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow.</a> Cell. 124 (2), 407-421 (2006).</li><li>Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis.">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).</li><li>Knox, S. M., Lombaert, I. M. a., Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).</li><li>Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li><li>Oakley, B., Witt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+sensory+receptors+on+the+tongue.">Building sensory receptors on the tongue.</a> Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).</li><li>Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogenesis+of+mouse+vallate+gustatory+epithelium+and+taste+buds+requires+BDNF-dependent+taste+neurons.+Brain+research.">The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research.</a> Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).</li><li>Sun, H., Oakley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anterior+gustatory+epithelia+in+the+palate+and+tongue+requires+epidermal+growth+factor+receptor.">Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor.</a> Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).</li><li>Mistretta, C. M., Goosens, K. a., Farinas, I., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+size,+number,+and+morphology+of+gustatory+papillae+and+taste+buds+in+BDNF+null+mutant+mice+demonstrate+neural+dependence+of+developing+taste+organs.">Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs.</a> The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).</li><li>Mitsiadis, T. a., Graf, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+determination+during+tooth+development+and+regeneration.">Cell fate determination during tooth development and regeneration.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).</li><li>Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histological+study+of+the+innervation+of+developing+mouse+teeth.">A histological study of the innervation of developing mouse teeth.</a> Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).</li><li>Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+nerve+fibres+during+development+of+embryonic+rat+molar+using+peripherin+and+protein+gene+product+9.5+antibodies.">Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies.</a> Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).</li><li>Johnsen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+teeth:+qualitative,+quantitative,+and+developmental+assessment.">Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment.</a> Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).</li><li>Mitsiadis, T. a., Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+nerve+growth+factor+(NGF)+and+NGF+receptor+(NGF-R)+in+the+developing+first+molar+tooth+of+the+rat.">Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat.</a> Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).</li><li>Mitsiadis, T. a., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+in+odontogenesis.">Neurotrophins in odontogenesis.</a> The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).</li><li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation.">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).</li><li>Kettunen, P., L&#248;es, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+trigeminal+axon+navigation+and+patterning+with+tooth+organ+formation:+epithelial-mesenchymal+interactions+and+epithelial+Wnt4+and+Tgfbeta1+regulate+semaphorin+3a+expression+in+the+dental+mesenchyme.">Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme.</a> Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).</li><li>Tuisku, F., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+neural+influence+on+tooth+germ+generation+in+a+polyphyodont+species.">Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species.</a> Developmental biology. 165, 1-9 (1994).</li><li>Zhao, H., Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+shh+by+a+neurovascular+bundle+niche+supports+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+in+the+adult+mouse+incisor.">Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor.</a> Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).</li><li>Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+rudimentary+diastema+tooth+primordia+are+devoid+of+peripheral+nerve+fibers.">Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers.</a> Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).</li><li>Lumsend, A., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+study+of+timing+and+topography+of+early+tooth+development+in+the+mouse+embryo.">An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo.</a> Archives of oral biology. , 301-311 (1986).</li><li>Kollar, E., Lumsend, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+morphogenesis:+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation.">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li><li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+tooth+morphogenesis+and+neuronal+development+through+tissue+interactions:+lessons+from+mouse+models.">Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models.</a> Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro.">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li><li>Lumsend, A., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323 (9), 538-539 (1986).</li><li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage.">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li><li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro.">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).</li><li>Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Nogo-A+regulates+neurite+fasciculation,+branching+and+extension+in+the+developing+nervous+system.">Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system.</a> Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).</li><li>Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odontogenesis.">Odontogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 887, (2012).</li><li>Mitsiadis, T. a., Drouin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+Pitx1+genomic+locus+affects+mandibular+tooth+morphogenesis+and+expression+of+the+Barx1+and+Tbx1+genes.">Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes.</a> Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).</li><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li><li>Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll/interleukin-1+receptor+domain-containing+adapter+inducing+interferon-&#946;+mediates+microglial+phagocytosis+of+degenerating+axons.">Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-&#946; mediates microglial phagocytosis of degenerating axons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).</li><li>Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+on+microfluidics:+multimodal+analysis+for+studying+celll-cell+interaction.">Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction.</a> Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).</li><li>Neto, E., Alves, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+neurons+and+osteoblasts:+close+partners+in+a+microfluidic+environment.">Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment.</a> Integrative Biology. , (2014).</li><li>Pagella, P., Neto, E., Jim&#233;nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).</li><li>Connor, R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+maxillary+factor,+a+maxillary+process-derived+chemoattractant+for+developing+trigeminal+sensory+axons.">Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons.</a> Neuron. 24, 165-178 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Anterior estudos in vitro de inervação do dente foram baseados em co-culturas convencionais de gânglios do trigémeo e tecidos dentais ou células 26,28,29. Estes estudos foram conduzidos para investigar principalmente os efeitos atraentes dessas células ou tecidos em axônios sensitivos 38. Apesar de trazer avanços significativos no campo, várias questões técnicas foram levantadas. Germes dentários começar a degenerar após alguns dias de cultura 37. Com base nessas observações, os neurônios em crescimento e dentes nas mesmas condições de cultura prejudicar qualquer eventual análise de moléculas envolvidas na conversa cruzada entre estes dois tecidos. Condições ótimas de cultura são necessários para preservar o perfil molecular fisiológico dos gânglios trigêmeo e tecidos dentais. Sistemas microfluídicos têm sido utilizados até agora para co-cultura de neurônios e vários tipos de células em meios otimizados 34,36. Este sistema microfluídica pode representar mais fécompletamente a situação in vivo, onde os corpos celulares neuronais, terminais axonais e tecidos alvo são geralmente expostos a diferentes microambientes celulares e moleculares. Mais recentemente, dispositivos microfluidicos foram utilizados para co-cultura de osteoblastos e gânglios da raiz dorsal 36 todo. Recentemente, demonstrou que os gânglios do trigémeo e dentes são capazes de sobreviver durante longos períodos de tempo quando co-cultivadas em microcanais 37. Além disso, demonstrou-se que os dentes de diferentes estádios de desenvolvimento em manter estas condições in vitro, os mesmos efeitos repulsivos ou atractivos da inervação do trigémio que exibiram 37 in vivo. O protocolo descrito requer prática e destreza manual, em particular para a microdissecção de gânglios e dente germes trigêmeo. Gânglio trigeminal são facilmente rasgado durante a dissecção. Portanto, sugerimos o uso de agulhas de dissecação em vez de força dissecçãops, a fim de remover o tecido em torno do gânglio. Da mesma forma, um cuidado especial deve ser tomado ao dissecar germes dentários, a fim de evitar danos ao epitélio dente, enquanto que a separa dos tecidos mesenquimais ao redor. Além disso, durante o primeiro dia de co-cultura, em particular deve ser tomado cuidado no manuseamento da incubadora, tal como vibração excessiva pode prejudicar a aderência do gânglio trigeminal para a lamela cultura. Durante o período de co-cultura, os meios devem ser removidos e adicionado por pipetagem para os poços, no lado oposto às câmaras de cultura. Aspirantes ou pipetas meios de comunicação em proximidade das câmaras de cultura resultaria em lesão axonal. O protocolo descrito pode ser modificado para estudar a inervação de vários órgãos embrionários e tecidos embrionários e pós-natais ou tipos de células. Sistemas microfluídicos poderia representar uma plataforma apropriada para permitir períodos mais longos de cultura para o estudo das interações entre neurônios e crescente teeº. Além disso, a separação do neuronal do compartimento dental permite a análise dos efeitos da localização da proteína específica e quantificação 33,37. Os anticorpos de bloqueio ou proteínas recombinantes podem também ser adicionados aos compartimentos separados dos dispositivos microfluidicos para analisar os seus efeitos sobre os tecidos neuronais e dentários. Por exemplo, o tratamento de gânglios trigeminais com o NGF apoia a sobrevivência e crescimento neuronal permite. No entanto, neste trabalho NGF exógeno está ausente do compartimento do germe do dente, em que os sinais derivados do dente são o único responsável pela atracção ou repulsão neuronal. Da mesma forma, outras moléculas recombinantes, anticorpos ou drogas podem ser usadas para manipular o sistema em condições controladas. As principais limitações do protocolo apresentado reside no elevado custo relativo de dispositivos de microfluidos comerciais e essencialmente o 2D-configurar do sistema de co-cultura. De facto, apesar de órgãos inteiros pode ser culturad, ambos os órgãos e axónios crescer em condições de cultura 2D-aderentes sobre uma lamela de vidro; personalização do sistema seriam necessários de modo a obter uma representação tridimensional, de inervação realista. Em conclusão, os dispositivos microfluidicos são ideais para investigar o papel da inervação no desenvolvimento ou regeneração de órgãos e permitir o estudo de interacções entre tecidos neuronais e de destino em condições de cultura optimizadas.

Inervação desempenha um papel chave no desenvolvimento, homeostase e regeneração de órgãos e tecidos 1,2. Além disso, a inervação está envolvido na regulação da proliferação de células estaminais, diferenciação e mobilização 3-5. Com efeito, estudos recentes realizados em tecidos do complexo orofacial têm mostrado que os nervos parassimpáticos são necessários para a função de células progenitoras epiteliais durante o desenvolvimento e regeneração das glândulas salivares 6,7. Da mesma forma, foi demonstrado que a inervação é necessário para o desenvolvimento e manutenção de paladar 8-11. Assim, é importante analisar as funções ainda negligenciadas de inervação no desenvolvimento de outros órgãos e tecidos orofaciais importantes, tais como os dentes. Apesar da rica inervação dos dentes adultos, e em contraste com todos os outros órgãos e tecidos do corpo, desendentes de ping começar a ser inervados nas primeiras fases pós-natais. Os dentes se desenvolvem como resultado de interações seqüenciais e recíprocas entre o ectoderma oral e cranial mesênquima derivado da crista neural. Estas interacções dar origem ao derivado ameloblastos-epiteliais e mesenquimais derivadas de odontoblastos que são responsáveis ​​pela formação do esmalte e dentina, respectivamente 12. Nervos sensoriais do gânglio trigeminal e nervos simpáticos do gânglio cervical superior inervam os dentes adulto 13-15. Durante a embriogênese, fibras nervosas que emana do projeto gânglios trigeminal para os germes dentários em desenvolvimento e, progressivamente, cercá-los, mas eles não penetram no mesênquima papila dentária 13. As fibras nervosas entrar no mesênquima polpa dental em estágios mais avançados de desenvolvimento que se correlacionam com diferenciação de odontoblastos e matriz dentinária deposição 16. Inervação polpa dentária é complETED logo após a erupção dos dentes na cavidade oral 13. Estudos anteriores revelaram que vários semaforinas e neurotrofinas estão envolvidos na regulação da inervação durante odontogenesis 16-19. Estudos anteriores demonstraram claramente que a inervação é um pré-requisito para a formação dos dentes em peixes 20. Estudos mais recentes têm mostrado que a homeostase das células-tronco mesenquimais dentária em incisivos de rato é regulada por nervos sensoriais através da secreção de sonic hedgehog (Shh) 21. No entanto, o papel da inervação em dente de iniciação, desenvolvimento e regeneração ainda é altamente controversa em mamíferos 22-24. Uma infinidade de estudos in vivo têm fornecido informações importantes sobre os padrões de inervação dos tecidos dentários durante os processos de vários modelos animais 13,25,26 desenvolvimento e reparação. No entanto, a maioria destes Approdores não são ideais para destacar a base molecular das interacções entre as fibras nervosas e os órgãos e tecidos alvo. Co-culturas constituem um método valioso para estudar e manipular as interacções entre as fibras nervosas e os dentes num ambiente controlado e isolado 26-29. Ao mesmo tempo, a co-cultura é sujeita a várias adaptações técnicas. Por exemplo, nervos e tecidos dentais específicos (por exemplo, polpa dentária, folículo dental, epitélio dental) muitas vezes requerem diferentes meios de cultura, a fim de garantir a sobrevivência do tecido por longos períodos de tempo de 30-32. Nas últimas décadas, co-culturas convencionais, utilizando o mesmo meio de cultura foram efectuadas por períodos muito curtos (por exemplo, dois dias) para investigar os efeitos atractivas ou repulsivas de desenvolvimento de tecidos orais e dentais em fibras nervosas sensoriais 27-29.No entanto, a extensão do período de cultura é necessária para investigar os efeitos da inervação na morfogénese e citodiferenciação dente, e para estudar a dinâmica de fibras nervosas de ramificação dentro de órgãos alvo. Portanto, não contíguas co-culturas seria mais apropriada para realizar estudos sobre as interacções de tecidos neuronais-dentário. Sistemas microfluidicos permitir co-culturas de neurónios e diferentes tipos de células no seu meio de cultura apropriado. Nestes dispositivos, os tecidos dentais e neurónios são separados em diferentes compartimentos, permitindo que o crescimento dos axónios dos corpos celulares neuronais através de microcanais para o compartimento que contém o seu tecido alvo 33. Microcanais têm já sido usadas para estudar as interacções entre neurónios e microglia 34,35, bem como de células para as interacções das células no cancro e neovascularização 35. Além disso, estes sistemas têm sido usados ​​para estudar as interacções entre dorsal gânglios da raiz e osteoblastos 36. Nós demonstramos recentemente que gânglios trigeminais (TG) e os dentes são capazes de sobreviver durante longos períodos de tempo quando co-cultivadas em microcanais 37. Além disso, demonstrámos que os dentes de diferentes estádios de desenvolvimento em manter estas condições in vitro, os mesmos efeitos repulsivos ou atractivos da inervação do trigémio que mostram in vivo 37. Este protocolo fornece informações sobre uma maneira simples, poderosa e flexível para co-cultura gânglios / nervos e tecidos-alvo e para estudar os papéis de moléculas específicas sobre tais interações em um ambiente controlado e isolado.

<table><tbody><tr><td>AXIS Axon Isolation Devices</td><td>Millipore</td><td>AX15010-TC</td><td>Microchannels of different lenght are available</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse beta-NGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1156-NG-100</td><td>Human and Rat beta-NGF (R&amp;amp;D Systems) are equivalent</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of developing tooth germ innervation using microfluidic co-culture devices

Inervação desempenha um papel chave no desenvolvimento, homeostase e regeneração de órgãos e tecidos. No entanto, os mecanismos subjacentes a esses fenômenos não são bem compreendidas ainda. Em particular, o papel de inervação no desenvolvimento e regeneração de dente é negligenciado. Vários estudos in vivo têm fornecido informações importantes sobre os padrões de inervação dos tecidos dentários durante os processos de vários modelos animais de desenvolvimento e reparação. No entanto, a maioria destas abordagens não são ideais para destacar a base molecular das interacções entre as fibras nervosas e os órgãos e tecidos alvo. Co-culturas constituem um método valioso para estudar e manipular as interacções entre as fibras nervosas e os dentes num ambiente controlado e isolado. Nas últimas décadas, co-culturas convencionais, utilizando o mesmo meio de cultura foram efectuadas por períodos muito curtos (por exemplo, dois dias)investigar os efeitos atractivas ou repulsivas de desenvolvimento de tecidos orais e dentais em fibras nervosas sensoriais. No entanto, a extensão do período de cultura é necessária para investigar os efeitos da inervação sobre a morfogénese do dente e citodiferenciação. Sistemas microfluidicos permitir co-culturas de neurónios e diferentes tipos de células no seu meio de cultura apropriado. Nós demonstramos recentemente que gânglios trigeminais (TG) e os dentes são capazes de sobreviver durante um longo período de tempo quando co-cultivadas em microcanais, e que eles se mantêm em estas condições o mesmo padrão de inervação que mostram in vivo. Nesta base, nós descrevemos como isolar e co-cultura em desenvolvimento e dos gânglios trigêmeo germes dentários em um protocolo de co-cultura microfluídicos system.This descreve uma forma simples e flexível para co-cultura gânglios / nervos e tecidos-alvo e para estudar os papéis moléculas de específicas sobre estas interacções em um controlled e ambiente isolado.

Estes resultados mostram que os gânglios do trigémeo isoladas podem crescer num compartimento do dispositivo de microfluidos e, além disso, que o desenvolvimento das bactérias isoladas de dentes é mantida por um longo período de tempo no outro compartimento do dispositivo de microfluidos. Diferentes meios de cultura são usados ​​nos dois compartimentos, e as micro-ranhuras entre os dois compartimentos de permitir a extensão do axónio do gânglio trigeminal no sentido de os germes de dentes em desenvolvimento. A Figura 3 representa uma visualização de neurofilamento através de imunofluorescência 37, numa co-cultura de um rato gânglio trigeminal do rato embrionário e incisivo embrionário no sistema de co-cultura de microfluidos descrito. Rato incisivos não são inervados durante o desenvolvimento in vivo;. Consistentemente, os axônios do gânglio trigeminal são revogadas pelo germe do dente em desenvolvimento em cultura por até 10 dias Figura 3A mostra uma visão geral da câmara axonal neste<html> sistema de co-cultura. Figura 3B e 3C mostram aumentos progressivos das neurites dentro das câmaras axonal e os micro-bosques. Germes do dente (ou quaisquer órgãos ou tecidos co-culturas) pode ser facilmente removida a partir dos dispositivos de microfluidos e analisadas separadamente por exemplo, processados ​​para colorações histológicas ou para a análise da expressão do gene. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53114/53114fig1.jpg" /> Figura 1. Vistas do dispositivo montado co-cultura de microfluidos (A) a partir de cima; . (B) parcialmente laterais As câmaras de cultura (cc) são destacadas em vermelho (eosina) e azul (azul de toluidina); microranhuras (mg) pode ser visto como uma linha em branco entre as câmaras de cultura. Gânglios e co-cultivadas órgãos / tecidos são colocadas dentro da câmara de cultura adequados, através dos furos (PH) no dispositivo. Meios são adicionados e removidos através dos poços (mw).<html> Target &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53114/53114fig2.jpg" /> Figura 2. (A) Vista lateral de uma cabeça de embrião de rato (dia embrionário de desenvolvimento E14.5). A linha preta indica onde o maxilar inferior deve ser cortado, a fim de preservar a integridade de ambos os gânglios e dente germes trigêmeo. Cabeça (B) mouse embrião (E14.5), após remoção da mandíbula, crânio e telencéfalo. Setas pretas indicam gânglio trigêmeo (TG). (C) A mandíbula do embrião de rato (E14.5) depois da remoção da língua. Setas pretas indicam a localização das diferentes germes dentários (INC: incisivos; FM: primeiros molares). (D) uma representação esquemática do dispositivo de co-cultura de microfluidos.p_upload / 53114 / &quot;target =&quot; _ blank 53114fig3large.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53114/53114fig3.jpg" /> Figura 3. Co-cultura de gânglio trigeminal e germe do dente incisivo a partir do tipo selvagem embriões E15.5 rato. (A) Visão da câmara axonal (neurofilament, DAPI). Barra de escala: 300? M. (B) Maior ampliação das estrias e neurites de crescimento para a câmara axonal (neurofilament, DAPI; superposição de lâmpadas fluorescentes e de campo claro imagens). Barra de escala: 150? M. (C) Ampliação superior mostrando o crescimento dos axónios no interior das micro-ranhuras (neurofilamento). Barra de escala:. 75 mm <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53114/53114fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices at JoVE.com

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Análise de Desenvolvimento de dente Germ Innervation Utilizar dispositivos microfluídicos Co-cultura

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

analysis-developing-tooth-germ-innervation-using-microfluidic-co

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K visualizações.  University of Zurich. Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Vídeo: Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Neurociência

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to overcome the resistance to current treatments and find a new way of cure, modeling the disease as close as possible in an in vitro setting to test new drugs and therapeutic procedures is highly demanding. Studying their fundamental pathobiological processes, including glutamatergic neuron hyperexcitability, will be a real advance in understanding interactions between the environmental brain and pHGG cells. Therefore, to recreate neurons/pHGG cell interactions, this work shows the development of a functional in vitro model co-culturing human-induced Pluripotent Stem (hiPS)-derived cortical glutamatergic neurons pHGG cells into compartmentalized microfluidic devices and a process to record their electrophysiological modifications. The first step was to differentiate and characterize human glutamatergic neurons. Secondly, the cells were cultured in microfluidic devices with pHGG derived cell lines. Brain microenvironment and neuronal activity were then included in this model to analyze the electrical impact of pHGG cells on these micro-environmental neurons. Electrophysiological recordings are coupled using multielectrode arrays (MEA) to these microfluidic devices to mimic physiological conditions and to record the electrical activity of the entire neural network. A significant increase in neuron excitability was underlined in the presence of tumor cells.

Recent works uncover the neuronal impact on high-grade pediatric glioma (pHGG) cells and their reciprocal interactions. The present work shows the development of an in vitro model co-culturing pHGG cells and glutamatergic neurons and recorded their electrophysiological interactions to mimic those interactivities.

Co-cultura de neurônios glutamatergicos e células glioma pediátricas de alto grau em dispositivos microfluidos para avaliar interações elétricas

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Pesquisa do câncer

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

Preparação de Neuronal co-culturas com precisão única célula

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Biologia do Desenvolvimento

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The continuously growing mouse incisor provides an excellent model to study tissue-specific stem cells. The epithelial tissue-specific stem cells of the incisor are located at the proximal end of the tooth in a niche called the cervical loop. They provide a continuous influx of cells to counterbalance the constant abrasion of the self-sharpening tip of the tooth. Presented here is a detailed protocol for the isolation and culture of the proximal end of the mouse incisor that houses stem cells and their niche. This is a modified Trowell-type organ culture protocol that enables in vitro culture of tissue pieces (explants), as well as the thick tissue slices at the liquid/air interface on a filter supported by a metal grid. The organ culture protocol described here enables tissue manipulations not feasible in vivo, and when combined with the use of a fluorescent reporter(s), it provides a platform for the identification and tracking of discrete cell populations in live tissues over time, including stem cells. Various regulatory molecules and pharmacological compounds can be tested in this system for their effect on stem cells and their niches. This ultimately provides a valuable tool to study stem cell regulation and maintenance.

The Trowell-type organ culture method has been used to unravel complex signaling networks that govern tooth development and, more recently, for studying regulation involved in stem cells of the continuously growing mouse incisor. Fluorescent-reporter animal models and live-imaging methods facilitate in-depth analyses of dental stem cells and their specific niche microenvironment.

Uso da cultura de órgãos do tipo Trowell para estudar a regulação de células-tronco dentárias

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

O método de cultura fatia para acompanhar o desenvolvimento de germes dentários Em Explant Cultura

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Biologia

A Gut-on-a-Chip Model to Study the Gut Microbiome-Nervous System Axis

The human body is colonized by at least the same number of microbial cells as it is composed of human cells, and most of these microorganisms are located in the gut. Though the interplay between the gut microbiome and the host has been extensively studied, how the gut microbiome interacts with the enteric nervous system remains largely unknown. To date, a physiologically representative in vitro model to study gut microbiome-nervous system interactions does not exist. 
To fill this gap, we further developed the human-microbial crosstalk (HuMiX) gut-on-chip model by introducing induced pluripotent stem cell-derived enteric neurons into the device. The resulting model, 'neuroHuMiX', allows for the co-culture of bacterial, epithelial, and neuronal cells across microfluidic channels, separated by semi-permeable membranes. Despite separation of the different cell types, the cells can communicate with each other through soluble factors, simultaneously providing an opportunity to study each cell type separately. This setup allows for first insights into how the gut microbiome affects the enteric neuronal cells. This is a critical first step in studying and understanding the human gut microbiome-nervous system axis.

neuroHuMiX is an advanced gut-on-a-chip model to study the interactions of bacterial, epithelial, and neuronal cells under proximal and representative co-culture conditions. This model allows unravelling of the molecular mechanisms underlying the communication between the gut microbiome and the nervous system.

Um modelo Gut-on-a-Chip para estudar o eixo microbioma intestinal-sistema nervoso

The human body is colonized by at least the same number of microbial cells as it is composed of human cells, and most of these microorganisms are located ...

Establishing a Co-Culture of Dental Pulp Cells and Trigeminal Neurons for Cross-Communication

Source: Barkley, C. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60809">A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020).
This video showcases a technique for establishing a co-culture of trigeminal neurons and primary dental pulp cells using a transwell filter. In this physically separated condition, mesenchymal cells obtained from dental pulp tissue secrete paracrine signaling molecules that traverse through the pores, promoting the differentiation and migration of neurons towards the mesenchymal cells establishing a co-culture system.

Estabelecendo uma co-cultura de células da polpa dentária e neurônios do trigêmeo para comunicação cruzada

1. Plate Preparation
NOTE: Be sure the plate lid is on during all incubation and rinsing steps outside of the sterile tissue culture hood to prevent ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Co-culture and Interaction Studies

Generating Neuromuscular Junctions Using a Microfluidic Device

Source: Stoklund Dittlau, K. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62959">Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates the formation of neuromuscular junctions using a microfluidic device. Neural precursor cells and muscle progenitor cells are seeded into different wells within the device and left to mature into motor neurons and myotubes, respectively. The creation of a volume and chemical gradient leads to the development of active neuromuscular junctions.

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
All reagents and equipment used in ...

Advanced Neuronal Models

Analyzing Tooth Germ and Trigeminal Ganglia Interactions Using a Microfluidic Co-culture System

Source: Pagella, P., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53114">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the utilization of a microfluidic device to study the interactions between tooth germ pulp and trigeminal ganglia. It showcases the placement of tissues inside the microfluidic device and provides a detailed visualization of trigeminal neurite growth toward the tooth germ through the device&#39;s microgrooves. Additionally, it highlights the role of tooth-derived molecular factors in promoting or inhibiting neurite extension into the tooth germ pulp, which is crucial for ensuring efficient postnatal tooth innervation.