Name: analysis of developing tooth germ innervation using microfluidic co-culture devices
Uploaded: 2015-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
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The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.

Alle Mäuse wurden nach Schweizer Tierschutzgesetz und in Übereinstimmung mit den Vorschriften des kantonalen Veterinäramt, Zürich gepflegt und behandelt werden. 1. Herstellung von Dissection Material, Kultur, Medien, Mikrofluidiksysteme <ol><li> Autoklaven Mikrodissektion Pinzette und Schere (121 ° C, Sterilisationszeit: 20 min) und speichert sie in einem sterilen Behälter. </li><li> Sterilisieren Deckgläser (24 mm x 24 mm) durch Inkubation in 1 M HCl 24 h lang auf einem Rundschüttler bei 37 ° C. Dreimal mit 99% Ethanol waschen sie mit sterilem, destilliertem H 2 O und dreimal. Dry dann die Deckgläser auf 37 ° C oder unter sterilen Flow-Haube. Schließlich Autoklaven oder setzen Sie die Deckgläser mit UV-Licht (30 min), um die Sterilisation zu vervollständigen. Deckgläser kann dann in Ethanol 70% gelagert werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die AXIS Axon Isolation Geräte aus der Verpackung mit Hilfe einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in eine sterile Petrischale. </li&gt; <li> Mit einem sterilen Biopsie Stempel (ø: 1 mm) schaffen ein Loch pro Probe kultiviert werden (Abbildung 1) in Übereinstimmung mit den Kulturkammern. HINWEIS: stanzen nicht zu nahe an den Mikrorillen, da sie möglicherweise durch den Druck aufgebracht beschädigt werden. </li><li> Sterilisieren Sie die AXIS Axon Isolation Devices durch immerging sie in Ethanol 70%. Dry dann AXIS Axon Isolation Geräte und Deckgläser vollständig unter einer sterilen Flow-Haube. Warten Sie mindestens 3 Stunden, bevor Sie fortfahren. HINWEIS: unvollständige Trocknung wird in fehlerhaften Montage der mikrofluidischen Bauteilen führen. </li><li> Legen Sie jedes Deckglas in eine 35 mm Petrischale oder in einen Brunnen in einem 6-wells Platte. </li><li> Setzen Sie den AXIS Axon Isolation Gerät auf dem Deckglas und drücken Sie vorsichtig, aber fest mit einer Zange mit gebogenen Enden, um die volle Haftung zwischen der Trennvorrichtung und dem Deckglas zu ermöglichen. </li><li> In jeder Kulturkammer, einer Pipette 150 ul Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml in sterilem destilliertem H 2O). Legen Sie die mikrofluidischen Vorrichtungen unter Vakuum für 5 Minuten, um die gesamte Luft aus den Kulturkammern zu entfernen. </li><li> Wenn Luft kann noch innerhalb der Kammern, re-Pipette die Poly-D-Lysin-Lösung in die Kammern zu sehen. </li><li> Die Vorrichtungen mit Poly-D-Lysin O / N bei 37 ° C. </li><li> Waschkammern dreimal mit sterilem destilliertem H 2 O. </li><li> Füllen Kammern mit 150 ul Laminin-Arbeitslösung (Sigma-Aldrich, 5 ug / ml in PBS oder Serum-freiem Medium), und Inkubation O / N bei 37 ° C. </li><li> Vorbereitung 50 ml Medium für Trigeminalganglien Kulturen 37, wie folgt zusammen: 48 ml Neurobasalmedium, 1 ml B-27, 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 5 ng / ml Nervenwachstumsfaktor (NGF) , 12.25 Cytosinarabinosid. </li><li> Bereiten Sie 50 ml Medium für Zahnkeim Kulturen 37, wie folgt zusammen: 40 ml DMEM-F12, 10 ml fötalem Rinderserum (FBS, Endkonzentration: 20%), 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 150 &amp; mgr; g / ml Ascorbinsäure. </li></ol> 2. Mouse Embryo Erzeugung und Dissection <ol><li> Bestimmen Sie embryonalen Alter nach Vaginalpfropf (Vaginalpfropf: embryonalen Tag der Entwicklung 0,5, E0.5) und bestätigen Sie es via morphologischen Kriterien. Für dieses Protokoll verwenden wir in der Regel E14.5-E17.5 Mäuseembryonen. </li><li> Reinigen Sie das Sezierung Bereich und die Stereoskop mit Ethanol 70%. </li><li> Opfer der schwangeren Mutter über Genickbruch. Blockieren Sie den Hals der Maus mit dem ersten und zweiten Finger auf ein Gitter, und ziehen Sie mit der Entscheidung der Schwanz. </li><li> Präparieren Sie die Haut um die Unterbauch, und öffnen Sie den Unterleib mit einer Schere. Suchen Sie die Gebärmutter: während dieser späten Stadien der Schwangerschaft, der Uterus reichlich die Bauchhöhle zu füllen. </li><li> Sezieren die Gebärmutter und in eine Röhre mit PBS auf Eis gefüllt. Wenn auf Eis kann das Gewebe für mehrere Stunden verlassen werden. Entsorgen Sie die Leiche der Mutter gemäß gültiger Richtlinien </li> &lt;li&gt; sezieren die Embryonen aus der Gebärmutter und sie von ihrer extra Gewebe. Legen Sie die Embryonen in PBS auf Eis. </li><li> Enthaupten die Embryonen mit einer Schere, und trennen Sie den Unterkiefer aus dem Rest des Kopfes mit Mikrodissektion Schere (2A). Genau Entfernen Sie die Unterkiefer, ohne Beschädigung der Trigeminalganglien; dieser letzteren in der Nähe des Unterkiefers lokalisiert ist ihre versehentliche Beschädigung möglich. Erhalten Sie den Unterkiefer und den Rest des Kopfes in kaltem PBS, auf Eis. </li><li> Um TG sezieren, nehmen Sie den Kopf und legen Sie sie auf eine Dissektion Glaspetrischale, die zuvor mit kaltem PBS gefüllt. Unter Verwendung der Zange, entfernen Sie die Haut und den Schädel. Entfernen Sie dann das Telencephalon und das Kleinhirn, indem Zange unterhalb des Telencephalon und Aufzug; das Telencephalon und das Kleinhirn zusammen drehen, so dass die Unterseite des Schädels freigelegt. </li><li> Lokalisierung der trigeminalen Ganglien (in 2B gezeigt). Verwenden Sie die Pinzetteum die TG von den Trigeminus trennen. Beseitigen Sie die Reste der Trigeminus-Projektionen mit Hilfe der Dissektion Nadeln wie Messer. Legen Sie die seziert TG in einer Petrischale mit kaltem PBS gefüllt und halten sie auf Eis. </li><li> Embryonale Zähne sezieren, legen Sie den Unterkiefer, die zuvor aus dem Schädel getrennt auf die Dissektion Glaspetrischale mit kaltem PBS gefüllt. Verwendung Dissektion Nadeln wie Messer, entfernen Sie die Zunge und die Haut rund um den Kiefer. Trennen Sie den linken und den rechten Hemi-Backen durch Schneiden entlang der Mittellinie des Kiefers. Die Zahnanlagen sind gut sichtbar, wie in 1C gezeigt. Isolieren Sie die Zahnkeime mit Dissektion Nadeln und entfernen Sie den Überschuss an nicht-Zahngewebe. Legen Sie die seziert Zahnkeime in einer Petrischale mit kaltem PBS gefüllt und halten sie auf Eis. </li></ol> 3. Mikrofluidik-Co-Kulturen <ol><li> Nach der Sektion, entfernen Laminin aus den mikrofluidischen Systemen. Füllen der Kammern mit 200 ul der respective Medien. </li><li> Mit einer Pinzette, übertragen vorsichtig seziert die TG und Zahnkeime in die Löcher erzeugt durch Stanzen (1D). Stellen Sie sicher, dass die Zahnkeime nicht schwimmen, und dass sie sinken, bis sie die Deckgläser. </li><li> Kultur die Proben in Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie das Kulturmedium alle 48 Stunden. Die Kammern leeren nicht vollständig, und nicht direkt Pipette nicht in die Kulturkammern. Vollständige Entleerung der Kammern würde zur Bildung von Luftblasen in den Kammern führen; direkte Pipettieren in die Kammer würde in axonalen Schäden führen. Um diese Probleme zu vermeiden, entfernen Sie das Medium zeigt die Pipette in Richtung der Außenseite der Vertiefungen; Ähnlich pipettieren frischem Medium auf der Seite der Vertiefungen angeordnet gegenüber den Kammern. </li><li> Während der Kulturzeit kann Co-Kulturen leicht durch Zeitraffer-Mikroskopie abgebildet werden. Co-Kulturen für 10 Tage lang aufrechterhalten werden. </li><li> Nach der Kultur period, waschen Sie die Kammern durch Pipettieren von 150 ul PBS in einem gut pro Kammer und ließ PBS durch die Kammern fließen dreimal. </li><li> Entfernen Sie die PBS und fixieren Sie die Proben durch Pipettieren von 150 ul Para 4% (in PBS) in einer gut per Kammer; Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Zweimaliges Waschen der Kammern mit PBS, wie in 3.6 beschrieben. </li><li> Fahren Sie mit der weiteren Analyse. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).</li><li>Connor, R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+maxillary+factor,+a+maxillary+process-derived+chemoattractant+for+developing+trigeminal+sensory+axons.">Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons.</a> Neuron. 24, 165-178 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Vorherige in vitro-Studien der Zahn Innervation wurden auf herkömmliche Kokulturen Trigeminalganglien und Zahngewebe oder Zellen 26,28,29 basiert. Diese Studien wurden durchgeführt, um in erster Linie untersuchen die attraktive Wirkung dieser Zellen oder Gewebe auf sensorische Axone 38. Zwar bringen bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet wurden mehrere technische Fragen aufgeworfen. Zahnkeime beginnen, nach ein paar Tagen der Kultur 37 degenerieren. Basierend auf diesen Beobachtungen wachsenden Neuronen und die Zähne in den gleichen Kulturbedingungen beeinträchtigt ein eventuelles Analyse von Molekülen in der Nebensprechen zwischen diesen beiden Geweben beteiligt. Optimale Kulturbedingungen nötig sind, die physiologische Molekularprofil Trigeminalganglien und Zahngewebe zu bewahren. Mikrofluidik-Systeme wurden bisher verwendet, um Nervenzellen und verschiedene Zelltypen in Medien optimiert 34,36-Kultur co. Das Mikrofluidik-System kann mehr Vertrauen darstellenvollständig die in vivo Situation, in neuronalen Zellkörpern, axonale Terminals und Zielgewebe im allgemeinen auf verschiedenen zellulären und molekularen Mikroumgebungen ausgesetzt. In jüngerer Mikrofluidik Vorrichtungen wurden verwendet, um Kokultur ganze Dorsalwurzelganglien und Osteoblasten 36. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Trigeminalganglien und Zähnen sind in der Lage, für lange Zeiträume in mikrofluidischen Vorrichtungen 37, wenn co-kultiviert überleben. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Zähne von verschiedenen Entwicklungsstadien in diesen aufrechtzuerhalten in vitro Bedingungen die gleichen abstoßend oder anziehend Wirkungen auf Trigeminus innerviert, dass sie in vivo 37 ausgestellt. Die beschriebenen Protokoll erfordert Übung und Fingerfertigkeit, insbesondere für die Mikrodissektion von Trigeminalganglien und Zahnkeime. Trigeminalganglien sind leicht beim Präparieren gerissen. Daher empfehlen wir die Verwendung von Dissektion Nadeln statt Dissektion Kraftps, um die rund um den Ganglien Gewebe zu entfernen. Ebenso sollte besondere Vorsicht beim Sezieren Zahnkeime, um eine Beschädigung der Zahn Epithel, während trennt sie von den umliegenden mesenchymalen Geweben genommen werden. Ferner wird während der ersten Tage der Co-Kultur, besondere Sorgfalt sollte bei der Handhabung der Inkubator genommen werden, da eine übermäßige Vibration kann Ganglion trigeminale Haftung auf dem Deckglas Kultur beeinträchtigen. Während des Cokulturzeit sollte Medien entfernt und durch Pipettieren in die Vertiefungen auf der Seite gegenüber den Kulturkammern werden. Aspiring oder Pipettieren Medien in Nähe der Kulturkammern würden im axonalen Schäden führen. Das beschriebene Protokoll kann modifiziert werden, um die Innervation mehreren embryonalen Organen und embryonalen oder postnatale Geweben und Zelltypen zu untersuchen. Microfluidics-Systeme könnten eine geeignete Plattform dar, um mehr Kulturzeiten für die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Neuronen und wächst tee ermöglichenth. Außerdem Trennung des neuronalen aus dem Dentalraum ermöglicht eine Analyse der Effekte von spezifischen Protein-Lokalisierung und Quantifizierung 33,37. Blockierenden Antikörpern oder rekombinanten Proteinen konnten auch für die getrennten Kammern der Mikrofluidik Vorrichtungen für die Analyse ihrer Wirkung auf neuronale und Zahngewebe hinzugefügt. Beispielsweise die Behandlung von Trigeminalganglien mit NGF unterstützt ihr Überleben und ermöglicht neuronale Auswachsen. Jedoch wird in dieser Arbeit exogenem NGF fehlt im Zahnkeim Faches, zahn abgeleiteten Signale sind für neuronale Anziehung oder Abstoßung der nur verantwortlich. In ähnlicher Weise können andere rekombinante Moleküle, Antikörper oder Arzneimittel verwendet, um das System unter kontrollierten Bedingungen zu manipulieren. Die wichtigsten Einschränkungen der vorgelegten Protokoll befinden sich in der relativ hohen Kosten der kommerziellen Mikrofluidvorrichtungen und der wesentlichen 2D-Einrichtung des Co-Kultursystem. In der Tat, wenn auch ganze Organe kann Kulturd, die beide Organe und Axone wachsen in 2D-adhärenten Kulturbedingungen auf einem Deckglas; Anpassung des Systems würde, um eine dreidimensionale, realistische Darstellung der Innervation erhalten benötigt. Abschließend sind mikrofluidischen Bauteilen optimal für die Untersuchung der Rolle der Innervation bei der Entwicklung oder Regeneration von Organen und erlauben die Untersuchung von Interaktionen zwischen neuronalen und Zielgeweben in optimalen Kulturbedingungen.

Innervation spielt eine Schlüsselrolle in der Entwicklung, Homöostase und Regeneration von Organen und Geweben, 1,2. 5 - Weiterhin ist Innervation bei der Regulation der Stammzellproliferation, Mobilisierung und Differenzierung 3 beteiligt. In der Tat, die jüngsten Studien in Geweben des orofazialen Komplexes realisiert haben gezeigt, dass parasympathischen Nerven sind für epithelialen Vorläuferzellen Funktion notwendig bei der Entwicklung und Regeneration der Speicheldrüsen 6,7. Ebenso hat sich gezeigt, dass Innervation für die Entwicklung und Wartung von Gaumen 8 notwendig - 11. Somit ist es wichtig, die noch vernachlässigt Rollen Innervation bei der Entwicklung anderer wichtiger orofacial Organen und Geweben wie Zähne analysieren. Trotz der Innervation reichen zweiten Zähne und im Gegensatz zu allen anderen Organen und Geweben des Körpers, developing Zähne beginnen, in den frühesten Stadien der postnatalen innerviert werden. Zähne entwickeln als Folge der sequentiellen und gegenseitige Wechselwirkungen zwischen oralen Ektoderm und Schädel Neuralleiste stammenden Mesenchym. Diese Wechselwirkungen führen zu Epithelzellen abgeleitete Adamantoblasten und Mesenchym abgeleitete Odontoblasten, die für die Bildung von Zahnschmelz und Dentin, die jeweils 12 verantwortlich sind. Sensorischen Nerven vom Trigeminalganglien und sympathischen Nerven aus der oberen Halsganglien innervieren die Erwachsenen die Zähne 13-15. Während der Embryogenese, Nervenfasern aus dem Trigeminalganglien Projekt gegenüber den Entwicklungszahnkeime ausgeht und progressiv umgeben sie aber nicht in die Papille Mesenchym 13 eindringen. Nervenfasern in das Zahnmark Mesenchym in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien, die mit odontoblast Differenzierung und Dentin Matrixablagerung 16 zu korrelieren. Pulpa Innervation ist komplETED bald nach dem Zahndurchbruch in der Mundhöhle 13. Frühere Studien haben gezeigt, dass verschiedene Semaphorine und Neurotrophine sind an der Regulation der Innervation bei Odontogenese 16 beteiligt - 19. Frühere Studien haben klar gezeigt, dass Innervation ist eine Voraussetzung für die Zahnbildung bei Fischen 20. Neuere Studien haben gezeigt, daß die Homöostase der Zahn Mesenchym-Stammzellen in Maus-Schneidezähne wird durch sensorische Nerven über Sekretion von Sonic Hedgehog (Shh) 21 reguliert wird. Dennoch ist die Rolle der Innervation in Zahn Initiierung, Entwicklung und Regeneration immer noch sehr umstritten in Säugetieren 22-24. Eine Vielzahl von in-vivo-Studien haben wichtige Informationen über die Muster der Innervation der Zahngewebe während der Entwicklung und Reparaturprozesse von verschiedenen Tiermodellen 13,25,26 vorgesehen. Jedoch sind die meisten von diesen auf angemesseneSchmerzen nicht optimal sind, um die molekularen Grundlagen der Wechselwirkungen zwischen Nervenfasern und Ziel Organe und Gewebe zu markieren. Co-Kulturen stellen eine wertvolle Methode zu untersuchen und zu manipulieren, die Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zähne in eine kontrollierte und isolierte Umgebung 26-29. Zugleich ist Kokultivierung unterliegen verschiedenen technischen Anpassungen. Zum Beispiel, Nerven und spezifische Zahngewebe (zB Pulpa, Zahnsäckchen, Zahn Epithel) erfordern oft unterschiedliche Kulturmedien, um Gewebeüberlebenszeit für längere Zeit garantieren 30 - 32. In den letzten Jahrzehnten haben sich herkömmliche Co-Kulturen mit dem gleichen Kulturmedium für sehr kurze Zeiträume (zB zwei Tage) durchgeführt wurde, um die anziehende oder abstoßende Wirkung der Entwicklungs Mund- und Zahngewebe an sensorischen Nervenfasern 27 zu untersuchen - 29.Jedoch Verlängerung der Kultivierungsperiode erforderlich, um die Auswirkungen der Innervation auf Zahn Morphogenese und Zelldifferenzierung zu untersuchen und die Dynamik von Nervenfasern innerhalb Verzweigungszielorgane zu untersuchen. Deshalb würde nicht zusammenhängende Co-Kulturen besser geeignet, um Studien über neuronale-Zahngewebe Interaktionen durchzuführen. Mikrofluidik-Systeme ermöglichen Co-Kulturen von Neuronen und verschiedene Zelltypen in ihren geeigneten Kulturmedien. In diesen Vorrichtungen werden Zahngeweben und Neuronen in verschiedenen Kammern getrennt, während gleichzeitig das Wachstum der Axone der neuronalen Zellkörper durch Mikrokanäle in Richtung der Kammer ihre Zielgewebe 33 enthält. Mikrofluidik-Vorrichtungen wurden bereits verwendet, um die Interaktionen zwischen Neuronen und Mikroglia 34,35 sowie von Zelle zu Zelle-Wechselwirkungen bei Krebs und Neovaskularisation 35 zu studieren. Darüber hinaus sind diese Systeme sind verwendet worden, um die Wechselwirkungen zwischen dors studierenal Wurzelganglien und Osteoblasten 36. Wir haben kürzlich gezeigt, dass trigeminalen Ganglien (TG) und der Zähne in der Lage sind, für längere Zeiträume zu überleben, wenn co-kultiviert in Mikrofluidik-Vorrichtungen 37. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Zähne von verschiedenen Entwicklungsstadien zu erhalten in diesen in vitro Bedingungen die gleichen abstoßend oder anziehend Auswirkungen auf Trigeminus innerviert, dass sie in vivo 37 zeigen. Dieses Protokoll enthält Informationen über eine einfache, leistungsfähige und flexible Möglichkeit, Co-Kultur-Ganglien / Nerven und Zielgewebe und die Rollen von spezifischen Molekülen auf solche Wechselwirkungen in einer kontrollierten und isolierten Umgebung zu studieren.

<table><tbody><tr><td>AXIS Axon Isolation Devices</td><td>Millipore</td><td>AX15010-TC</td><td>Microchannels of different lenght are available</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse beta-NGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1156-NG-100</td><td>Human and Rat beta-NGF (R&amp;amp;D Systems) are equivalent</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of developing tooth germ innervation using microfluidic co-culture devices

Innervation spielt eine Schlüsselrolle in der Entwicklung, Homöostase und Regeneration von Organen und Geweben. Allerdings sind die Mechanismen, die diese Phänomene sind nicht gut noch verstanden. Insbesondere wird die Rolle der Innervation in der Zahnentwicklung und Regeneration vernachlässigt. Mehrere In-vivo-Studien haben wichtige Informationen über die Muster der Innervation der Zahngewebe während der Entwicklung und Reparaturprozesse von verschiedenen Tiermodellen zur Verfügung gestellt. Allerdings sind die meisten dieser Ansätze nicht optimal, um die molekulare Grundlage der Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zielorgane und Gewebe zu markieren. Co-Kulturen stellen eine wertvolle Methode zu untersuchen und zu manipulieren, die Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zähne in einer kontrollierten und isolierten Umgebung. In den letzten Jahrzehnten haben sich herkömmliche Co-Kulturen unter Verwendung des gleichen Kulturmediums für sehr kurze Zeiträume durchgeführt wurden (beispielsweise zwei Tage)um die anziehende oder abstoßende Wirkung der Entwicklungs Mund- und Zahngewebe an sensorischen Nervenfasern zu untersuchen. Jedoch Verlängerung der Kultivierungsperiode erforderlich, um die Auswirkungen der Innervation auf Zahn Morphogenese und Zelldifferenzierung zu untersuchen. Mikrofluidik-Systeme ermöglichen Co-Kulturen von Neuronen und verschiedene Zelltypen in ihren geeigneten Kulturmedien. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Trigeminalganglien (TG) und die Zähne sind in der Lage, für eine lange Zeit überleben, wenn co-kultiviert in Mikrofluidvorrichtungen, und dass sie zu erhalten in diesen Bedingungen die gleiche Innervationsmuster, dass sie in vivo zeigen. Auf dieser Basis beschreiben wir, wie zu isolieren und Co-Kultur entwickeln Trigeminalganglien und Zahnkeime in einem mikrofluidischen Co-Kultur system.This Protokoll beschreibt eine einfache und flexible Möglichkeit, Co-Kultur-Ganglien / Nerven und Zielgewebe und die Rollen zu studieren spezifischer Moleküle auf solchen Wechselwirkungen in einem controlled und isolierten Umgebung.

Diese Ergebnisse zeigen, dass isolierte Trigeminalganglien kann in einem Abteil der mikrofluidischen Vorrichtung zu wachsen, und zusätzlich, dass die Entwicklung von den isolierten Zahnanlagen ist für einen langen Zeitraum in der anderen Kammer der mikrofluidischen Vorrichtung aufrechterhalten. Verschiedenen Kulturmedien sind in den zwei Kammern verwendet, und die Mikrorillen zwischen den beiden Kammern zu ermöglichen Verlängerung der Axone vom Ganglion trigeminale gegenüber den Entwicklungszahnanlagen dar. 3 stellt eine Visualisierung von Neurofilament mittels Immunofluoreszenz 37, in einer Co-Kultur der Maus embryonale Ganglion trigeminale und embryonalen Maus-Schneidezahn in der beschriebenen mikrofluidischen Co-Kultursystem. Maus Schneidezähne während der Entwicklung nicht in vivo viert;. Konsistent sind Axone Trigeminalganglions durch die Entwicklungszahnkeim in Kultur für bis zu 10 Tage aufgehoben 3A zeigt einen Überblick über den axonalen Kammer in diese<html> Co-Kultursystem. 3B und 3C zeigen progressive Vergrößerung der Neuriten in den axonalen Kammern und den Mikrohaine. Zahnkeime (oder jeder Kokulturen Organe oder Gewebe) können leicht aus den Mikrofluidvorrichtungen entfernt werden und separat zum Beispiel analysiert werden, für die histologische Färbungen oder zur Genexpressionsanalyse verarbeitet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53114/53114fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ansichten des mikrofluidischen montiert Co-Kultur-Gerät (A) von oben; . (B) teilweise seitliche Die Kulturkammern (cc) sind rot (Eosin) hervorgehoben und Blau (Toluidinblau); Mikronuten (mg) als weiße Linie zwischen den Kulturkammern sichtbar. Ganglien und cokultiviert Organe / Gewebe werden über die gestanzten Löcher (PH) in der Vorrichtung in die entsprechenden Kulturkammer gestellt. Medien werden über die Vertiefungen (mw) hinzugefügt und entfernt werden.<html> &quot;Https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53114/53114fig2.jpg" /> Abbildung 2. (A) Seitenansicht eines Maus-Embryo-Kopf (embryonalen Tag der Entwicklung E14.5). Die schwarze Linie zeigt an, wo der Unterkiefer sollte, um die Integrität der beiden Trigeminalganglien und Zahnkeime erhalten geschnitten werden. (B) Mausembryo Kopf (E14.5) nach Entfernen der Unterkiefer, Schädel und Telencephalon. Schwarze Pfeile zeigen trigeminal Ganglien (TG). (C) Unterkiefer des Mausembryo (E14.5) nach dem Entfernen der Zunge. Schwarze Pfeile zeigen die Lokalisierung der verschiedenen Zahnkeime (Inc: Schneidezahn; FM: ersten Molaren). (D) Schematische Darstellung der mikrofluidischen Co-Kultur-Gerät.p_upload / 53114 / 53114fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53114/53114fig3.jpg" /> Abbildung 3. Co-Kultur des Ganglion trigeminale und Schneidezahn Keim aus Wildtyp-E15.5 Maus-Embryonen. (A) Übersicht des axonalen Kammer (Neurofilament, DAPI). Maßstab: 300 &amp; mgr; m. (B) Eine stärkere Vergrößerung der Mikrorillen und Neuriten wachsen in den axonalen Kammer (Neurofilament, DAPI; Überlagerung der Fluoreszenz und Hellfeld-Bilder). Maßstab: 150 &amp; mgr; m. (C) die höhere Auflösung, welche das Wachstum von Axonen innerhalb der Mikrorillen (Neurofilament). Maßstab:. 75 um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53114/53114fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Die Analyse der Entwicklung von Zahnkeim Innervation Mit Microfluidic Co-Kultur-Geräte

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Aufrufe.  University of Zurich. Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

Serie: Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Forschung

Neurowissenschaften

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to overcome the resistance to current treatments and find a new way of cure, modeling the disease as close as possible in an in vitro setting to test new drugs and therapeutic procedures is highly demanding. Studying their fundamental pathobiological processes, including glutamatergic neuron hyperexcitability, will be a real advance in understanding interactions between the environmental brain and pHGG cells. Therefore, to recreate neurons/pHGG cell interactions, this work shows the development of a functional in vitro model co-culturing human-induced Pluripotent Stem (hiPS)-derived cortical glutamatergic neurons pHGG cells into compartmentalized microfluidic devices and a process to record their electrophysiological modifications. The first step was to differentiate and characterize human glutamatergic neurons. Secondly, the cells were cultured in microfluidic devices with pHGG derived cell lines. Brain microenvironment and neuronal activity were then included in this model to analyze the electrical impact of pHGG cells on these micro-environmental neurons. Electrophysiological recordings are coupled using multielectrode arrays (MEA) to these microfluidic devices to mimic physiological conditions and to record the electrical activity of the entire neural network. A significant increase in neuron excitability was underlined in the presence of tumor cells.

Recent works uncover the neuronal impact on high-grade pediatric glioma (pHGG) cells and their reciprocal interactions. The present work shows the development of an in vitro model co-culturing pHGG cells and glutamatergic neurons and recorded their electrophysiological interactions to mimic those interactivities.

Kokultur von glutamatergen Neuronen und pädiatrischen hochgradigen Gliomzellen in mikrofluidische Geräte zur Beurteilung elektrischer Wechselwirkungen

Pediatric high-grade gliomas (pHGG) represent childhood and adolescent brain cancers that carry a rapid dismal prognosis. Since there is a need to ...

Krebsforschung

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

Eine Co-Kultur-Methode zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchss als Reaktion auf Dental Pulp Paracrine Signale

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Entwicklungsbiologie

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The continuously growing mouse incisor provides an excellent model to study tissue-specific stem cells. The epithelial tissue-specific stem cells of the incisor are located at the proximal end of the tooth in a niche called the cervical loop. They provide a continuous influx of cells to counterbalance the constant abrasion of the self-sharpening tip of the tooth. Presented here is a detailed protocol for the isolation and culture of the proximal end of the mouse incisor that houses stem cells and their niche. This is a modified Trowell-type organ culture protocol that enables in vitro culture of tissue pieces (explants), as well as the thick tissue slices at the liquid/air interface on a filter supported by a metal grid. The organ culture protocol described here enables tissue manipulations not feasible in vivo, and when combined with the use of a fluorescent reporter(s), it provides a platform for the identification and tracking of discrete cell populations in live tissues over time, including stem cells. Various regulatory molecules and pharmacological compounds can be tested in this system for their effect on stem cells and their niches. This ultimately provides a valuable tool to study stem cell regulation and maintenance.

The Trowell-type organ culture method has been used to unravel complex signaling networks that govern tooth development and, more recently, for studying regulation involved in stem cells of the continuously growing mouse incisor. Fluorescent-reporter animal models and live-imaging methods facilitate in-depth analyses of dental stem cells and their specific niche microenvironment.

Verwendung von Organkulturen vom Trowell-Typ zur Untersuchung der Regulation von dentalen Stammzellen

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

Die Slice-Kultur-Verfahren zur Nach Entwicklung der Zahnkeime In Explantation Kultur

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Biologie

A Gut-on-a-Chip Model to Study the Gut Microbiome-Nervous System Axis

The human body is colonized by at least the same number of microbial cells as it is composed of human cells, and most of these microorganisms are located in the gut. Though the interplay between the gut microbiome and the host has been extensively studied, how the gut microbiome interacts with the enteric nervous system remains largely unknown. To date, a physiologically representative in vitro model to study gut microbiome-nervous system interactions does not exist. 
To fill this gap, we further developed the human-microbial crosstalk (HuMiX) gut-on-chip model by introducing induced pluripotent stem cell-derived enteric neurons into the device. The resulting model, 'neuroHuMiX', allows for the co-culture of bacterial, epithelial, and neuronal cells across microfluidic channels, separated by semi-permeable membranes. Despite separation of the different cell types, the cells can communicate with each other through soluble factors, simultaneously providing an opportunity to study each cell type separately. This setup allows for first insights into how the gut microbiome affects the enteric neuronal cells. This is a critical first step in studying and understanding the human gut microbiome-nervous system axis.

neuroHuMiX is an advanced gut-on-a-chip model to study the interactions of bacterial, epithelial, and neuronal cells under proximal and representative co-culture conditions. This model allows unravelling of the molecular mechanisms underlying the communication between the gut microbiome and the nervous system.

Ein Gut-on-a-Chip-Modell zur Untersuchung der Achse Darmmikrobiom und Nervensystem

The human body is colonized by at least the same number of microbial cells as it is composed of human cells, and most of these microorganisms are located ...

Establishing a Co-Culture of Dental Pulp Cells and Trigeminal Neurons for Cross-Communication

Source: Barkley, C. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60809">A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020).
This video showcases a technique for establishing a co-culture of trigeminal neurons and primary dental pulp cells using a transwell filter. In this physically separated condition, mesenchymal cells obtained from dental pulp tissue secrete paracrine signaling molecules that traverse through the pores, promoting the differentiation and migration of neurons towards the mesenchymal cells establishing a co-culture system.

Etablierung einer Co-Kultur von Zahnpulpazellen und Trigeminusneuronen für die Querkommunikation

1. Plate Preparation
NOTE: Be sure the plate lid is on during all incubation and rinsing steps outside of the sterile tissue culture hood to prevent ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Co-culture and Interaction Studies

Generating Neuromuscular Junctions Using a Microfluidic Device

Source: Stoklund Dittlau, K. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/62959">Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates the formation of neuromuscular junctions using a microfluidic device. Neural precursor cells and muscle progenitor cells are seeded into different wells within the device and left to mature into motor neurons and myotubes, respectively. The creation of a volume and chemical gradient leads to the development of active neuromuscular junctions.

Erzeugung neuromuskulärer Verbindungen mit einem mikrofluidischen Gerät

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
All reagents and equipment used in ...

Advanced Neuronal Models

Analyzing Tooth Germ and Trigeminal Ganglia Interactions Using a Microfluidic Co-culture System

Source: Pagella, P., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53114">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the utilization of a microfluidic device to study the interactions between tooth germ pulp and trigeminal ganglia. It showcases the placement of tissues inside the microfluidic device and provides a detailed visualization of trigeminal neurite growth toward the tooth germ through the device&#39;s microgrooves. Additionally, it highlights the role of tooth-derived molecular factors in promoting or inhibiting neurite extension into the tooth germ pulp, which is crucial for ensuring efficient postnatal tooth innervation.