Name: cryosectioning method for microdissection of murine colonic mucosa
Uploaded: 2015-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
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Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University&#160;Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer&#160;Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn's and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.

Experiências utilizados ratinhos C57BL / 6 entre 10 e 12 semanas de idade. Todos os procedimentos que utilizam animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de Emory University Animal Care Institucional e Use e foram realizadas de acordo com Institutos Nacionais de Saúde critérios. 1. Setup Experimental <ol><li> Configurar o Criostato <ol><li> Equilibrar criostato a -20 ° C, incluindo a lâmina micrótomo e mandris (ter muito cuidado em torno da lâmina!). </li><li> Encha uma cryomold vazio com outubro (Optimal composto de corte de temperatura) e equilibrar a -20 ° C (~ 30 min). Remova a outubro congelado do molde e corrigi-lo no mandril com líquido outubro Coloque o bloco / mandril no braço micrótomo e permitir que o OCT para definir durante 10 min. </li><li> Defina o criostato a 10 um por seção e raspar o bloco de outubro até que seja plana. Apoiar o braço microtome longe da lâmina por vários centímetros. Neste ponto não se ajustar a lâmina ou mandril para o restante da experiment. </li></ol></li><li> Preparar as lâminas de barbear: Prepare duas lâminas de barbear por amostra. Usando um arquivo de metal, maçante a borda sharped de lâminas. Em seguida, retire a flange de alumínio com uma pinça. </li><li> Pré-descontrair um pirex ou outra superfície plana em gelo seco. </li><li> Prepare um prato de dissecação com 15/10 pinos de dissecação. De 10 cm cultura de tecidos de 50% cheio com silicone será suficiente. Adicionar 5 ml de tampão de Hanks à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Dissecção da Distal Colonic Tissue <ol><li> Camundongos lugar em uma câmara selada e euthanize ratos por inalação de isoflurano e deslocamento cervical, em seguida, pulverizar etanol a 70% para o abdômen e tórax 12. </li><li> Faça uma pequena incisão na pele do abdómen com uma tesoura e, em seguida, fazer uma incisão para expor a cavidade peritoneal. Procedimentos semelhantes podem ser encontradas aqui descrita 12. </li><li> Cortar o intestino grosso à beira anal e provocar uma separação do mesentério até que o cólon é gratuito. </li><li> Extirpar um cólon distalsegmento entre 0 e 6 cm do ânus. Aqui, a profundidade das criptas é ~ 150 uM (ver Figura 1B). Corte aberto do cólon longitudinalmente com uma tesoura e remova o conteúdo fecal. </li><li> Pin o tecido para o prato de dissecação com a superfície da mucosa voltada para cima. Esticar o tecido utilizando pinos de dissecação sobre um prato de silício em tampão de Hanks e deixar em repouso durante 10 min à temperatura ambiente (Figura 1C). Isto remove dobras do tecido e permite que as camadas de músculos para relaxar. </li></ol> 3. Monte Tissue na Criostato para Seccionamento <ol><li> Deslize uma lâmina de barbear sob a seção desejada do tecido e, em seguida, despeje o tampão Hanks. Adicionar outra lâmina de barbear para o topo, tornando uma sanduíche. Corte o segmento de tecidos e remover os pinos. Transferir o sanduíche de lâminas de barbear / tecido para gelo seco. Permitir que o tecido para congelar (5-10 min, A Figura 1D). </li><li> Pegar a navalha / sanduíche de tecido e deixe-o aquecer ligeiramente, colocando um dedo no topo blade (lado da mucosa para cima. Este orienta o tecido de modo que as camadas basais musculares são seccionados em primeiro lugar.). Separa-se a sanduíche de corte e em volta das extremidades do segmento de tecido. Cortar um segmento de tecido de aproximadamente, 0,5 centímetros x 1 cm. Áreas de ponta têm uma tendência a enrolar, fazendo com que os cortes seriados para conter muitas camadas de tecido. Note-se que o excesso de corte é melhor do que under-corte, assim errar do lado da cautela. </li><li> Permitir que o tecido se aquecer até que o gelo no topo do tecido começa a derreter. Neste ponto, de forma rápida e cuidadosamente pressionar o tecido para dentro do bloco de outubro no criostato. </li><li> Remova a lâmina, colocando um dedo sobre a amostra. A transferência de calor vai permitir que você remover a lâmina, sem perturbar o tecido. </li><li> Brasão do tecido com outubro e equilibrar durante 5 min. Cortar em secções de 10 um (Figura 1E, F). Inspecione visualmente as seções até que as criptas são vistos. Seções lugar em um tubos de 1,5 ml ou em slides. </li><li> Para a análise de mRNA ou proteína, lugar tele amostras em tubos com 5 cripta-base, 5 de transição, e 5 secções de superfície por tubo. Para recolha de RNA adicionar 1 ml de reagente de isolamento comercial e incubar à TA durante 10 min. Realizar a purificação de ARN de acordo com as instruções do fabricante. Use 5-10 ug de ARN total para a produção de ADNc. </li><li> Para a purificação de proteínas, adicionar 0,5 ml de tampão de lise RIPA frio (mais inibidores de protease) por cinco secções. Sonicar três vezes a um ciclo de 70%, em gelo. <ol><li> Adicionar tampão de amostras de SDS PAGE de carregamento (tampão de Laemmli) e incuba-se a 100 ° C durante 10 min. Amostras sujeitas a SDS PAGE e transferência, em seguida, bloquear em 5% de leite / PBS durante 2 horas. Realizar a análise Western blot, seguido por incubação com anticorpos Klf4 (1: 500) O / N a 4 ° C. </li></ol></li></ol>

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	<li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+development+and+differentiation.">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).</li><li>Humphries, A., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonic+crypt+organization+and+tumorigenesis.">Colonic crypt organization and tumorigenesis.</a> Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).</li><li>Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+is+it+really+just+another+break+in+the+wall.">Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall.</a> Gut. 56, 6-8 (2007).</li><li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine.">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Rand, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+depletion+dissociates+and+activates+heterodimeric+notch+receptors.">Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors.</a> Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).</li><li>Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+by+Transmission+of+Mechanical+Stress+through+Epithelial+Tissues.">Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues.</a> Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).</li><li>Lechner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+pattern+of+laser+microdissected+colonic+crypts+of+adenomas+with+low+grade+dysplasia.">Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia.</a> Gut. 52, 1148-1153 (2003).</li><li>Reizel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colon+stem+cell+and+crypt+dynamics+exposed+by+cell+lineage+reconstruction.">Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction.</a> PLoS Genet. 7, e1002192 (2011).</li><li>Kosinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+patterns+of+human+colon+tops+and+basal+crypts+and+BMP+antagonists+as+intestinal+stem+cell+niche+factors.">Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).</li><li>Tamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pit+pattern+and+three-dimensional+configuration+of+isolated+crypts+from+the+patients+with+colorectal+neoplasm.">Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm.</a> J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+dendritic+cells+and+macrophages+from+the+mouse+intestine.">Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040 (2012).</li><li>Laukoetter, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-A+regulates+permeability+and+inflammation+in+the+intestine+in+vivo.">JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo.</a> J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).</li><li>Neumann, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+commensal+bacteria+and+regional+Wnt+gene+expression+in+the+proximal+versus+distal+colon.">Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon.</a> Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).</li><li>Capaldo, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+cytokine-induced+tight+junction+remodeling+through+dynamic+self-assembly+of+claudins.">Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins.</a> Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).</li><li>Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+an+intestine.">How to make an intestine.</a> Development. 141, 752-760 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Os mecanismos moleculares envolvidos na proliferação de células epiteliais do cólon e diferenciação são mal compreendidos. Isto inclui lacunas na nossa compreensão do ambiente de sinalização celular do compartimento de células estaminais na base das criptas epiteliais do cólon. Há também um crescente interesse nos processos que subjazem diferenciação enterócitos. Por exemplo, o aumento da compreensão dos in vivo diferenciação é necessária como um ponto de referência para estudos voltados para a produção in vitro de sistemas intestinais primárias 16. O procedimento acima contém várias etapas que requerem atenção extra. Em primeiro lugar, a remoção das bordas ao redor do segmento de tecidos congelados (como discutido na seção 3.2) é necessária como as bordas do tecido onda durante a dissecção e congelamento. A falha para mover estes bordos resultados é uma população mista de células de superfície e de base cripta. Montando o tecido em um bloco de pré-refrigerados, nivelado outubro também é essencial. To protocolo pode ser adaptado para outras áreas do cólon distai através da alteração do número de secções, em cada pool. Por exemplo, como mostrado na Figura 1B, comprimento das criptas mucosa varia entre 150-300 um. Portanto, quando se estuda a região entre 4 cm-a 6 cm do ânus, o número de secções deve ser aumentado de 15 para 30. Importante, este procedimento não é recomendado para o cólon proximal (7 cm @ 9 cm), devido a dobras ( plicas obliquae) que se estendem para dentro do lúmen fazendo com que seja impossível para as células cripta e de superfície de base separados por cortes seriados. Técnicas de seccionamento em série têm sido usados ​​para estudar cripta-base e superfície de populações de células epiteliais em humanos. No entanto, o nosso protocolo adiciona passos adicionais que são necessários devido ao tamanho pequeno de tecido murino. Propomos que o protocolo acima permitirá a investigação de cripta-base e população de células epiteliais da superfície em sistemas geneticamente tratáveis ​​do mouse. Na verdade, seções reunidas yield proteína de alta qualidade e análise do RNA a jusante adequados. As aplicações futuras podem incluir o estudo de vias de sinalização celular ou cromatina imunoprecipitação. No entanto, deve notar-se que, tal como muitos dos métodos alternativos descritos acima, as secções resultantes contêm uma mistura de células epiteliais e da lâmina própria intersticiais. Em conclusão, o protocolo aqui descrito proporciona um método rápido de rendimento, elevada para a análise de processos moleculares em regiões espacialmente distintas da mucosa do cólon de murino.

O revestimento epitelial do cólon é um tecido altamente regenerativa, com as células estaminais residentes reabastecer o tecido a cada poucos dias 1. Este processo de regeneração requer a manutenção de um compartimento de células estaminais proliferativa. Ao longo do tempo, as células filhas recentemente produzidos perdem o seu potencial proliferativo e migram para a superfície luminal do intestino. Coincidente com a migração, as células progenitoras diferenciam-se em enterócitos de formação de barreira maduras ou células caliciformes produtoras de muco. A falha deste programa de diferenciação é pensado para contribuir para barreira epitelial comprometida tal como é observada na doença inflamatória do intestino e o cancro do cólon 2,3. Estudo detalhado dos processos acima exigirá metodologias para isolar populações cripta-base e celulares de superfície. Existem vários métodos, cada um com suas vantagens e desvantagens. Os métodos actuais para o isolamento de células epiteliais intestinais incluem chagentes elating e dissociação mecânica, resultando no isolamento de criptas epiteliais, folhas inteiras, ou de células individuais, dependentes das condições experimentais 4,5. Estes são os métodos de alto rendimento, ainda mudanças na sinalização intercelular foram relatados nestas condições que podem não representar o ambiente nativo 6,7. Captura Laser microdissection permite a coleta de material distinto espacial, mas alcança 8,9 baixo rendimento molecular. No tecido do cólon humano, métodos cryosectioning horizontais em série foram desenvolvidos 10. No entanto, os tecidos da mucosa murino são proibitivamente pequeno para apropriação direta desta técnica. Nos seres humanos, os comprimentos das criptas intestinais (a distantes entre a base de cripta e células superficiais) no cólon varia entre 100-1.000 uM ~ 11. Em ratinhos, os comprimentos das criptas são entre 50-300 ~ ^ M (ver Figura 1A). O tamanho pequeno das criptas murino apresenta um desafio para o isolação destas duas populações celulares utilizando protocolos existentes. Vamos agora descrever um baixo custo, o método de alto rendimento para o isolamento de cripta-base e superfície população de células epiteliais no tecido do cólon de murino. Tecido colhida desta maneira pode, então, ser analisado por um certo número de aplicações a jusante padrão, incluindo coloração por imunofluorescência, por RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction) ou transferência de western.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems, Nussloch Germany</td><td>CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ real time PCR detector</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Confocal microscope</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>cryo-mold</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4557</td><td>25mmx20mmx5mm</td></tr><tr><td>High profile microtome blade</td><td>Leica Biosystems, Nussloch germany</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>GEM industrial blades</td><td>American Safety Razor Blades</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard silicon elastomere base</td><td>Dow Corning, Midland MI</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>27 1/2 g needle</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109</td><td>pins for dissection</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Antibody ZO-1</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>Antibody KLF4</td><td>Cell Signaling</td><td>4038S</td><td></td></tr><tr><td>Antibody mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Antibody Secondary Alexa conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 anti-rabbit</td></tr><tr><td>Antibody Secondary HRP conjugate</td><td>Jackson</td><td>111/115-001-003</td><td>rabbit/mouse&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs balanced salt buffer</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>RIPA lysis buffer</td><td></td><td></td><td>50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate</td></tr><tr><td>primer TBP 3&#039;</td><td></td><td></td><td>GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA</td></tr><tr><td>primer TBP 5&#039;</td><td></td><td></td><td>GATGACTGCAGCAAATCGCTT</td></tr><tr><td>primer KLF4 3&#039;</td><td></td><td></td><td>TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA</td></tr><tr><td>primer KLF4 5&#039;</td><td></td><td></td><td>ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT</td></tr></tbody></table>

cryosectioning method for microdissection of murine colonic mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Seções de tecido do cólon foram processados ​​para avaliação histológica e H &amp; E coloração 13. Uma vista em secção transversal tradicional da mucosa é visto na Figura 2A. Áreas basais conter o muscular externa, composta principalmente dos muscularis circulares. Prosseguindo para o lúmen, a mucosa muscularis é evidente adjacente para as células epiteliais de cripta-base, as células são transitórias no meio do tecido, e finalmente, as populações de células de superfície da face do lúmen do intestino. O método descrito aqui cortes seriados mantém uma orientação tal que os muscularis longitudinais e circulares são encontrados primeira (Figura 2B), seguido pela mucosa muscular (Figura 2C). Observe a aparência das células intersticiais não-musculares no canto superior esquerdo da imagem. Para a análise a jusante descrito abaixo, as secções de músculo são descartados. As seções posteriores contêm células epiteliais e tecido intersticial (lâmina própria), Começando com as células de cripta-base (Figura 2D). Note-se a ausência de um lúmen central, na maioria das criptas, que aparecem mais escuras devido aos núcleos estreitamente empacotadas. Estas camadas contêm o compartimento proliferativa. As células de transição aparecem como bem embalado glândulas com lumens centrais proeminentes (Figura 2E). Por último, as populações de células da superfície tem uma estrutura irregular, com áreas de monocamada epitelial viram en face (Figura 2F). Cortes seriados como descritos acima podem também ser tratados para a rotulagem de imunofluorescência e microscopia confocal (como descrito aqui 14). Figura 2G mostra criptas isoladas fixas e permeabilizadas em 100% de metanol e, posteriormente coradas para núcleos (azul) e da proteína de junção célula-célula zonula occludens 1 (ZO-1, verde). Na orientação de corte tradicional, células da cripta e da superfície pode ser visto simultaneamente (Figura 2G </strong&gt;). Note-se que as linhas de junção mancha ZO-1 do lúmen da cripta do cólon. Esse revestimento Z0-1 do lúmen também pode ser visto em amostras seccionadas em série de populações de células de transição, no centro das glândulas circulares (Figura 2G). Aprimorado ZO-1 mancha é visto em populações de células de superfície (Figura 2I e J). Vários factores de diferenciação são conhecidos a ser expresso de uma forma espaço-temporal ao longo do eixo cripta-a-superfície. Isto inclui o factor de transcrição-Kruppel como factor de 4 (KLF4), que é conhecido por ser enriquecido em populações de células de superfície. Usando métodos tradicionais de seccionamento, KLF4 é encontrada nos núcleos de lúmen populações de células de superfície (Figura 2K) enfrentando. Nós portanto especulado que KLF4 ARNm poderia ser predominantemente expresso em populações de células de superfície. Para testar isso, cortes seriados foram coletadas e agrupadas em amostras de superfície, de transição, de criptas e-base. Subsequently, o ARN foi colhido utilizando Trizol extracção padrão, com uma purificação adicional por coluna RNeasy e tratamento com DNAse. RNA foi coletado de cinco secções consecutivas em pool, que renderam entre 5-10 mg de RNA total por amostra. Estas amostras foram então submetidas a tempo de semi-quantitativo PCR real tanto para KLF4 e um gene de referência, a ligação da proteína caixa TATÁ 1 (TBP-1) (Figura 2L) 14. Como mostrado na Figura 2L, após normalização para a TBP-1, células de superfície foram encontrados para expressar até 8 vezes o ARNm KLF4 que é expresso em células da cripta. Do mesmo modo, os níveis de proteína KLF4 foram encontrados para expor regulação espacial ao longo do eixo cripta-superfície. As secções em série foram recolhidas como descrito acima e, em seguida, incubadas em tampão de lise durante 20 min a 4 ° C. Isto produziu entre 200-250 mg de proteína por amostra. As amostras foram então sujeitas a análise por SDS-PAGE (Figura 2M) 15. Como mostrado na Figura 2 M, p KLF4níveis rotein são dramaticamente mais elevada em populações de células de superfície. Os resultados acima demonstram a capacidade deste protocolo para isolar grandes quantidades de células epiteliais superficiais e das criptas da mucosa do cólon murino. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" /> Figura 1: (A) mostrando esquemática da mucosa do cólon de murino e as camadas musculares externos. Nosso método tem como objectivo recolher populações de células discretas de células superficiais e cripta-base por cryosectioning serial (10 m cada). As camadas musculares externos são descartados. Altura (B) Crypt varia ao longo do comprimento do cólon (a distância entre as camadas de base e de cripta-superficiais). Os pontos de dados individuais indicam as medições das criptas e símbolos indicam réplicas biológicas (n = 4). (C) segmentos de cólon recolhido, dividido, e preso em um silício dissecar prato. (D) Um tecido segment aproximadamente 3 cm do ânus é prensada entre a lâminas de barbear e os congelados em gelo seco. (E) O tecido é, em seguida, montado sobre um pré-nivelado bloco PTU. (F) Cortes congelados são removidos e inspeccionados visualmente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" /> Figura 2:. Os dados representativos (A) de tecido do cólon corado com Hematoxilina-Eosina, em corte transversal, que mostra a muscular circular (em cm), a mucosa muscularis (mm), as células de cripta-base, células de transição, e de células de superfície. (B - C) camadas musculares do cólon. (D) As células da cripta de base. Note-se a ausência de um lúmen central. (E) células transitórias. (F), as células de superfície. (G) Imunofluorescência coloração das criptas colônicas isoladas. ZO-1 (verde) e núcleos (azul) são observadas em corte transversal. (HI) ZO-1 e coloração nuclear em células de transição e de superfície. (J) visão ampliada de ZO-1 coloração. (K) KLF4 (verde) está enriquecido nas populações de células de superfície. (G) em tempo real os níveis de avaliação de PCR de ARNm KLF4 entre os três compartimentos. (M) análise de Western blot de KLF4 níveis de proteína nestas populações de células.

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Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

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Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Imunologia e Infecção

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of experimental models needs to be as rigorous as that applied for human samples. Indeed, drawing reliable and accurate conclusions is critically influenced by the quality of tissue section preparation. Here, we describe a protocol for histopathological analysis of murine tissues that implements several automated steps during the procedure, from the initial preparation to the paraffin embedding of the murine samples. The reduction of methodological variables through rigorous protocol standardization from automated procedures contributes to increased overall reliability of murine pathological analysis. Specifically, this protocol describes the utilization of automated processing and embedding robotic systems, routinely used for the tissue processing and paraffin embedding of human samples, to process murine specimens of intestinal inflammation. We conclude that the reliability of histopathological examination of murine tissues is significantly increased upon introduction of standardized and automated techniques.

Lack of standardization for murine tissue processing reduces the quality of murine histopathological analysis as compared to human specimens. Here, we present a protocol to perform histopathological examination of murine inflamed and uninflamed colonic tissues to show the feasibility of robotic systems routinely used for processing and embedding&#160;human samples.

Usando sistemas robóticos para processar e incorporar Colônica murino amostras para análise histológica

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Neurociência

Performing Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice and Evaluating Subsequent Tissue Changes

Understanding the tissue and cellular changes that occur in the acute injury response as well as during the wound healing process is of paramount importance when studying diseases of the gastrointestinal (GI) tract. The murine colonic pinch biopsy model is a useful tool to define these processes. Additionally, the interplay between gut luminal content (e.g., microbes) and the colon can be studied. However, wound induction and the ability to track wound closure over time in a reliable manner can be challenging. Moreover, tissue preparation and orientation must be carried out in a standardized way to optimally interrogate histologic and molecular changes. Here, we present a detailed method describing biopsy-induced injury and the monitoring of wound closure through repeat colonoscopies. An approach is described that ensures consistent and reproducible measurements of wound size, the ability to collect the wound bed for molecular analyses as well as visualize the wound bed upon sectioning of tissues. The ability to successfully carry out these techniques allows for studies of the acute injury response, wound healing and luminal-host interactions within the colon.

Here, we provide a detailed description of the procedure to induce colonoscopic-guided pinch biopsies in mice and track wound closure in real time. Additionally, methods for the preparation of tissues for histological, immunohistochemical and molecular analyses of the wound bed are provided.

Realizando biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e avaliando alterações subsequentes de tecido

Understanding the tissue and cellular changes that occur in the acute injury response as well as during the wound healing process is of paramount ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Biologia

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

Eletrofisiologia celular de células enterocromafins murino culta primário

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Snap Freezing of Muscle Tissue for Sectioning: A Protocol to Obtain Ultrathin Sections of Rapidly Frozen Murine Muscle Tissue

Source: Bonetto, A. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54893" target="_blank">The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video describes the procedure for snap freezing muscle tissue and obtaining its thin sections. The technique can help study cancer-related cachexia in colon cancer mouse models.

Congelamento instantâneo de tecido muscular para seccionamento: um protocolo para obter cortes ultrafinos de tecido muscular murino rapidamente congelado

Source: Bonetto, A. et al. The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia. J. Vis. Exp. (2016)
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Pesquisa do câncer

Câncer gastrointestinal

Estudos com modelo animal

Intestinal Crypts Isolation: A Method to Isolate Whole Crypts from Small Intestine of Murine Model

Source: Schewe, M. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/56329" target="_blank">The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate a technique to isolate whole crypts from a mouse&#8217;s small intestine. The isolated whole crypts can be used to propagate long-lived and self-renewing 3D organoids in vitro.

Isolamento de criptas intestinais: um método para isolar criptas inteiras do intestino delgado do modelo murino

Source: Schewe, M. et al. The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells. J. Vis. Exp. (2017)
In ...

Frozen Mouse Brain Tissue Sectioning: A Procedure to Obtain Thin Frozen Tissue Sections from Frozen Murine Brain Tissue

Source: Comba, A. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60939/laser-capture-microdissection-glioma-subregions-for-spatial-molecular">Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion.</a> J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the sectioning of a frozen mouse brain tumor tissue using a cryostat. The frozen brain tissue sections so obtained are stored at low temperatures until further analysis.

Seccionamento de tecido cerebral de camundongo congelado: um procedimento para obter seções finas de tecido congelado de tecido cerebral murino congelado

Source: Comba, A. et al. Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, ...