Name: cryosectioning method for microdissection of murine colonic mucosa
Uploaded: 2015-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
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Supported by National Institutes of Health (DK55679, and DK59888 to A.N.). Emory University&#160;Integrated Cellular Imaging Microscopy Core of the Winship Cancer&#160;Institute comprehensive cancer center grant, P30CA138292, and the Crohn's and Colitis Foundation of America Career Development award to C.T.C. and Fellowship Award to A.E.F.

Esperimenti utilizzati topi C57BL / 6 tra 10 e 12 settimane di età. Tutte le procedure che utilizzano gli animali sono stati esaminati e approvati dall&#39;Università Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali Emory e sono state eseguite secondo National Institutes of Criteri sanitari. 1. Setup sperimentale <ol><li> Impostazione del criostato <ol><li> Equilibrare criostato a -20 ° C, tra cui la lama microtomo e mandrini (estrema cautela intorno alla lama!). </li><li> Riempire un vuoto con cryomold ottobre (Ottimale composta Taglio temperatura) ed equilibrare a -20 ° C (~ 30 min). Rimuovere l&#39;ottobre congelato dallo stampo e fissarlo sul mandrino con liquido ottobre Posizionare il blocco / mandrino nel braccio microtomo e consentire di Office per impostare per 10 minuti. </li><li> Impostare il criostato a 10 micron per sezione e radersi il blocco ottobre fino a quando non è piatta. Eseguire il braccio microtomo lontano dalla lama di alcuni centimetri. A questo punto non regolare la lama o mandrino per il resto della experiment. </li></ol></li><li> Preparare le lamette da barba: Preparare 2 lamette per campione. Utilizzo di un file di metallo, opaco bordo sharped di lame. Quindi, rimuovere la flangia in alluminio con una pinza. </li><li> Pre-raffreddare una pirofila o altra superficie piatta in ghiaccio secco. </li><li> Preparare un piatto dissezione con 10-15 perni dissezione. A 10 centimetri piatto di coltura tissutale 50% pieno di silicio sarà sufficiente. Aggiungere 5 ml di tampone Hanks a temperatura ambiente. </li></ol> 2. dissezione distale colon Tissue <ol><li> Topi posto in una camera sigillata e Euthanize topi per inalazione isoflurano e dislocazione cervicale, quindi spruzzare il 70% di etanolo sul ventre e del torace 12. </li><li> Fai una piccola incisione nella pelle dell&#39;addome con le forbici e poi fare un&#39;incisione per esporre la cavità peritoneale. Procedure simili si possono trovare qui 12 descritto. </li><li> Tagliare l&#39;intestino crasso al margine anale e prendere in giro a parte il mesentere fino a quando il colon è gratuito. </li><li> Accise un colon distalesegmento tra 0 e 6 cm dalla ano. Qui, la profondità cripta ~ 150 micron (vedere Figura 1B). Taglio aperto il colon longitudinalmente con le forbici e rimuovere il contenuto fecale. </li><li> Pin il tessuto al piatto dissezione con la superficie della mucosa rivolta verso l&#39;alto. Allungare il tessuto con perni dissezione su un piatto di silicio in tampone Hanks e lasciare riposare per 10 minuti a temperatura ambiente (Figura 1C). Questo elimina pieghe dal tessuto e permette strati muscolari di rilassarsi. </li></ol> 3. Montare tessuto sulla Criostato per il sezionamento <ol><li> Infilare una lametta sotto la sezione desiderata del tessuto e quindi versare il tampone Hanks. Aggiungere un&#39;altra lametta all&#39;inizio, facendo un sandwich. Tagliare il segmento tessuti e rimuovere i perni. Trasferire il panino lametta / tessuto a ghiaccio secco. Lasciare che il tessuto di congelare (5-10 min, Figura 1D). </li><li> Sollevare il rasoio / panino tessuto e lasciarlo riscaldare leggermente mettendo un dito sul bl superioreade (lato mucosale up. Questo orienta il tessuto in modo che gli strati muscolari basali sono sezionate prima.). Separare il sandwich e tagliare lungo i bordi del segmento tissue. Tagliare un segmento di tessuto di circa 0,5 x 1 cm. Aree di bordo hanno la tendenza ad arricciarsi, causando sezioni seriali contengono molti strati di tessuto. Si noti che l&#39;eccesso di taglio è migliore di sotto-taglio, in modo sbagliare sul lato della cautela. </li><li> Lasciare il tessuto riscaldare fino ghiaccio sulla parte superiore del tessuto inizia a fondere. A questo punto rapidamente e con attenzione premere il tessuto nel blocco OCT criostato. </li><li> Rimuovere la lama inserendo un dito sul campione. Il trasferimento di calore permette di rimuovere la lama senza interrompere il tessuto. </li><li> Cappotto il tessuto con ottobre e equilibrare per 5 minuti. Tagliare le sezioni a 10 micron (Figura 1E, F). Visivamente sezioni fino a quando le cripte sono visti. Luogo sezioni in un provette da 1,5 ml o su diapositive. </li><li> Per l&#39;analisi di mRNA e di proteine, luogo tegli campioni in tubi con 5 cripta-base, 5 di transizione, e 5 sezioni di superficie per provetta. Per la raccolta RNA aggiungere 1 ml di reagente commerciale isolamento e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Eseguire la purificazione di RNA secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare 5-10 mg di RNA totale per la generazione di cDNA. </li><li> Per purificazione della proteina, aggiungere 0,5 ml di freddo RIPA Lysis Buffer (più inibitori della proteasi) per 5 sezioni. Sonicare 3 volte in un ciclo di 70%, su ghiaccio. <ol><li> Aggiungere esempi di SDS tampone di caricamento delle pagine (buffer Laemmli) e incubare a 100 ° C per 10 min. Campioni soggetti a SDS PAGE e trasferimento, poi bloccano in 5% di latte / PBS per 2 ore. Eseguire l&#39;analisi Western Blot seguita da incubazione con anticorpi Klf4 (1: 500) O / N a 4 ° C. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose

I meccanismi molecolari coinvolti nella proliferazione delle cellule epiteliali del colon e la differenziazione sono poco conosciute. Questo include lacune nella nostra comprensione dell&#39;ambiente segnalazione cellulare del compartimento di cellule staminali alla base delle cripte epiteliali del colon. Vi è anche un crescente interesse per i processi che stanno alla base di differenziazione enterociti. Ad esempio, ha aumentato la comprensione di differenziazione in vivo è necessaria come punto di riferimento per gli studi volti a produrre in vitro sistemi intestinali primarie 16. La procedura di cui sopra contiene diversi passaggi che richiedono una particolare attenzione. In primo luogo, eliminando i bordi intorno al segmento tessuto congelato (come discusso nella sezione 3.2) è richiesto come i bordi di tessuto riccio durante la dissezione e il congelamento. La mancata spostare questi spigoli risultati è una popolazione mista di cellule superficiali e base cripta. Montaggio il tessuto su una, ottobre blocco livellati pre-raffreddata è anche essenziale. Tsuo protocollo può essere adattato ad altre zone del colon distale modificando il numero di sezioni in ciascun pool. Ad esempio, come mostrato nella Figura 1B, lunghezza cripta mucosa varia tra 150-300 micron. Pertanto, quando si studia la regione tra 4 CM-6 centimetri dall&#39;ano, il numero di sezioni dovrebbe essere aumentato da 15 a 30. È importante sottolineare che questo protocollo non è suggerito per il colon prossimale (7 gli cm-9 cm) a causa di pieghe ( pliche obliquae) che si estendono nel lume rendendo impossibile superficie e la cripta-base celle separate di sezionamento seriale. Tecniche di sezionamento seriali sono state usate per studiare cripta-base e la superficie popolazioni di cellule epiteliali nell&#39;uomo. Tuttavia, il nostro protocollo aggiunge passaggi aggiuntivi richiesti a causa delle piccole dimensioni del tessuto murino. Proponiamo che il protocollo di cui sopra consentirà la ricerca di cripta-base e la popolazione di cellule epiteliali di superficie nei sistemi geneticamente trattabili mouse. In effetti, le sezioni pool Yield proteine ​​di alta qualità e RNA analisi valle adatto. Le applicazioni future potrebbero includere lo studio delle vie di segnalazione cellulare o immunoprecipitazione della cromatina. Tuttavia, va notato che, come molti dei metodi alternativi descritti sopra, le sezioni ottenute contengono una miscela di cellule lamina propria epiteliali e interstiziali. In conclusione, il protocollo qui descritto fornisce un rapido metodo del rendimento, alta per l&#39;analisi dei processi molecolari in regioni spazialmente distinte della mucosa del colon murino.

Il rivestimento epiteliale del colon è un tessuto altamente rigenerativa, con le cellule staminali residenti rifornire il tessuto ogni pochi giorni 1. Questo processo di rigenerazione richiede il mantenimento di un compartimento staminale proliferativa. Nel corso del tempo, le cellule figlie nuova produzione perdono il loro potenziale proliferativo e migrano verso la superficie luminale dell&#39;intestino. In coincidenza con la migrazione, le cellule progenitrici differenziarsi in enterociti-barriera che formano mature o cellule caliciformi che producono muco. Fallimento di questo programma differenziazione è pensato per contribuire alla compromissione barriera epiteliale, come si osserva nella malattia infiammatoria intestinale e del colon 2,3. Studio dettagliato dei processi di cui sopra richiede metodologie per isolare le popolazioni cripta-base e delle cellule di superficie. Esistono metodi multipli, ciascuno con vantaggi e svantaggi. Gli attuali metodi per l&#39;isolamento delle cellule epiteliali intestinali includono chagenti elating e dissociazione meccanica, con conseguente isolamento di intere cripte, fogli epiteliali, o cellule singole, dipendenti condizioni sperimentali 4,5. Questi sono metodi ad alto rendimento, ma i cambiamenti nella segnalazione intercellulare sono stati riportati in queste condizioni, che non possono rappresentare l&#39;ambiente nativo 6,7. Microdissezione laser consente la raccolta di materiale spaziale distinte, ma realizza bassa resa 8,9 molecolare. Nel tessuto del colon umano, metodi criosezionamento orizzontali di serie sono stati sviluppati 10. Tuttavia, mucose murini sono proibitivamente piccole per appropriazione diretta di questa tecnica. Negli esseri umani, le lunghezze cripta intestinale (la distanza tra la cripta-base e cellule di superficie), nel colon varia tra ~ 100-1.000 micron 11. Nei topi, le lunghezze cripta sono tra ~ 50-300 micron (vedi Figura 1A). Le piccole dimensioni delle cripte murine rappresenta una sfida per l&#39;isolazione di queste due popolazioni cellulari che utilizzano protocolli esistenti. Descriviamo ora un basso costo, il metodo ad alto rendimento per l&#39;isolamento di cripta-base e la superficie popolazione di cellule epiteliali nel tessuto del colon murino. Tissue raccolti in questo modo può poi essere analizzato da un certo numero di applicazioni a valle standard, tra immunofluorescenza, RT-PCR (Real Time-Polymerase Chain Reaction) o western blotting.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems, Nussloch Germany</td><td>CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ real time PCR detector</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Confocal microscope</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>cryo-mold</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4557</td><td>25mmx20mmx5mm</td></tr><tr><td>High profile microtome blade</td><td>Leica Biosystems, Nussloch germany</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>GEM industrial blades</td><td>American Safety Razor Blades</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard silicon elastomere base</td><td>Dow Corning, Midland MI</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>27 1/2 g needle</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109</td><td>pins for dissection</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Antibody ZO-1</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>Antibody KLF4</td><td>Cell Signaling</td><td>4038S</td><td></td></tr><tr><td>Antibody mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Antibody Secondary Alexa conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 anti-rabbit</td></tr><tr><td>Antibody Secondary HRP conjugate</td><td>Jackson</td><td>111/115-001-003</td><td>rabbit/mouse&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs balanced salt buffer</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>RIPA lysis buffer</td><td></td><td></td><td>50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate</td></tr><tr><td>primer TBP 3&#039;</td><td></td><td></td><td>GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA</td></tr><tr><td>primer TBP 5&#039;</td><td></td><td></td><td>GATGACTGCAGCAAATCGCTT</td></tr><tr><td>primer KLF4 3&#039;</td><td></td><td></td><td>TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA</td></tr><tr><td>primer KLF4 5&#039;</td><td></td><td></td><td>ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT</td></tr></tbody></table>

cryosectioning method for microdissection of murine colonic mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Sezioni di tessuto del colon sono stati elaborati per la valutazione istologica e H &amp; E colorazione 13. Una visione tradizionale sezione trasversale della mucosa è visto in Figura 2A. Aree basali contengono il externa muscolare, composta principalmente delle muscolare circolari. Procedendo verso il lume, la mucosa muscolare è evidente adiacente alle cellule epiteliali cripta-base, cellule transizionali sono al centro del tessuto, e, infine, popolazioni cellulari superficie faccia lume intestinale. Il metodo descritto qui sezionamento seriale mantiene un orientamento tale che le muscolare longitudinali e circolari sono incontrate, prima (Figura 2B), seguita dalla mucosa muscolare (Figura 2C). Si noti la comparsa di cellule interstiziali non muscolari in alto a sinistra dell&#39;immagine. Per l&#39;analisi valle descritto di seguito, le sezioni muscolari vengono scartati. Le sezioni successive contengono cellule epiteliali e tessuto interstiziale (lamina propria), A partire dalle cellule cripta-base (Figura 2D). Si noti l&#39;assenza di un lume centrale nella maggior parte delle cripte, che appaiono più scuro a causa dei nuclei fitte. Questi strati contengono il vano proliferativa. Le cellule di transizione appaiono come accuratamente imballati ghiandole con lumen centrali importanti (Figura 2E). Infine, le popolazioni di cellule superficie hanno una struttura irregolare, con aree del monostrato epiteliale visto en face (Figura 2F). Sezioni seriali descritti sopra possono anche essere trattati per l&#39;etichettatura immunofluorescenza e microscopia confocale (come descritto qui 14). La figura 2G mostra cripte isolate fissi e permeabilizzate in 100% di metanolo e successivamente colorate per nuclei (blu) e la proteina giunzione cellula-cellula zonula occludere 1 (ZO-1, verde). Nel orientamento sezionamento tradizionale, cellule cripta e la superficie può essere visto contemporaneamente (Figura 2G </strong&gt;). Si noti che le linee ZO-1 macchia giunzionale lume della cripta del colon. Questo rivestimento Z0-1 del lume può essere visto anche in campioni seriali sezionate di popolazioni cellulari transitorie, nel centro delle ghiandole circolari (figura 2G). Avanzato ZO-1 macchia è visto in popolazioni cellulari di superficie (figura 2I e J). Diversi fattori di differenziazione sono noti per essere espressi in modo spaziotemporale lungo l&#39;asse cripta-superficie. Questo include il fattore di fattore di trascrizione Kruppel-like 4 (Klf4), che è noto per essere arricchito in popolazioni cellulari di superficie. Con i metodi tradizionali di sezionamento, Klf4 si trova nei nuclei di lume di fronte popolazioni cellulari di superficie (Figura 2K). Abbiamo quindi ipotizzato che Klf4 mRNA sarebbe espressa prevalentemente in popolazioni di cellule superficiali. Per verificare ciò, sezioni seriali sono stati raccolti e raggruppati in campioni di superficie, di transizione, e cripta-base. Subsequente, RNA è stato raccolto con l&#39;estrazione di serie Trizol, con una purificazione supplementare RNeasy colonna e trattamento DNAsi. L&#39;RNA è stato raccolto da 5 sezioni consecutive messe in comune, che diedero tra 5-10 mg di RNA totale per campione. Questi campioni sono stati poi sottoposti a semi-quantitativa real time PCR sia Klf4 e un gene di riferimento, TATA binding protein 1 scatola (TBP-1) (Figura 2L) 14. Come mostrato in Figura 2L, dopo la normalizzazione di TBP-1, cellule superficiali sono stati trovati per esprimere fino a 8 volte il Klf4 mRNA che è espresso nelle cellule cripta. Allo stesso modo, sono stati trovati livelli di proteina Klf4 esporre regolazione spaziale lungo l&#39;asse cripta superficie. Sezioni seriali sono stati riuniti come descritto sopra e poi incubate in tampone di lisi per 20 min a 4 ° C. Questo ha prodotto tra 200-250 mg di proteine ​​per campione. I campioni sono stati poi sottoposti analisi mediante SDS-PAGE (Figura 2M) 15. Come mostrato nella Figura 2M, Klf4 plivelli rotein sono drammaticamente più alta in popolazioni di cellule di superficie. I risultati di cui sopra dimostrano la capacità di questo protocollo per isolare grandi quantità di superficie e le cellule epiteliali cripta della mucosa del colon murino. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" /> Figura 1: (A) mostra schematica murine mucosa del colon e strati muscolari esterni. Il nostro metodo si propone di raccogliere cellulari di superficie e la cripta-base popolazioni cellulari discreti criosezionamento seriale (10 micron ciascuna). Gli strati muscolari esterni vengono scartati. Altezza (B) cripta varia lungo la lunghezza del colon (distanza interstrato cripta-base e la superficie). I punti dati indicano singole misurazioni cripta e simboli indicano repliche biologiche (n = 4). (C) segmenti Colon raccolti, Diviso in due parti, e appuntato su un piatto di silicio dissezione. (D) Un tessuto segment circa 3 cm dal ano si preme tra di lamette da barba e congelati in ghiaccio secco. (E) tessuto viene poi montato su un blocco Ottobre pre-livellato. (F) criosezioni vengono rimosse ed esame visivo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" /> Figura 2:. Dati rappresentativi (A) tessuto del colon colorate con ematossilina-eosina in sezione trasversale che mostra la muscolaris circolari (cm), la mucosa muscolare (mm), cellule cripta-base, cellule di transizione, e cellule superficiali. (B - C) strati muscolari del colon. (D) le cellule Cripta-base. Si noti l&#39;assenza di un lume centrale. (E) le cellule di transizione. (F), le cellule di superficie. (G) Immunofluorescenza di isolati cripte del colon. ZO-1 (verde) e nuclei (blu) si osservano in sezione trasversale. (CIAO) ZO-1 e colorazione nucleare in cellule di transizione e di superficie. (J) vista ingrandita ZO-1 colorazione. (K) Klf4 (verde) si arricchisce in popolazioni di cellule di superficie. (L) Real-time PCR valutazione dei livelli di mRNA Klf4 tra i tre compartimenti. (M) Western blot dei livelli di proteine ​​Klf4 in queste popolazioni di cellule.

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Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Metodo criosezionamento per Microdissezione di Murine colon mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

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Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolare e Immunostaining linfociti e le cellule dendritiche da placche di Peyer murino di

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

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Immunologia e infezioni

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of experimental models needs to be as rigorous as that applied for human samples. Indeed, drawing reliable and accurate conclusions is critically influenced by the quality of tissue section preparation. Here, we describe a protocol for histopathological analysis of murine tissues that implements several automated steps during the procedure, from the initial preparation to the paraffin embedding of the murine samples. The reduction of methodological variables through rigorous protocol standardization from automated procedures contributes to increased overall reliability of murine pathological analysis. Specifically, this protocol describes the utilization of automated processing and embedding robotic systems, routinely used for the tissue processing and paraffin embedding of human samples, to process murine specimens of intestinal inflammation. We conclude that the reliability of histopathological examination of murine tissues is significantly increased upon introduction of standardized and automated techniques.

Lack of standardization for murine tissue processing reduces the quality of murine histopathological analysis as compared to human specimens. Here, we present a protocol to perform histopathological examination of murine inflamed and uninflamed colonic tissues to show the feasibility of robotic systems routinely used for processing and embedding&#160;human samples.

Utilizzo di sistemi robotici per elaborare e incorporare colici murini campioni per le analisi istologiche

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Ottimizzazione di Laser Capture Microdissection per l'isolamento dei gangli enterici dal tessuto umano fresco congelato

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Neuroscienze

Performing Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice and Evaluating Subsequent Tissue Changes

Understanding the tissue and cellular changes that occur in the acute injury response as well as during the wound healing process is of paramount importance when studying diseases of the gastrointestinal (GI) tract. The murine colonic pinch biopsy model is a useful tool to define these processes. Additionally, the interplay between gut luminal content (e.g., microbes) and the colon can be studied. However, wound induction and the ability to track wound closure over time in a reliable manner can be challenging. Moreover, tissue preparation and orientation must be carried out in a standardized way to optimally interrogate histologic and molecular changes. Here, we present a detailed method describing biopsy-induced injury and the monitoring of wound closure through repeat colonoscopies. An approach is described that ensures consistent and reproducible measurements of wound size, the ability to collect the wound bed for molecular analyses as well as visualize the wound bed upon sectioning of tissues. The ability to successfully carry out these techniques allows for studies of the acute injury response, wound healing and luminal-host interactions within the colon.

Here, we provide a detailed description of the procedure to induce colonoscopic-guided pinch biopsies in mice and track wound closure in real time. Additionally, methods for the preparation of tissues for histological, immunohistochemical and molecular analyses of the wound bed are provided.

Esecuzione di biopsie di avvicinamento delle dita guidate dal colonscopico nei topi e valutazione dei successivi cambiamenti tissutali

Understanding the tissue and cellular changes that occur in the acute injury response as well as during the wound healing process is of paramount ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Biologia

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Criosezionamento di regioni contigue di un muscolo scheletrico mouse unico per l&#39;espressione genica e analisi istologiche

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

A cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Snap Freezing of Muscle Tissue for Sectioning: A Protocol to Obtain Ultrathin Sections of Rapidly Frozen Murine Muscle Tissue

Source: Bonetto, A. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54893" target="_blank">The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video describes the procedure for snap freezing muscle tissue and obtaining its thin sections. The technique can help study cancer-related cachexia in colon cancer mouse models.

Congelamento rapido del tessuto muscolare per il sezionamento: un protocollo per ottenere sezioni ultrasottili di tessuto muscolare murino rapidamente congelato

Source: Bonetto, A. et al. The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia. J. Vis. Exp. (2016)
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Ricerca sul cancro

Gastrointestinal Cancer

Animal model studies

Intestinal Crypts Isolation: A Method to Isolate Whole Crypts from Small Intestine of Murine Model

Source: Schewe, M. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/56329" target="_blank">The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate a technique to isolate whole crypts from a mouse&#8217;s small intestine. The isolated whole crypts can be used to propagate long-lived and self-renewing 3D organoids in vitro.

Isolamento delle cripte intestinali: un metodo per isolare intere cripte dall'intestino tenue del modello murino

Source: Schewe, M. et al. The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells. J. Vis. Exp. (2017)
In ...

Frozen Mouse Brain Tissue Sectioning: A Procedure to Obtain Thin Frozen Tissue Sections from Frozen Murine Brain Tissue

Source: Comba, A. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60939/laser-capture-microdissection-glioma-subregions-for-spatial-molecular">Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion.</a> J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the sectioning of a frozen mouse brain tumor tissue using a cryostat. The frozen brain tissue sections so obtained are stored at low temperatures until further analysis.

Sezionamento del tessuto cerebrale del topo congelato: una procedura per ottenere sottili sezioni di tessuto congelato dal tessuto cerebrale murino congelato

Source: Comba, A. et al. Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, ...