Esta publicação foi apoiada pela Pesquisa Clínica e Translacional (SCTR) Institute Carolina do Sul, com uma casa acadêmico na Universidade de Medicina da Carolina do Sul, NIH / NCATS Grant Número UL1 TR000062. Um apoio adicional foi fornecida pela VA prémio de mérito BX002327-01 de DRM. DJH foi apoiado pelo NIH / NCATS Grant Número TL1 TR000061 e pelo NIH Grant Número T32 GM008716. SEA foi apoiado pelo NIH Grant Número T32 HL07260.

Todos os procedimentos listados aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional na Universidade de Medicina da Carolina do Sul. As experiências aqui descritas são, experiências agudas não-sobrevivência. Como tal, não há uso de pomada e uma suíte de cirurgia estéril não é necessária. A eutanásia por exsanguinação é conseguida durante a colheita do coração. 1. Experimental Preparação <ol><li> Configure ou uma pressão constante ou fluxo constante de perfusão Langendorff Aparelho 4. </li><li> Prepare a 4 L de Krebs Henseleit modificado (em mM: NaCl 112, KCl 5, MgSO4 1,2, 1 K 2 HPO 4, 1,25 de CaCl2, 25 de NaHCO3, 11 de D-glicose, 0,2 de ácido octanóico, pH = 7,4). <ol><li> Faça 10x buffers de ações. <ol><li> Dissolve-se NaCl, KCl, MgSO4, e K 2 HPO 4 em 3 L de água ultrapura. </li><li> Dissolver CaCl2 em 500 ml de água ultrapura with 40 ml de 1 N de HCl. </li><li> Adiciona-se lentamente solução de CaCl2 ao tampão feito em 1.2.1.1. Adiciona-se água ultra-pura o suficiente para o total de 4 L. Deixar a agitar durante 1 h antes de se filtrar através de um filtro de 0,8 um. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Dissolver NaHCO 3 em 4 L de água ultrapura. Deixar a agitar durante 1 h antes de se filtrar através de pelo filtro de 0,8 um. Armazenar a 4 ° C </li></ol></li><li> Combinar 400 mL de 10x tampão de Krebs Henseleit com 400 ml de 10x tampão de NaHCO3. Adicionar água ultrapura suficiente para totalizar 4 L. Dissolver glicose e ácido octanóico, sob agitação. Filtrar através de filtro de 0,8 um. </li></ol></li><li> Sistema de preparar-se para o coração. <ol><li> Adicionar 2 L de tampão de filtrado para um frasco de 4 L 38 colocado em cima da torneira de passagem ligado à cânula aórtica. Isto irá proporcionar uma pressão de perfusão de 70-80 mmHg para o coração, que é a pressão de perfusão recomendado 4. </li><li> Insira gás dispersão bubbler para o buffer na garrafa. </li><li> Execute o tampão através do sistema, tendo a certeza de eliminar quaisquer bolhas de dentro da tubulação. </li><li> Ligue gás (95% de O2 / 5% de CO 2), pelo menos, 30 min antes do coração está a ser colocado no sistema. Use uma sonda de fluxo de gás e analisador de gases de sangue para verificar a saturação de oxigênio. </li></ol></li><li> Preparar material cirúrgico e balão. <ol><li> Para a colheita de coração, prepare um par de tesouras cirúrgicas 6,75 &quot;, um par de 4.5&quot; tesouras, dois pares de hemostats, dois conjuntos de fórceps caramalt, duas seringas com agulhas de 27 G, 2 peças de 0-medidor fio de seda (cerca de 15 cm de comprimento), uma cânula farpado 1/16 polegadas, e uma cânula traqueal. </li><li> Para montar cânula traqueal, colar um pequeno pedaço de 1/16 de polegada de diâmetro tubo de plástico a um conector Y. </li><li> Para montar aparelhos balão: anexar uma agulha gavagem a uma peça de 1/16 de polegada tubulação, em seguida, anexar a tubulação para habitação transdutor de pressão. Uma pequena seringa ligada ao outro lado da pressão transducer habitação vai permitir que a inflação ea deflação do balão. <ol><li> Corte um quadrado de envoltório e local ponta de plástico de uma agulha gavage no centro. Envolva o envoltório de plástico em torno da agulha por sonda. </li><li> Encha o balão com soro fisiológico e amarrar com duas suturas. Inflar balão para garantir que não haja vazamentos. O volume de solução salina dentro do balão inflado deve ser de aproximadamente 200 ul, mas pode variar dependendo do tamanho do rato. </li><li> Como alternativa, use um berço dedo de látex no lugar do plástico. Coloque agulha gavage dentro dedo berço, encha com solução salina e amarrar. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Colheita do coração <ol><li> Contenha um rato Sprague Dawley utilizando um decapicone ou outro dispositivo de segurança manual. Pesar rato. </li><li> Administrar cetamina / mistura de xilazina (0,85 mg / kg de cetamina e 0,15 mg / kg de xilazina) através de injecção intraperitoneal para anestesiar ratos. Esta dose de anestésico irá fornecer suficientes para anestesia20-40 min, mas o procedimento deve ser concluído o mais rapidamente possível após a anestesia é confirmada. </li><li> Confirme grau adequado de anestesia pelo teste toe pitada reflexo. </li><li> Traqueotomia <ol><li> Retirar pele de meados de forepaw à base de mandíbula, utilizando hemostats para elevar pele e tesoura para fazer incisão. Manter a pele elevada para separá-lo do músculo subjacente, permitindo que um corte ao longo da pele e removê-lo. </li><li> Usando hemostats, levante o tecido glandular e fazer uma incisão horizontal na fáscia inferior ao tecido glandular. Use hemostats para espalhar incisão aberta, tomando cuidado para não nick as veias jugulares. </li><li> Usando pinças hemostáticas, músculo sobrejacente pitada traqueia, e usando uma tesoura fazer uma incisão transversal no músculo logo abaixo da ponta das pinças hemostáticas. Usando pinças hemostáticas, espalhar tecido para além de revelar traqueia. </li><li> Insira com cuidado hemostats sob traquéia, limpando fáscia enquanto progredindo suavemente avançar e recuar hemostats. </li><li>Uma vez hemostats são colocados com sucesso por trás da traquéia, beliscar 0-0 sutura de seda com hemostats e hemisect a traqueia com um pequeno par, de tesoura afiada. </li><li> Insira cânula traqueal na traquéia hemisected, puxe sutura por trás da traquéia, e amarrar a sutura ao redor da traqueia canulada, ancorando a sutura com o Y-virilha da cânula com um nó cirurgiões. </li><li> Usando uma agulha de 27 G, injectar 1.000 U / kg de heparina na veia jugular e permitir a circular durante 30 seg. </li></ol></li><li> Toracotomia <ol><li> Retirar pele de meados de abdômen para região mid-pata dianteira por compressão com hemostats e corte com tesoura. </li><li> Adicione uma incisão transversal ¾ de polegada na parede muscular abdominal, imediatamente abaixo do diafragma. </li><li> Faça uma incisão vertical até a parede a parede abdominal e torácica, cortando ao longo do esterno. </li><li> Corte o diafragma volta bilateralmente, em seguida, espalhar caixa torácica para revelar coração, ribcage braçadeira com hemostats para garantir que ele permanece spread. </li&gt; <li> Usando hemostats, remova gentilmente timo, expondo a aorta ascendente. </li><li> Tease hemostats através de loop aórtica, avançar e recuar hemostats e gentilmente espalhando fascia para permitir ponta de hemostats completamente. </li><li> Use hemostats para puxar 0-0 sutura de seda por trás da aorta ascendente, amarre sutura em um meio-quadrado nó frouxo. </li><li> Virar a torneira para iniciar o fluxo de tampão de perfusão, hemisect aorta e imediatamente inserir uma cânula para lúmen da aorta. Rapidamente apertar um nó meia-quadrado e completar o nó, apertando bem. </li><li> Use a tesoura para dissecar coração longe dos grandes vasos, remova coração do peito e fixe a coluna de perfusão. </li><li> Corte o excesso de tecido pulmonar e permitir que o coração se equilibrar em coluna por cerca de 15 min antes da inserção de balão. Usar uma taxa de fluxo normal do tampão por meio de coração de 10-20 ml / min. </li></ol></li></ol> 3. Langendorff de perfusão e isquemia-reperfusão Lesão <ol><li> Colocação de pré LVssure balão <ol><li> Desinflar o balão ao rolar em forma de cone e vire torneira para garantir balão continua a ser esvaziado. </li><li> Excise átrio esquerdo com um pequeno par de tesouras para expor o acesso à válvula mitral. </li><li> Insira balão através do átrio esquerdo e da válvula mitral em ventrículo esquerdo. </li><li> Inicie o software de monitoramento de pressão (LabChart Pro). </li><li> Encher o balão através da abertura de válvula e suavemente o aumento da quantidade de solução salina em balão até que a pressão diastólica leitura de micromanómetro excede zero. </li><li> Para verificar a resposta comprimento-tensão, inflar o balão lentamente a uma pressão diastólica de 75 mmHg, desinflar lentamente, repetir uma vez. </li><li> Regule a pressão diastólica de 10 mm Hg através da modulação da quantidade de solução salina no balão. Vire torneira para selar balão a este nível de inflação, e manter sistema de pressão fechado entre balão LV e transdutor de pressão. </li><li> Lower coração em câmara câmara ea tampa aquecida com plástico. </li></ol></li><li> De Anúnciosministração de isquemia-reperfusão Lesão <ol><li> Ligue o fundo da câmara de aquecimento e câmara de permitir a encher-se com tampão de Effused. </li><li> Quando o buffer tenha submergido coração, virar a torneira para parar o fluxo de tampão para o coração, induzindo isquemia global. Tempo de isquemia pode variar de acordo com os objetivos do experimento. </li><li> Após 30 min de isquemia, virar a torneira para restaurar o fluxo de tampão para o coração, o início da reperfusão. </li><li> Permitir reperfusão do coração durante 1 hora antes de terminar o experimento. Use tempos de reperfusão variáveis, dependendo dos objetivos do experimento. </li></ol></li><li> Rescisão de Experiência e de colheita de Tissue <ol><li> Usando a porta lateral de torneira, administrar 10 ml de solução salina tamponada com fosfato a 4 ° C para o coração a uma taxa de 10 ml / min para parar o coração. </li><li> Remover coração da coluna perfusão, aparar restante tecido atrial. </li><li> Coloque coração em uma matriz de tecido corte de aço inoxidável, cubra com Parafilm, e colocar a -80 ° C durante 8 minutos, ou até que o coração tem uma consistência como marshmallows. </li><li> Remova o bloco do freezer e coloque razorblades em cortar matriz de cortar o coração em fatias de 2 mm. Blocos de tecido também pode ser comprado com outros que 2 mm tamanhos fatia. </li><li> Remover fatias um de cada vez e soltar em nitrogênio líquido a piscar congelar por estudos bioquímicos. Reter a fatia ventricular terceira a partir do ápice para a coloração do enfarte. </li><li> Remover o tecido a partir de azoto líquido e armazenar a -80 ° C até à utilização em experiências bioquímicas. </li></ol></li><li> Enfarte Coloração <ol><li> Incubar a terceira fatia ventricular em 10 mL de 1% w / v de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) a 37 ° C durante 15 min. Nota: A incubação no TTC pode ser realizada durante 15 ou 30 min, sem qualquer alteração na eficácia 15. </li><li> Transferir fatia de tecido de TTC a 10% de formalina tamponada e deixa-se incubar à temperatura ambiente durante a noite. Para melhores resultados, ouvirts deve ser retirado de formalina e fotografada dentro de 24 horas 4. </li><li> Fotografia manchado fatia e uso de software como o ImageJ para estimar o tamanho do infarto de acordo com o protocolo do fabricante. Tirar fotografias, logo que possível após a sua fixação, como o corante vai desaparecer com o tempo. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

O coração perfundido isolado de rato pode ser utilizado com êxito para estudar o efeito da intervenção farmacológica no pré-condicionamento cardíaco em lesão de reperfusão de isquemia 9. No entanto, existem alguns passos essenciais para o procedimento que deve ser normalizados, a fim de assegurar a reprodutibilidade dos resultados. A manutenção de uma temperatura de 37,4 ° C no interior do sistema é crítica, já que mesmo a hipotermia e hipertermia pode causar pré-condicionamento cardíaco 10,11. O tempo total decorrido desde a injecção de anestésico para a excisão do coração deve ser mantido a um mínimo, como a exposição prolongada a cetamina pode interferir com o pré-condicionamento cardíaco 12. Canulação atempada da aorta in situ é essencial para prevenir o desenvolvimento de hipoxia no interior do coração ou a exsanguinação do animal antes da excisão do coração. Em geral, o tempo da primeira incisão para remoção do coração não deverá exceder 6-8 min ser. Os ba do ventrículo esquerdolloon deve ser verificado se há vazamentos antes de cada experimento, e substituído, se necessário. O sistema tem de ser cuidadosamente mantido, incluindo rubor todo o aparelho com água destilada e depois de cada corrida substituindo tubagem desgastada como necessário para evitar fugas ou a contaminação do interior do tubo. O coração isolado pode ser modificada para qualquer número de novas utilizações, incluindo imagens de fluorescência 13, espectroscopia de RMN de 7, e mapeamento óptico 14, entre muitos outros. O sistema também pode ser modificada para perfundir corações de diferentes animais, incluindo ratinhos. Esta modificação é particularmente útil pois permite experiências utilizando ratinhos transgénicos. Para modificar o sistema para corações de rato, menor cânulas de perfusão e uma coluna mais pequena deve ser utilizado, para além de outras modificações. Descrições detalhadas de como utilizar o método de Langendorff para corações do rato têm sido publicados em outros lugares 16,17. Outras modificaçõeseste protocolo inclui a administração de vários medicamentos a diferentes pontos de tempo. Ao investigar a capacidade de um fármaco para provocar o pré-condicionamento farmacológico ou pós-condicionado, é essencial para administrar o fármaco a diferentes pontos de tempo em relação à lesão por isquemia-reperfusão. O fármaco pode ser administrado ao animal antes do coração é excisado, ou misturado com o tampão quer antes do coração é colocado na coluna ou durante a fase de isquemia, de modo que o fármaco está presente após a reperfusão. Alternativamente, um porta-lado pode ser utilizado para administrar um bólus de droga em qualquer ponto de tempo durante o protocolo. Adicionalmente, o protocolo pode ser modificado para alterar a duração da isquemia, reperfusão, ou ambos. Isto permite que a análise dos dados funcionais e bioquímicos em vários pontos de tempo e pode ser usado para controlar o decurso de tempo do efeito agudo de uma droga. Se o período de reperfusão é alterada, é importante observar que, pelo menos, 60 minutos de reperfusão são necessary para a coloração de TTC eficazmente para delinear a área do enfarte 15. A principal limitação do modelo de coração isolado em termos de lesão por isquemia-reperfusão, é que não tem em conta muitos dos factores sistémicos que estão presentes no ambiente de isquemia-reperfusão in vivo. Esta eliminação da influência sistêmica devem ser contabilizados na análise de dados gerados usando o modelo de Langendorff, mas não exclui a capacidade do modelo para responder a novas perguntas sobre a resposta de miócitos, fibroblastos e células endoteliais à isquemia e reperfusão subsequente. O modelo de coração isolado permite a manipulação completa de muitas das variáveis ​​que afectam a lesão de reperfusão de isquemia, em complemento da análise dos efeitos funcionais do coração ao longo de intervalos de tempo curtos tempo real. Os dados gerados usando o sistema de coração isolado é de valor inestimável para a compreensão da pré-condicionamento farmacológico ou pós-condicionamento docoração, em resposta a várias intervenções farmacêuticas.

A elucidação dos eventos subjacentes à resposta cardíaca tanto para isquemia e reperfusão são essencial para melhorar o tratamento de enfarte 1 e procedimentos cirúrgicos cardíacos do miocárdio que necessitam pinçamento aórtico 2. Embora os modelos in vivo de lesão de reperfusão de isquemia permitir análise de ponto final muito úteis, eles não são tão eficazes para estudar os efeitos funcionais da isquemia lesão de reperfusão aguda em tempo real. Além disso, em modelos de isquemia reperfusão in vivo geralmente produzem uma variabilidade significativa da dimensão do enfarte e a entrega directa de drogas para o coração no momento da reperfusão é um desafio. A utilização de um sistema de coração de Langendorff isolado para estudar a lesão por isquemia reperfusão permite a avaliação funcional em tempo real dos tratamentos farmacológicos, área uniforme do tecido enfartado e entrega instantânea de fármaco directamente ao miocárdio. Descrita pela primeira vez by Oscar Langendorff em 1895 3, o coração de Langendorff isolado é um modelo robusto para o estudo da lesão de reperfusão de isquemia, tendo sido utilizado na pesquisa de isquemia reperfusão durante os últimos 40 anos 4,5. Aqui, algumas modificações são feitas para aperfeiçoar o coração isolado para análise funcional. Em situ canulação da aorta, enquanto o coração está a bater garante que o coração não experimentar o pré-condicionamento isquémico, que iria alterar os resultados dos ensaios isquemia reperfusão 6. Para facilitar isto, uma traqueotomia é efectuada, permitindo a ventilação e garantir a estabilidade fisiológica do rato durante a cirurgia. O coração é depois ligado a uma coluna em espiral com camisa de água de vidro através da qual tampão de Krebs Henseleit é entregue através de perfusão retrógrada directamente para a aorta. Um balão cheio de soro fisiológico é inserido no ventrículo esquerdo e ligado a um transdutor de pressão, que permite a medição das pressões em tempo real a partir do um ventrículod cálculo de vários parâmetros funcionais. Na conclusão do experimento, o coração é lavada com solução salina fria para prender contração e flash congelado em nitrogênio líquido para permitir a análise a jusante dos níveis de DNA, RNA e proteínas. Assim modificado, o coração de Langendorff perfundido serve como um sistema eficaz para a monitorização directa do efeito fisiológico de intervenções farmacológicas, em qualquer momento de forma aguda durante a lesão por isquemia-reperfusão.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203726</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Octanoic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2875</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Medical Pressure Transducer</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Peristaltic Pump</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07521-40</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Easy Load Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Heated circulating water bath</td><td>Lauda</td><td>M3</td><td></td></tr><tr><td>Tubing Flow Module</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Modular Research Console</td><td>Transonic</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Inline flow sensor</td><td>Transonic</td><td>ME2PXN</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab Data Acquisition Device</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>LabChart data acquisition software</td><td>AD Instruments</td><td>MLU60/8</td><td></td></tr></tbody></table>

induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff-perfused rat hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

O aparelho de balão do ventrículo esquerdo permite a monitorização em tempo real da pressão desenvolvida pela entidade ventrículo esquerdo (Figura 1). Como descrito anteriormente 7, este traçado da pressão pode ser usado para calcular muitos dos parâmetros da função ventricular. Estes cálculos podem ser realizados na fase de linha de base, bem como a fase de reperfusão, em média, em traços múltiplos dentro de cada grupo, e comparadas a fim de determinar se a intervenção farmacológica resultou no pré-condicionamento cardíaco, como fizemos previamente 9. Um tal parâmetro é a pressão desenvolvida, calculado como a diferença entre a pressão sistólica e a pressão diastólica final. A pressão desenvolvida nos corações perfundidos em ratos normais podem variar 70-130 mmHg (Figura 1A). Após um insulto isquémico, a pressão desenvolvida é reduzido e as eleva a pressão diastólica final (Figura 1B). Quando os ratos sãoadministrado um agente de pré-condicionamento conhecido como a classe I e IIb inibidor HDAC SAHA (vorinostat) 18 antes da excisão do coração, a redução da pressão desenvolvida e a elevação da pressão diastólica final associada com lesão por isquemia-reperfusão são atenuadas (Figura 1C). Outras medidas da função ventricular esquerda, tal como a taxa de geração de pressão (dP / dt max), a taxa de relaxamento da pressão (-dP / dt max), e a taxa de pressão do produto (PPR) pode ser obtido directamente ou calculada a partir da saída do software (Figura 2). A fase isquêmica também podem ser monitorados em tempo real, com a cessação aparente de geração de pressão a poucos minutos do início da isquemia. Contracção isquémica também podem ser monitorizada medindo o tempo até ao início da contracção e o tempo para o pico de contração. Cloreto Trifeniltetrazólio (TTC) é comumente usado para diferenciar entre um metabolicamentective e tecido inactiva, e é utilizado aqui para a coloração do enfarte. Uma vez absorvido pelo tecido TTC é reduzida por enzimas metabólicas, tornando o tecido vermelho activo. Inactiva tecido não reduz TTC, e como tal irá manchar branco 8. Langendorff perfundido corações de ratos que não tenham sido submetidos a lesões isquémicas não mostram quaisquer áreas em branco (não mostrados), enquanto os corações sujeitos a isquemia reperfusão mostram áreas substanciais coradas branco, indicando tecido enfartado (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52908/52908fig1.jpg" /> Figura 1: traços de pressão representativos do ventrículo esquerdo balão de pressão registrada pelo balão LV sobre a contração ventricular.. Corações não submetidos à isquemia (A) experimentam uma menor perda de capacidade contrátil ao longo do tempo. Corações submetidos à isquemia (B) mostram immedperda iate de geração de pressão, seguido de contração tônica. Após reperfusão, estes corações experimentar EDP elevada e diminuição da pressão desenvolvida. Corações pré-condicionadas com SAHA e submetidos a isquemia (C) mostram a atenuação da lesão por isquemia-reperfusão. N = 1 por grupo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52908/52908fig2.jpg" /> Figura 2: Calculado parâmetros de função ventricular taxa de geração de pressão (A), a taxa de relaxamento de pressão (B), pressão desenvolvida (C), e do produto frequência pressão (D) são alguns parâmetros da função ventricular que podem ser calculados a partir da. software de monitoramento de pressão. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52908/52908fig3.jpg" /> Figura 3: coloração TTC para a área do enfarte. </strong&gt; Exemplo de seção transversal ventricular após a lesão por isquemia-reperfusão. Linha pontilhada delineia ventrículo esquerdo (VE) de ventrículo direito (VD). Enfarte focal é indicado pela área branca, enquanto que o tecido viável é indicado pela mancha vermelha.

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Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Indução e Avaliação de isquemia-reperfusão em Langendorff-perfundidos Rato Corações

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Medicine

22.8K visualizações.  Medical University of South Carolina. The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

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Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Infarto Agudo do Miocárdio em Ratos

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Medicina

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biologia

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via recanalization of the coronary artery is the most effective strategy for reducing the size of ischemic myocardium. The coronary microvasculature cannot be visualized and imaged&#160;in vivo, but there are several invasive and noninvasive techniques that can be used to assess parameters which depend directly on coronary microvascular function. The endothelial function after ischemia reperfusion can be assessed also at the level of the coronary circulation via the coronary flow reserve (CFR).&#160;In this study, peak velocity of left anterior descending (LAD) coronary arteries was measured in rats in vivo via Transthoracic Doppler Echocardiography during resting and stress challenge (induced by Dobutamine). A normal heart can increase its coronary blood flow up to four times above the resting values during stress induction. Following ischemia reperfusion, we found a significantly diminished CFR, which can be used as a marker of coronary microvascular dysfunction. CFR has opened a window on the importance of microvascular dysfunction and has been shown to predict cardiovascular risk independent of whether the severe obstructive disease is present.

Coronary flow reserve (CFR), is defined as the ratio of maximal coronary blood flow to the resting coronary blood flow. We present a protocol for evaluating CFR in rats via ultrasound, which offers the opportunity to predict cardiovascular risk factors in the absence of obstructive coronary disease.

Avaliação da reserva de fluxo coronariano após reperfusão de isquemia miocárdica em ratos

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

Aprimorando a pesquisa de DCV com perfusão de Langendorff modificada

Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts

Despite important advancements in the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases (CVDs), the field is in urgent need of increased research and scientific advancement. As a result, innovation, improvement and/or repurposing of the available research toolset can provide improved testbeds for research advancement. Langendorff perfusion is an extremely valuable research technique for the field of CVD research that can be modified to accommodate a wide array of experimental needs. This tailoring can be achieved by personalizing a large number of perfusion parameters, including perfusion pressure, flow, perfusate, temperature, etc. This protocol demonstrates the versatility of Langendorff perfusion and the feasibility of achieving longer perfusion times (4 h) without graft function loss by utilizing lower perfusion pressures (30-35 mmHg). Achieving extended perfusion times without graft damage and/or function loss caused by the technique itself has the potential to eliminate confounding elements from experimental results. In effect, in scientific circumstances where longer perfusion times are relevant to the experimental needs (i.e., drug treatments, immunological response analysis, gene editing, graft preservation, etc.), lower perfusion pressures can be key for scientific success.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa cardiovascular - técnicas de perfusão de Langendorff adaptadas para melhores resultados experimentais

This article demonstrates the feasibility of achieving longer perfusion times (4 h) of murine cardiac grafts without function loss by employing lower (30-35 mmHg) than physiological (60-80 mmHg) perfusion pressures during Langendorff.

Perfusão de Langendorff modificada para tempos de perfusão prolongados de enxertos cardíacos de roedores

Despite important advancements in the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases (CVDs), the field is in urgent need of increased research and ...

Bioengenharia

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, including ischemia-reperfusion injury (IRI) of extrahepatic organs. This model requires numerous experiments and devices. The duration of anhepatic phase is closely related to the time to develop IRI after transplantation. In this experiment, we used hemodynamic changes to induce extrahepatic organ damage in rats and determined the maximum tolerance time. The time until the most severe organ injury varied for different organs. This method can easily be replicated and can also be used to study IRI of the extrahepatic organs after liver transplantation.

This paper provides a detailed description of how to build an animal model of the anhepatic phase (liver ischemia) in rats to facilitate basic research into ischemia-reperfusion injury after liver transplantation.

Lesão por Isquemia-Reperfusão de Órgãos simulando alterações hemodinâmicas no modelo de transplante de fígado de rato

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of heart reflow and induce secondary myocardial injury. A simple and reproducible model of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury is a good tool for researchers. Here, a customizable method to create a myocardial infarction (MI) model and MIRI by precision ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD) through micromanipulation is described. Accurate and reproducible ligature positioning of the LAD helps obtain consistent results for heart injury. ST-segment changes can help to identify model accuracy. The serum level of cardiac troponin T (cTnT) is used to assess the myocardial injury, cardiac ultrasound is employed to evaluate the myocardial systolic function, and Evans-Blue/triphenyl tetrazolium chloride staining is used to measure infarct size. In general, this protocol reduces procedure duration, ensures controllable infarct size, and improves mouse survival.

Here we describe a simple and reproducible method that can induce myocardial infarction or myocardial ischemia-reperfusion injury in mice by precision ligation of the left anterior descending coronary artery through micromanipulation.

Indução de Infarto do Miocárdio e Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica em Camundongos

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Improved Rodent Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury

Myocardial ischemia and reperfusion injury (MIRI), induced by coronary heart disease (CHD), causes damage to the cardiomyocytes. Furthermore, evidence suggests that thrombolytic therapy or primary percutaneous coronary intervention (PPCI) does not prevent reperfusion injury. There is still no ideal animal model for MIRI. This study aims to improve the MIRI model in rats to make surgery easier and more feasible. A unique method for establishing MIRI is developed by using a soft tube during a key step of the ischemic period. To explore this method, thirty rats were randomly divided into three groups: sham group (n = 10); experimental model group (n = 10); and existing model group (n = 10). Findings of triphenyltetrazolium chloride staining, electrocardiography, and percent survival are compared to determine the accuracies and survival rates of the operations. Based on the study results, it has been concluded that the improved surgery method is associated with a higher survival rate, elevated ST-T segment, and larger infarct size, which is expected to mimic the pathology of MIRI better.

Myocardial ischemia-reperfusion model of rat heart is improved by using a self-made retractor, polyvinyl chloride tube, and a unique knotting method. Electrocardiogram, triphenyltetrazolium chloride and histological staining, and percent survival analysis results showed that the improved model group has higher success and survival rates than the already existing model group.

Modelo de roedor melhorado de Isquemia do Miocárdio e Lesão de Reperfusão

Myocardial ischemia and reperfusion injury (MIRI), induced by coronary heart disease (CHD), causes damage to the cardiomyocytes. Furthermore, evidence ...

Indução e Avaliação de isquemia-reperfusão em Langendorff-perfundidos Rato Corações

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Infarto Agudo do Miocárdio em Ratos

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Avaliação da reserva de fluxo coronariano após reperfusão de isquemia miocárdica em ratos

Perfusão de Langendorff modificada para tempos de perfusão prolongados de enxertos cardíacos de roedores

Perfusão de Langendorff modificada para tempos de perfusão prolongados de enxertos cardíacos de roedores

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Lesão por Isquemia-Reperfusão de Órgãos simulando alterações hemodinâmicas no modelo de transplante de fígado de rato

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Indução de Infarto do Miocárdio e Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica em Camundongos

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